Isolamento de um extrato do microrganismo simbiótico de coral mole Salinispora Arenicola exercendo efeitos citoprotetores e antienvelhecimento Parte 2

3.3. Tratamento de Moscas com Extrato SA223-S2BM Induz Atividade de Módulos Proteostáticos Celulares

Considerando a bioatividade observada do extrato SA223-S2BM em ensaios baseados em células, procuramos examinar seus efeitos in vivo na atividade de módulos proteostáticos no organismo modelo D. melanogaster e especificamente em moscas Drosophila w1118. w1118 é uma cepa transgênica de Drosophila portadora de uma mutação nula no gene branco, um gene essencial para a via de pigmentação do olho, e é freqüentemente usado como o controle apropriado porque carrega fundo isogênico para transformações genéticas convenientes. Descobrimos que o extrato não afetou o tempo de vida máximo ou o tempo de saúde das moscas na concentração de 1 µg/mL, enquanto diminuiu marginalmente o tempo de vida médio das moscas na concentração de 10 µg/mL (Figura 4A1, A2).

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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No entanto, e por nossos achados em linhagens de células humanas, a administração do extrato em jovens moscas Drosophila w1118 aumentou as atividades enzimáticas do proteassoma quimotripsina-símile (Figura 4B), bem como das catepsinas lisossômicas (Figura 4C). Além disso, conforme mostrado na Figura 4D, o extrato tendeu a diminuir os níveis de ROS nos tecidos das moscas.

3.4. O extrato SA223-S2BM exibe propriedades antimelanogênicas e antielastase

Tirosinase e elastase são enzimas chave envolvidas no envelhecimento da pele e seus inibidores são de grande importância na indústria cosmecêutica. Assim, examinamos se o extrato SA223-S2BM afeta a atividade dessas enzimas por meio de ensaios espectrofotométricos in vitro. Curiosamente, descobrimos que o extrato exerceu propriedades anti-melanogênicas significativas, pois mostrou uma capacidade inibitória da tirosinase dependente da dose, semelhante ao ácido kójico, um inibidor de tirosinase disponível comercialmente (Figura 5A). Observamos também que o extrato apresentou atividade antielastase, em comparação com o conhecido inibidor de elastase, a melastatina (produzida por actinomicetos) (Figura 5B).

3.5. Incubação de Células Humanas com o Extrato SA223-S2BM Ativa Respostas Antioxidantes e Protege as Células do Estresse Oxidativo e Genotóxico

Em seguida, investigamos o efeito do extrato SA223-S2BM em módulos antioxidantes celulares. Observamos que a incubação de curto prazo (24h) de células BJ e HaCaT com o extrato resultou na regulação positiva de alvos transcricionais NRF2, denominados genes NQO1 e TXNRD1, respectivamente (na concentração de 10 µg/mL) (Figura 6A). Além disso, observamos por análises de immunoblotting um aumento nos níveis de expressão da proteína NQO1 em células BJ de forma dose-dependente e células HaCaT na concentração de 10 µg/mL, após exposição ao extrato por 24 h (Figura 6B).

Além disso, procuramos examinar se o extrato afeta os níveis de EROs celulares. As células foram tratadas com o extrato por 24 h e os níveis intracelulares de ROS foram avaliados por fluorometria. Conforme mostrado nas Figuras 6C1 e C2, o extrato diminuiu significativamente os níveis de ROS tanto em fibroblastos BJ quanto em queratinócitos HaCaT.

Posteriormente, investigamos se o extrato SA223-S2BM poderia ter um papel citoprotetor contra a toxicidade mediada pelo estresse oxidativo. Assim, fibroblastos BJ e queratinócitos HaCaT foram co-incubados com diferentes concentrações do extrato e do agente oxidativo H2O2, e as taxas de viabilidade foram medidas após 24 ou 48 h de incubação. O H2O2 é bem conhecido por seus efeitos citotóxicos [51] e, portanto, foi usado como controle positivo. Após 24 h de incubação das células BJ, observamos que o extrato (na concentração de 1 µg/mL) tendeu a proteger as células da toxicidade causada pelo H2O2 (100 µM); um achado semelhante foi observado após o co-tratamento das células com 200 µM H2O2 e o extrato (1 e 5 µg/mL) (Figura 7A). Em apoio, descobrimos que o extrato resgatou amplamente as células HaCaT da toxicidade mediada pelo estresse oxidativo, causada por ambas as concentrações estudadas de H2O2 (100 e 200 µM), após 24 h (Figura 7B1) e 48 h de incubação (Figura 7B2) .

Além disso, observamos que o tratamento de queratinócitos HaCaT com o extrato por 24 h na concentração de 10 µg/mL resultou em diminuição dos níveis de expressão da proteína 53BP1, bem como níveis de fosforilação de p53 em Ser15 de maneira dose-dependente (Figura 7C1); ambas as proteínas são marcadores de dano ao DNA e estresse genotóxico [52,53]. O efeito protetor do extrato contra o estresse genotóxico também foi confirmado por análises de immunoblotting após a incubação de células HaCaT com o quimioterápico doxorrubicina (DXR). Especificamente, observamos que a co-incubação de células HaCaT com o extrato SA223-S2BM e 2 µM de DXR resultou na supressão dos níveis de fosforilação aumentados de H2A.X induzidos por DXR de maneira dependente da dose (Figura 7C2).

4. Discussão

O envelhecimento é um processo associado ao acúmulo de danos e perda de funcionalidade que ocorrem em nível molecular, celular, tecidual e do organismo, o que se relaciona com o aumento da vulnerabilidade à doença e à morte [14]. A senescência celular é um estado de parada permanente e irreversível do ciclo celular em resposta a diferentes estímulos prejudiciais e, entre outros, é caracterizada por características secretoras únicas, dano macromolecular e metabolismo alterado [54,55]. As células senescentes acumulam-se com a idade, contribuindo para o desenvolvimento de patologias relacionadas com a idade [56,57].

Está bem estabelecido que a ativação dos componentes da NP pode desacelerar a taxa de progressão do envelhecimento, indicando que esses módulos podem ser potenciais alvos terapêuticos contra o envelhecimento e patologias relacionadas à idade [58,59]. No estudo atual, examinamos modelos baseados em células e in vivo do efeito do extrato SA223-S2BM em módulos de proteostase e respostas antioxidantes (consulte Resumo gráfico). Este extrato foi isolado de um microrganismo simbiótico de coral mole, chamado S. arenicola, que é um actinomiceto marinho obrigatório pertencente à família Micromonosporaceae [60]. Descobrimos que o extrato SA223-S2BM ativa módulos proteostáticos tanto em células humanas quanto em moscas de Drosophila.

Além disso, o extrato de SA223-S2BM induziu a expressão de módulos antioxidantes, reduziu a carga oxidativa intracelular em fibroblastos da pele e queratinócitos imortalizados e conferiu proteção contra o estresse oxidativo e genotóxico. A senescência celular e o envelhecimento in vivo são caracterizados pelo aumento do estresse oxidativo, aumento da instabilidade genômica e do proteoma, bem como pela redução da atividade dos mecanismos de reparo celular e das vias proteolíticas [14]. Portanto, este extrato pode ser utilizado como fonte para a identificação de moléculas com potenciais propriedades citoprotetoras e/ou antienvelhecimento.

Vários estudos mostraram que tanto o tempo de vida quanto a saúde podem ser melhorados e estendidos, respectivamente, por meio de intervenções genéticas, nutricionais e/ou farmacológicas [1]. De fato, a restrição calórica eleva a resistência ao estresse oxidativo, reduz o dano macromolecular e aumenta a expectativa de vida em vários organismos modelo [61]. No entanto, como intervenções genéticas ou restrição calórica não podem ser aplicadas em humanos, muitos estudos têm sido dedicados à identificação de NPs (extratos ou compostos isolados) que podem potencialmente aumentar a saúde e/ou o tempo de vida. Em apoio, uma variedade de NPs, que foram isoladas de várias fontes, como plantas, organismos marinhos e microorganismos, têm demonstrado exercer efeitos antienvelhecimento in vitro e in vivo [1,62].

Até o momento, muitos NPs marinhos demonstraram exercer uma ampla gama de bioatividades, como antitumoral, antiproliferativa, fotoprotetora ou antibiótica. Portanto, nos últimos anos, a descoberta de drogas a partir de NPs marinhas ganhou terreno [63]. De fato, vários medicamentos derivados do mar já chegaram ao mercado ou estão em ensaios clínicos [31]. Muito poucos NPs marinhos foram estudados por seu potencial para modular os principais componentes da rede PN, e alguns foram encontrados para ativar diretamente o UPP e exercer propriedades antienvelhecimento. Por exemplo, a astaxantina é um carotenóide xantofila presente em organismos marinhos, como macroalgas, microalgas e crustáceos, e é conhecida por sua atividade antioxidante in vitro e in vivo, ao mesmo tempo em que demonstrou exercer propriedades antienvelhecimento, pois estendeu tempo de vida em C. elegans e D. melanogaster [64].

A tirosinase e a elastase são duas enzimas chave envolvidas na deterioração da pele e, portanto, a inibição de sua atividade é um método protetor promissor contra o envelhecimento da pele [65]. Vários NPs derivados de plantas, por exemplo, curcumina, já foram estudados e mostraram ser inibidores eficazes da atividade dessas enzimas [66]. Aqui, verificamos que o extrato SA223-S2BM inibiu eficientemente a atividade das enzimas tirosinase e elastase. Portanto, este extrato pode ser utilizado para isolamento de produtos cosmecêuticos; em apoio, um grande número de moléculas de origem marinha já é utilizado na indústria de cosmecêuticos devido à sua atividade contra tirosinase e elastase [67,68].

Como o número de NPs disponíveis exercendo atividade antienvelhecimento é bastante baixo [1], ecossistemas menos explorados, como o ecossistema marinho, precisam ser mais investigados. O ambiente marinho representa um recurso único que encerra uma enorme diversidade biológica [30]. Suas duras condições químicas e físicas são fatores importantes para produzir uma ampla gama de NPs bioativos com características estruturalmente únicas, que servem como modelos promissores para inspirar o desenvolvimento de medicamentos contra várias doenças [31,32]. Isso fica evidente em nossa recente análise metagenômica, na qual a diversidade microbiana da esponja marinha Scopalina hapalia foi investigada e os resultados destacaram o potencial desses microrganismos em produzir compostos bioativos contra alvos moleculares relacionados à idade e, portanto, possuindo propriedades antienvelhecimento [36]. No entanto, a descoberta de drogas marinhas deve lidar com alguns grandes desafios, como determinação de estrutura e problemas de abastecimento [31].

O aumento do potencial dos ecossistemas marinhos para fornecer NPs bioativos também é confirmado por isolamentos anteriores de produtos bioativos de S. arenicola. O mais interessante deles é a Salinosporamida A (Marizomib), um potente inibidor de proteassoma, que entrou na fase I de ensaios clínicos para o tratamento de mieloma múltiplo apenas três anos após sua descoberta [31,69,70]. Além disso, o antibiótico Arenimycin, que induz citotoxicidade em células de adenocarcinoma humano [71], bem como saliniketal A e saliniketal B, que inibem a ornitina descarboxilase, um alvo anti-câncer [72], também foram isolados de S. arenicola.

5. Conclusões

Apesar dessas descobertas encorajadoras, as moléculas bioativas do extrato SA223-S2BM permanecem desconhecidas e, portanto, mais investigações são necessárias. Estudos futuros revelarão a composição química deste extrato e os compostos bioativos responsáveis ​​pelas propriedades do extrato, mostrados neste estudo. Portanto, sugerimos o extrato SA223-S2BM, (obtido de um actinomiceto do ecossistema de corais mesofóticos marinhos), como um provável ativador eficaz de mecanismos citoprotetores que promovem o envelhecimento saudável.

Materiais suplementares: As seguintes informações de apoio podem ser baixadas no site, Figura S1: Avaliação in vitro da atividade de inibição da tirosinase e elastase. (A) ( por cento ) Atividade de inibição da tirosinase pelo extrato SA223-S2BAE na concentração de 150 µg/mL. (B) ( por cento ) Atividade de inibição da elastase pelo extrato SA223-S2LAE na concentração de 100 µg/mL. Em (A), o ácido kójico (2 µg/mL) foi usado como controle positivo. Em (B), a melastatina (0,5 µg/mL) foi usada como controle positivo. Barras, ± SD (n Maior ou igual a 2); *, p < 0,05. Figura S2: Full blots e análise quantitativa dos níveis de expressão de proteínas (imunoblots mostrados na Figura 2). Figura S3: Full blots e análise quantitativa dos níveis de expressão de proteínas (imunoblots mostrados na Figura 3). Figura S4: Full blots e análise quantitativa dos níveis de expressão de proteínas (imunoblots mostrados na Figura 3). Figura S5: Full blots e análise quantitativa dos níveis de expressão de proteínas (imunoblots mostrados na Figura 6). Figura S6: Full blots e análise quantitativa dos níveis de expressão de proteínas (imunoblots mostrados na Figura 7). Tabela S1: Resumo dos experimentos de vida útil. Tabela S2: Nomes completos dos genes analisados.

Contribuições do autor:IPT concepção, desenho e supervisão do estudo; XPL, ADS, E.-DP e MSM realizaram ensaios de células e Drosophila e interpretaram os dados; GLG, PL, YB e JO realizaram coleta de corais, análise filogenética, isolamento/identificação de cepas e produção de extratos; XPL, ADS, E.-DP, MSM e IPT redigiram e editaram o manuscrito. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento: Este trabalho foi parcialmente financiado pela bolsa da UE TASCMAR (EU-H2020/634674).

Declaração do Conselho de Revisão Institucional:Não aplicável.

Declaração de Consentimento Informado:Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados:Os dados estão disponíveis no Autor correspondente mediante solicitação razoável.

Agradecimentos: Agradecemos a todos os participantes do TASCMAR pela excelente colaboração. Agradecemos também ao Instituto Interuniversitário de Ciências Marinhas em Eilat (IUI) pelo uso do Sam Rothberg R/V e pela assistência profissional de seus tripulantes. Somos gratos aos funcionários da EcoOcean por operar o ROV. Agradecemos a M. Weis e R. Liberman por sua ajuda no trabalho de campo.

Conflitos de interesse:Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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