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Perfil proteômico de célula quase única do tubular proximal e glomérulo do rim humano normal

Tara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², Sudeshna Roy¹, Juliana Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adam C. Swensen², Rui Zhao³, Ying Zhu³, Priyanka Rashmi¹, André Schroeder¹, Isabella Damm¹, Suástica Sur¹, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian²* e Minnie M. Sarwal¹* para o Consórcio Kidney Precision Medicine Project (KPMP)

¹Divisão de Transplante de Múltiplos Órgãos, Departamento de Cirurgia, Universidade da Califórnia, São Francisco, São Francisco, CA, Estados Unidos

²Laboratório Nacional do Noroeste do Pacífico, Divisão de Ciências Biológicas, Richland, WA, Estados Unidos

³Laboratório de Ciências Moleculares Ambientais, Laboratório Nacional do Noroeste do Pacífico, Richland, WA, Estados Unidos

⁴Departamento de Patologia, Universidade de Michigan, Ann Arbor, MI, Estados Unidos

Palavras-chave:glomérulo, espectrometria de massa, análise de célula única, proteômica,rim

As avaliações moleculares no nível de uma única célula podem acelerar a pesquisa biológica, fornecendo avaliações detalhadas da organização celular e da heterogeneidade do tecido na doença e na saúde. O humanorimtem estados multicelulares complexos com funcionalidade variável, muitos dos quais podem agora ser completamente aproveitados com os recentes avanços tecnológicos em proteômica de tecidos em um nível quase de célula única. Discutimos os passos fundamentais na primeira aplicação deste método proteômico baseado em espectrometria de massa (MS) para análise de subseções do humano normalrim, como parte do Kidney Precision Medicine Project (KPMP). Usando ~30-40 células renais microdissecadas capturadas a laser, identificamos mais de 2.500 proteínas humanas, com especificidade para otubular proximal(PT; n=25 proteínas) e regiões glomerulares (Glom; n=67 proteínas) dorime suas funções metabólicas únicas. Este estudo piloto fornece o roteiro para a aplicação de nosso fluxo de trabalho de proteômica de célula única para a análise de outros microcompartimentos renais, em maior escala, para desvendar perturbações da função subcelular renal no rim normal, bem como diferentes etiologias de aguda e crônicadoenca renal.

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Introdução

Avanços recentes no perfil molecular, especificamente a análise transcricional em nível de célula única, podem revelar populações de células raras em tecidos clínicos heterogêneos, o que está contribuindo para nossa compreensão da biologia renal e seus processos moleculares (1-7). Há uma necessidade não atendida de desenvolver métodos que possam fornecer informações biológicas abrangentes nos níveis de RNA e DNA e também permitir a análise de tecidos proteômicos de célula única.

As tecnologias proteômicas, ao contrário da genômica, podem fornecer informações funcionais sobre estados celulares e redes regulatórias (2). Um desafio tecnológico para a proteômica baseada em espectroscopia de massa (MS) é a limitação do material de partida. Ao contrário da transcriptômica, a proteômica não permite a amplificação molecular. Este factóide resultou em esforços substantivos para aumentar a sensibilidade analítica da proteômica baseada em MS, incluindo a miniaturização da tecnologia e maior eficiência na fonte de ionização por eletropulverização (8, 9), de modo que a sensibilidade analítica agora é suficiente para detectar proteínas em um único mamífero células. Apesar de ter alta sensibilidade analítica, as aplicações proteômicas para pequenos volumes de amostra introduziram desafios adicionais, como adsorção não específica de proteínas e peptídeos nas superfícies dos tubos de reação, cinética de digestão ineficiente, necessidade de limpeza e desafios com a entrega. Nosso grupo relatou recentemente sobre o método de proteômica de célula única (nscProteomics) em células HeLa, que fornece tecnologia altamente inovadora e sensível para medições de proteoma de amostras com quantidades sub-nanogramas de proteína de um pequeno número de células (10). Este método requer equipamentos de processamento de amostras altamente personalizados e é difícil de transferir para outros laboratórios de pesquisa em seu estado atual de desenvolvimento. Processando humanorimtecidos por meio desse pipeline exigiram muita atenção ao desenvolvimento de protocolos para otimizar a preservação de tecidos e a captura de células.

Neste estudo, nos concentramos em fornecer um roteiro para a medição bem-sucedida da interrogação proteômica de vários subcompartimentos derim, no nível de quase uma única célula, com os seguintes resultados: (i) Avaliação da coleta e armazenamento de tecido renal ideal para nscProteomics; (ii) Identificação do padrão de referência apropriado para nscProteomics; (iii) Otimização da espessura do tecido renal para microdissecção por captura a laser (LCM); (iv) Otimização dos parâmetros do LCM; (v) Descrição do método nscProteomics usando um método micro POTS totalmente automatizado baseado em LC-MS (μPOTS; Processing in One pot for Trace Samples) (11); (vi) Análise de dados para nscProteomics.

Para realizar as tarefas acima mencionadas, processamos 11rimbiópsias e protocolos desenvolvidos e metodologias para coletar, processar e interrogar a expressão proteômica derimamostras por μPOTS. Quando acoplado a LC-MS altamente sensível, exibimos um método μPOTS totalmente automatizado que permite a reprodutibilidade e fornece medições proteômicas quantitativas de ~3,{2}} proteínas de 10 a 100 células renais microdissecadas por captura a laser (LCM), um nível de cobertura alcançado apenas anteriormente para milhares de células (12–17). Este estudo ajudará na caracterização molecular da heterogeneidade e patologia celular tecidual em biópsias renais de pacientes com diferentes causas de doença renal aguda e crônica. Esta tecnologia única tem o potencial de desvendar a heterogeneidade proteômica e marcadores de proteínas únicos em diferentesrimsubtipos e subestruturas de doenças que se correlacionarão com a patogênese, prognóstico e estratificação de risco da doença. O estudo está resumido na Figura 1.

Figura 1. O fluxo de trabalho de proteômica de célula única (nscProteomics) é otimizado para processamento humanorimtecidos. O fluxo de trabalho inclui a identificação derimcoleta e armazenamento de tecidos, os controles de qualidade para o estabelecimento de microdissecção por captura a laser do método nscProteomics para células renais.

Procedimentos experimentais

Design de estudo

A representação esquemática dos estudos proteômicos realizados em 11 humanos normaisrinsé mostrado na Figura 2A. Um total de 28 execuções de espectrometria de massa (MS) foram realizadas para nscProteomics microdissecados de captura a laser (LCM) em seções glomerulares pareadas (Glom) e tubulares contorcidos proximais (PT). Tecidos dos dois primeirosrinsforam preservados como FFPE e em meio composto de temperatura de corte ótima (OCT). Problemas de tecidos renais de mais 9 rins foram processados ​​apenas em OCT (Figura 2A).

Figura 2. (A) Um resumo das amostras e ensaios do estudo. (B) O gráfico QC para reprodutibilidade do processo usando tecido OCT. As diferenças de contagem espectral entre proteínas para 2 corridas separadas usando tecido OCT foram plotadas em relação à contagem espectral de proteína média para 1.257 proteínas. No gráfico, a linha azul representa a diferença média; as linhas vermelha e verde representam limites de 2 SD e 3 SD, respectivamente. 97,96 por cento das proteínas estão dentro do limite de reprodutibilidade calculado de 13,52, indicando um alto grau de reprodutibilidade. Vê-se também que a variabilidade inter-corrida do processo envolvendo tecido OCT é inferior à do processo envolvendo tecido FFPE (limite de reprodutibilidade calculado: 24,43). (C) Comparação das distribuições de contagem espectral de 374 proteínas comuns em OCT e FFPE. Um número maior de proteínas do tecido OCT mostra contagens espectrais altas, enquanto uma maior preponderância de contagens espectrais baixas é observada para proteínas do tecido FFPE. (D) Comparação de distribuições de contagem espectral de 76 proteínas únicas em FFPE e 244 proteínas únicas em OCT. A maior preponderância de proteínas de baixa contagem espectral é observada no tecido OCT. Isso pode indicar que a técnica tecidual OCT é melhor para detecção de proteínas pouco abundantes no cenário atual. O coeficiente de correlação entre as proteínas identificadas a partir de 2 tecidos congelados OCT foi de 0,96 (P <>

Aquisição de Amostra de Tecido Renal

Humanotecidos renaisforam coletados de um total de 11 nefrectomias parciais não identificadas, obtidas da University of California San Francisco (UCSF) e University of Michigan (UM), com IRB aprovado, como parte de um estudo piloto de viabilidade de tecnologia no NIH Kidney Precision Medicine Projeto (KPMP). Apenas a área saudável dorimdeterminado por um patologista treinado foi usado para este propósito. As amostras foram anonimizadas com a única ressalva de que os tecidos foram coletados de adultos. Para avaliar o protocolo de coleta de amostra ideal para a tecnologia, inicialmente, ~100 mg de tecido de 2 rins foi dividido igualmente e preparado como seções de tecido embebido em parafina fixada em formalina (FFPE) ou foi congelado no Composto Tissue-Plus™ OCT (Fisher Scientific). Uma seções consecutivas de 5 μm e três de 10 μm de espessura foram cortadas de cada bloco de OCT com um criomicrótomo e montadas em lâminas de membrana de polietileno tereftalato (PET) 1.0 (Zeiss) para glomerular eTúbulo proximaldissecação. A seção de 5 μm de espessura foi corada com H&E para visualização das principais estruturas histológicas. As restantes secções de 10 μm de espessura não foram coradas. Todas as lâminas foram armazenadas a -80 graus até a dissecção.

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Avaliação do Impacto do Envio e Processamento de Tecidos na Produção Proteômica

Para avaliar o impacto dos atrasos na análise proteômica do tecido congelado OCT,rimtissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 h de viagem e processado no segundo centro e vice-versa. A proteômica em massa foi realizada em dois 2 únicosrins(rim nº 3, nº 4), adquirido na Universidade de Michigan e enviado para 2 locais diferentes (Ohio State University e UCSF) para análise de MS, usando o mesmo protocolo e parâmetros de MS em ambos os locais. Os resultados das corridas de MS foram então comparados entre os 2 locais.

Extração e Precipitação de Proteínas

Isso foi realizado nos métodos de preparação de tecidos OCT e FFPE para a seleção do método ideal para proteômica de tecidos. O tecido OCT foi seccionado em seções de 10 μm de espessura usando um criomicrótomo. Para selecionar a quantidade mínima de tecido necessária para extração de proteína para MS, três cachos (uma seção que é colocada em um tubo Eppendorf em vez de espalhar na lâmina) e 5 cachos de tecido congelado foram cortados, descongelados e transferidos para tubos de microcentrífuga contendo um grânulo de aço inoxidável de 5 mm (Qiagen), exposto ao tampão de lise celular de mamífero (incluindo Benzonase® Nuclease and Protease Inhibitor Solution; Qiagen) e homogeneizado em um TissueLyser LT (Qiagen) a 50 r/s por 3 min. A concentração de proteína foi quantificada (ensaio de Bradford; Thermo Scientific) e armazenada a -20 graus até o uso. Tecido armazenado para<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

Digestão de Tripsina

Aproximadamente 150 ug de proteína total (~15 por cento da entrada disponível) foi exposta a agentes redutores (200 mM DTT e 100 mM Tris-HCl) e reagentes alquilantes (200 mM iodoacetamida e 100 mM Tris-HCl) e depois diluída com água livre de RNAse/DNAse para reduzir a concentração de Ureia para 0,6 M. Adicionaram-se quatro ug de tripsina suína (Sigma) e a amostra foi digerida a 37 graus. A concentração de proteína foi quantificada (ensaio de Bradford; ThermoScientific) e 10 ug de proteína foram usados ​​para MS.

MS para Proteômica em Massa para Avaliar o Método Ideal de Processamento do Tecido Renal

A mistura de peptídeos trípticos foi acidificada com ácido fórmico, limpa com colunas C18 Monospin e analisada no Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). MS/MS foi realizado usando Dissociação de C-Trap de Alta Energia (HCD). Os espectros de massa foram analisados ​​usando Byonic v2.14.27 (Protein Metrics) permitindo tolerâncias de massa de 12 ppm. Modificações pós-traducionais variáveis ​​foram permitidas, incluindo oxidação, metilação, carbamilação e fosforilação. As proteínas foram limitadas àquelas com pontuação superior a 1% de taxa de falsa descoberta (FDR). Comparações de abundância de proteína e dados de MS foram feitas para selecionar o método ideal pararimcoleta de tecido entre FFPE e OCT.

Microdissecção por captura a laser

Seções não coradas de 5, 10 e 20 μM de espessura montadas em lâminas de PET foram colocadas no palco do sistema de microdissecção a laser Zeiss PALM MicroBeam (Zeiss) para testar a espessura de corte ideal. Glomerular eTúbulo proximalas regiões foram selecionadas usando a ferramenta à mão livre e as dissecções foram realizadas na objetiva de 10X. Seções com ~ 4.580 μm2 de área e 10 uM de espessura foram capturadas, o que representou ~ 40 células glomerulares com base na fórmula publicada anteriormente para estimativa de células glomerulares em um adulto saudávelrim(18). Para otubular proximalcélulas, capturamos ~2.900 μm2 detubular proximalcélulas, que representavam ~36 células. As seções cortadas foram catapultadas para uma tampa adesiva opaca de 200 μL (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) e armazenadas a -80 graus.

Proteômica de célula quase única (nscProteômica)

Para solubilizar as proteínas coletadas em tampas de captura com LCM, uma gota de 10 μL de 0,1 por cento de DDM 50 mM Tris pH 8 foi adicionada diretamente à tampa. As amostras foram incubadas por 30 min a 37 graus em um termomixer Eppendorf ThermoTop para reduzir a evaporação, seguido de centrifugação a 2,000 × g por 1 min para transferir o lisado para o frasco. As proteínas foram reduzidas com ditiotreitol 5 mM e incubadas a 37 graus por 30 min. A alquilação foi realizada a 10 mM de iodoacetamida com uma incubação de 45 min no escuro a 25 graus. Em seguida, uma alíquota de 10 ng de Ls-C foi adicionada seguida por 3 h de incubação a 25 graus. Uma alíquota de 10 ng de tripsina foi então adicionada seguida de digestão durante a noite a 25 graus. Os peptídeos digeridos foram misturados com uma alíquota de 15 μL de 18 MΩ de água.

Plataforma LC-MS para Amostras Ultra Pequenas

Amostras peptídicas (25 μL) foram separadas usando uma coluna de 60 cm, com diâmetro interno de 50 μm e um emissor integrado (New Objective). As colunas foram empacotadas internamente com meio Waters BEH de 1,7 μm de diâmetro. Um gradiente 100-min foi produzido usando uma bomba nano Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific). Este sistema foi acoplado a um espectrômetro de massa QExactive Plus (Thermo Scientific). Os espectros de massa foram coletados de 300 a 1.800 m/z, usando um método de aquisição dependente de dados top 12. Os espectros MS1 foram coletados com uma resolução de massa de 35K e MS2 com 17,5K. Um TI máximo de 100 ms foi usado para aumentar as identificações de íons de baixa abundância.

Extração de dados proteômicos

Todos os arquivos brutos foram processados ​​usando MaxQuant (versão 1.5.3.30) para detecção de recursos, pesquisa de banco de dados e quantificação de proteína/peptídeo (19) seguindo as configurações descritas anteriormente (10). Os espectros de massa em tandem foram pesquisados ​​no banco de dados humano UniProtKB/Swiss-Prot (baixado em 29 de dezembro de 2018 e contendo 20.417 entradas revisadas). Os dados de proteômica MS para nscProteomics foram depositados no ProteomeXchange Consortium por meio do repositório parceiro PRIDE (20) com o identificador de conjunto de dados PXD015058 e 10.6019/PXD015058.

Análise de dados

Os dados de MS foram obtidos de corridas realizadas no PNNL (nscProteomics) e na Universidade de Stanford (proteômica em massa). Para proteômica em massa. Os seguintes métodos estatísticos foram usados ​​para selecionar o melhorrimmétodo de coleta de tecido, congelado em OCT ou processado como FFPE, conforme avaliado por proteômica quantitativa do volume de tecido, (i) foi calculado o rendimento de proteína/mg de tecido de entrada equivalente; (ii) A reprodutibilidade de MS foi testada na saída de MS de seções de FFPE e OCT de cada um dos 2 rins, preparadas pelo mesmo indivíduo usando o mesmo protocolo, analisadas no mesmo instrumento de MS usando um protocolo definido, com alguns dias de intervalo (21). Um limite de reprodutibilidade (22) foi usado para fornecer um limite aproximado nas diferenças de medição entre execuções sucessivas de um único processo, bem como uma estimativa de precisão para comparação entre processos. O coeficiente de correlação, que forneceu o grau de concordância entre corridas sucessivas (usando o mesmo tecido), foi calculado; (iii) A abundância de proteínas e distribuição de tamanho de fragmentos de peptídeos foram calculados para avaliar as variações originadas da degradação de proteínas, reticulação devido à formalina, etc. Outros aspectos do CQ, incluíram (iv) avaliação da deriva do processo ao longo de réplicas e tempo usando um pool comumrimreferência e (v) cálculo do viés. Análise quantitativa rigorosa e identificação de proteínas únicas utilizaram dados apenas com proteínas com contagens espectrais maiores ou iguais a 5 (23). O teste exato de Fisher foi usado para avaliar o enriquecimento de proteínas comuns e únicas mapeadas entre dois rins humanos normais (#1 e #2). Com base na análise acima (ver resultados), o tecido congelado OCT foi selecionado como método de coleta para todas as análises subsequentes.

A próxima etapa do foco da análise de dados foi identificar, quantificar e validar conjuntos de proteínas enriquecidos ou específicos para as ~10-100 células obtidas de cada uma das duas células selecionadasrimsubcompartimentos—regiões Glom e PT, obtidas do mesmorim, a granel e LCM de OCT congeladostecido renal(n=9; rins #3–11) e executado por nscProteomics.

Uma {{0}}abordagem de filtragem semiconservativa em etapas foi adotada para lidar com problemas de dados ausentes/incompletos, e o teste G (24) foi usado para identificar se os dados estavam ausentes ao acaso (MAR) ou Missing Not At Random (MNAR). A avaliação adicional da confiabilidade dos dados foi feita selecionando rigorosamente as proteínas observadas em Maior ou igual a 50 por cento de todas as amostras. O teste T foi usado para identificar o enriquecimento significativo de proteínas em glomming ou PT e a correção de teste múltiplo (Benjamini-Hochberg FDR) com um limiar de significância de 0,1 foi aplicado. Para fins de análise, os dados de MS de intensidade relativa (log 2 transformado) obtidos de Glom, PT e frações a granel de um únicorimforam considerados pareados. Identificamos proteínas enriquecidas em Glom (com baixos níveis em PT/bulk) e exclusivas de Glom (ausentes em PT), bem como proteínas enriquecidas em PT (com baixos níveis em Glom/bulk) e exclusivas de PT (ausentes em Glom) . A análise de enriquecimento foi feita apenas em dados sem valores ausentes em cada grupo para aumentar a confiança. A correlação entre os valores de abundância de proteínas comuns foi usada para avaliar o grau de concordância entre proteínas do subcompartimento enriquecido entre corridas separadas do mesmo experimento. Também realizamos a validação cruzada de proteínas significativamente enriquecidas em cada compartimento analisando essas comparações de conjuntos de amostras únicos entre 2 corridas diferentes, corrida 1 e corrida 2. A validação biológica para conjuntos de proteínas de subcompartimentos enriquecidos (Glom e PT) foi realizada por perguntando se proteínas enriquecidas em subcompartimentos conhecidos poderiam ser localizadas de volta em suas regiões específicas em dados públicos do Atlas de Proteína Humana (https://www.proteinatlas.org/) (25).

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Comparação/Integração de Dados Cross-Omics

Para avaliar a concordância da expressão da proteína no nível de RNA, foram utilizados dados gerados a partir de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA Seq) realizado em 10 nefrectomias nativas, 9 dos quais foram sobrepostos com orinsusado em nscProteômica. Para isso, foi utilizada a plataforma 10x Genomics Chromium com química v3 usando o método otimizado no laboratório Sarwal como Tissue Interrogation Site (TIS) do KPMP Consortium (um manuscrito detalhando o método e os resultados está em preparação). Para esta análise de ômica cruzada, usamos dados de transcriptoma de 45.411rimcélulas resolvidas em nove tipos principais de células: podócitos, células mesangiais, endotélio glomerular, estroma/interstício, células imunes,Túbulo proximal, ramo ascendente espesso da alça de Henle, túbulo distal/conector e ducto coletor. A análise de dados de célula única foi feita usando o pacote Seurat R versão 2.3.4. Uma análise mais aprofundada desses dados está em desenvolvimento (26).

De: 'Perfil de proteômica de célula única próxima doTubular ProximaleGlomérulodo Humano NormalRim' por Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Sur1, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian2* e Minnie M. Sarwal1* peloRimConsórcio do Projeto de Medicina de Precisão (KPMP)

---Artigo de PESQUISA ORIGINAL Frente. Med., 17 de setembro de 2020 |