Extrato de células de Jasminum Sambac como reforço antioxidante contra o envelhecimento da pele Parte 1

Abstrato: O estresse oxidativo desempenha um papel importante no processo de envelhecimento da pele através da produção de espécies reativas de oxigênio e formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs). Ingredientes antioxidantes são, portanto, necessários no mercado de cuidados com a pele e o uso de moléculas provenientes de culturas de células vegetais oferece uma oportunidade única. Neste trabalho, as características de um extrato hidroetanólico obtido por células de Jasminum sambac (JasHEx) foram exploradas. As propriedades antioxidantes e anti-AGE foram investigadas por uma abordagem multidisciplinar combinando experimentos de espectrometria de massa e bio-informática in vitro e ex vivo. JasHEx contém derivados de ácido fenólico, lignanas e triterpenos e descobriu-se que reduz a produção de espécies reativas de oxigênio citosólico em queratinócitos expostos a estresse exógeno. Também mostrou a capacidade de reduzir a formação de AGE e aumentar a produção de colágeno tipo I na matriz extracelular. Os dados demonstraram que as propriedades antioxidantes do JasHEx estavam relacionadas às suas atividades de eliminação de radicais livres e quelantes de metais e à ativação da via Nrf2/ARE. Isso pode explicar a atividade anti-inflamatória de JasHEx relacionada à diminuição dos níveis de NO em macrófagos estimulados por LPS. Assim, o JasHEx pode ser considerado um poderoso reforço antioxidante contra o envelhecimento da pele induzido pelo estresse oxidativo.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides Cistanche têm uma capacidade robusta de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolonga o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhora a atividade de SOD no soro e retarda a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e pode eliminar espécies reativas de oxigênio, prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Palavras-chave: envelhecimento da pele; espécies reativas de oxigênio (ROS); produtos finais de glicação avançada (AGEs); Jasminum sambac extrato hidroetanólico (JasHEx); espectrometria de massa; metabolômica; Rede Molecular Social de Produtos Naturais Globais (GNPS); fator nuclear eritroide 2-fator relacionado 2 (Nrf2)

1. Introdução

Fatores intrínsecos genéticos e agentes extrínsecos como irradiação ultravioleta, irradiação infravermelha, xenobióticos e poluentes ambientais causam a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Eles são gerados pela ativação da cadeia respiratória mitocondrial, citocromo p450 e NADPH oxidases [1]. As ROS incluem radicais livres (ânion superóxido, radical hidroperoxil, radical alcoxi e radical hidroxila) e moléculas não radicais (peróxido de hidrogênio e oxigênio singleto) [2]. Quando os sistemas antioxidantes estão sobrecarregados, as ROS se acumulam dentro das células e geram o chamado estresse oxidativo, que é o principal contribuinte para o envelhecimento da pele [3].

De fato, o estresse oxidativo causa danos ao DNA e oxidação de lipídios e proteínas, juntamente com o desencadeamento da via das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK) (AKT, JNK, ERK e p38) [4]. Este, por sua vez, promove a expressão de citocinas pró-inflamatórias, fatores de crescimento e moléculas adesivas por meio da estimulação dos fatores de transcrição AP-1 e NF-κB. Além disso, a ativação da via MAPK causa alterações na matriz dérmica, reduzindo os níveis de colágeno. Acelera a degradação do colágeno modulando a expressão das metaloproteinases de matriz (MMPs) e seus inibidores tissulares TIMPs e reduz a síntese de novo colágeno, bloqueando o receptor TGF-tipo II/sinalização Smad. Além disso, o estresse oxidativo altera as condições da pele, interrompendo o gradiente de cálcio epidérmico, essencial para a integridade e função do envelope cornificado, estimulando a função das glândulas sebáceas e induzindo a degeneração dos melanócitos [5].

Paralelamente, a formação de biomoléculas modificadas conhecidas como produtos finais de glicação avançada (AGEs) promove estresse oxidativo em células e tecidos [6]. O desenvolvimento desses biomarcadores de envelhecimento é induzido por vários fatores ambientais, como fumaça de cigarro, altos níveis de dietas com carboidratos refinados e simples, alimentos cozidos em alta temperatura e estilo de vida sedentário; Os AGEs são produtos estáveis ​​e irreversíveis derivados da reação não enzimática entre açúcares redutores e proteínas, ácidos nucléicos ou lipídeos, seguida de rearranjos adicionais [7]. De fato, o ponto de partida da formação de AGE é a reação de Maillard, na qual grupos carbonila de açúcares redutores reagem reversivelmente com grupos amino livres de proteínas, ácidos nucléicos ou aminofosfolipídeos para formar bases de Schiff. Essas iminas se rearranjam espontaneamente em cetamina mais estável, chamadas de produtos Amadori. Eles produzem dicarbonilos reativos (como glioxal ou metilglioxal) que reagem com grupos funcionais de proteínas lisina e arginina, produzindo uma grande variedade de AGEs [8,9]. Eles são classificados em diferentes grupos com base em sua capacidade de emitir fluorescência e formar reticulações.

A ação dos AGEs é mediada pelos receptores para AGEs (RAGEs) que são proteínas transmembranares pertencentes à superfamília das imunoglobulinas de moléculas de superfície celular tipo I, expressas em diferentes tipos celulares, incluindo queratinócitos, fibroblastos e macrófagos. A ligação AGEs/RAGEs aumenta a produção de ROS principalmente pela ativação de NADPH oxidases (NOXes) e da cadeia respiratória mitocondrial, levando ao estresse oxidativo e todos os efeitos consequentes descritos acima [6,8].

Além disso, as proteínas da matriz extracelular (MEC), especialmente o colágeno, são altamente sensíveis à glicação. De fato, os níveis da estrutura AGE pentosidina, derivada do colágeno, são significativamente maiores em indivíduos idosos do que em jovens [10]. A glicação do colágeno altera não apenas as propriedades mecânicas do próprio colágeno, que se torna mais rígido e quebradiço [11], mas também as da matriz extracelular, afetando o comportamento das células residentes (crescimento, diferenciação, motilidade, expressão gênica e resposta a citocinas) e interações célula-matriz [12].

Nesse cenário, ingredientes antioxidantes são muito procurados na área cosmética para reduzir a formação de AGEs e sua cascata oxidativa relacionada: extratos derivados da espécie Jasminum sambac, pertencente à família Oleaceae, são interessantes por suas propriedades antioxidantes e seu uso conjunto na medicina popular medicamento para tratar doenças de pele [13]. No entanto, os extratos de plantas apresentam várias desvantagens, como baixa biossustentabilidade, potencial contaminação com pesticidas, fertilizantes ou patógenos e a variabilidade de sua composição qualitativa e quantitativa, afetada por estações e condições ambientais. Uma alternativa válida às plantas, como fonte de ingredientes cosméticos bioativos, é representada pelas culturas de células vegetais que oferecem diversas vantagens: (i) alta sustentabilidade do processo produtivo, já que não há necessidade de terras agrícolas; (ii) fornecimento contínuo de produtos naturais sem dependência geográfica, sazonal e do ciclo reprodutivo da planta; (iii) ausência de riscos de contaminação por patógenos, poluentes ambientais e resíduos agroquímicos; (iv) condições de cultivo padronizadas que permitem obter taxas mais altas e reprodutíveis de produção de biomassa e metabólitos; (v) alta versatilidade, uma vez que a concentração dos compostos pode ser otimizada alterando as condições de cultivo e (vi) protocolos de extração mais fáceis e menos demorados, reduzindo a necessidade de solventes agressivos [14,15].

Aqui, um extrato hidroetanólico derivado de culturas de células Jasminum sambac (JasHEx) foi estudado. O objetivo do nosso estudo é uma ampla caracterização química e biológica de JasHEx, explorando particularmente suas propriedades antiglicação e antienvelhecimento. Primeiro, abordagens avançadas baseadas em espectrometria de massa foram usadas para obter uma caracterização estrutural detalhada do extrato. Em seguida, experimentos in vitro e ex vivo foram realizados para comprovar a atividade biológica do JasHEx como antioxidante.

2. Materiais e métodos

2.1. Culturas de tecidos vegetais e preparação de extratos

O jasmim árabe certificado (Jasminum sambac) foi obtido de um viveiro local ("Ladre di Piante", Pistoia, região da Toscana, Itália). Folhas de Jasminum sambac foram embebidas em 70 por cento de etanol (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) por 1 min e esterilizadas na superfície com 1 por cento (v/v) de alvejante comercial suplementado com Tween 2{{ 9}} (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) por 8 min, seguido de três lavagens em água destilada estéril. Em seguida, as folhas foram cortadas em pedaços de 0,5–1,0 cm e cultivadas em meio MS de concentração total [16] contendo 3 por cento (p/v) de sacarose, 0 0,2 mg/L 2,4D e 8 g/L fito-ágar. Os explantes foram subcultivados mensalmente em meio fresco por três meses. Uma vez obtido um calo amarelo-esverdeado, friável e de crescimento rápido, as células vegetais foram transferidas para o meio líquido MS, suplementado com 3 por cento (p/v) de sacarose e 0,2 mg/L 2,4D. A suspensão foi agitada em agitador giratório às 23h e 27 ◦C em ambiente escuro. As células crescidas no escuro foram aumentadas semanalmente de frascos de pequena para grande escala até que culturas em suspensão líquida de cerca de 177 g/L fossem alcançadas. A preparação do extrato hidroetanólico da cultura celular de Jasminum sambac (JasHEx) foi realizada pela adição de 2000 mL de uma solução de etanol/água (90/10, v/v) a 500 g de células. A mistura foi homogeneizada por 3 minutos a 1500 rpm e 6 minutos a 3800 rpm usando um moinho de facas Grindomix GM300 (Retsch GmbH, Haan, Alemanha). A suspensão obtida foi agitada a 400 rpm por 2 h a 25 ◦C, evitando a exposição à luz. A suspensão foi então centrifugada a 6300 rpm por 10 min a 4 ◦C. O sobrenadante foi removido, filtrado e, em seguida, concentrado sob vácuo em um evaporador rotativo (IKA RV8, IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Alemanha) ajustado para 25 ◦C. Finalmente, o pH foi levado a 7,0 com NaOH 10 N e, em seguida, liofilizado até obter um pó fino.

2.2. Análise UPLC–MS/MS para caracterização química de JasHEx

Obteve-se uma extração bifásica de butanol/água. A fração de butanol foi dessecada e descongelada em metanol (10 mg/mL) antes da análise UPLC–MS/MS realizada em um Espectrômetro de Massa Q-Exactive Classic equipado com um sistema UltiMate™ 3000 UPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA ). Todas as corridas cromatográficas foram realizadas conforme já descrito por Ceccacci et al. [17].

2.3. Análises globais de redes moleculares sociais de produtos naturais

Para a identificação de metabólitos, foi empregada a Rede Social Molecular de Produtos Naturais Globais [18]. Todos os sinais MS e MSMS não atribuídos pelo GNPS foram cuidadosamente examinados e atribuídos de acordo com a literatura. Os arquivos brutos foram convertidos para o formato mzXML pelo software MS Converter General User Interface, antes da pesquisa da biblioteca espectral GNPS. Foi realizado usando tolerância de massa de íon precursor de 0.025 Da, tolerância de massa de íon fragmento de 0,02 Da, picos mínimos correspondentes de 2 e limite de pontuação de 0,7. Os resultados foram confirmados manualmente.

O pré-processamento de dados foi realizado por Mzmine (Versão 2.53, Softpedia, Bucareste, Romênia) [19] e um trabalho de rede molecular baseada em recursos (FBMN) [20] foi realizado conforme relatado por Ceccacci et al. [17]. Os arquivos de rede obtidos foram importados para o Cytoscape (Versão 3.9.1, Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos EUA (NIGMS), Bethesda, MD, EUA) [21].

2.4. Análise Quantitativa de Lignanas e Triterpenos

As mesmas configurações de UPLC indicadas para os experimentos qualitativos foram empregadas para a análise quantitativa de lignanas, enquanto que para os triterpenos, eles foram aprimorados para separar dois pares de isômeros, ácido arjunólico/ácido asiático e ácido oleanólico/ursólico. A análise foi realizada em um Espectrômetro de Massa Q-Exactive Classic conforme definido anteriormente. A separação foi realizada por um Phenomenex Kinetex (Torrance, CA, EUA) EVO C18 300 Å (150 × 2,1 mm, tamanho de partícula 5 µm). A fase móvel consistia em A (solução aquosa de acetato de amônio 5 mM, pH 9.00 ajustado por hidróxido de amônio) e B (1{{40}}0 por cento de acetonitrila) usando uma eluição gradiente de 13-28 por cento B em 0-20 min, 28-65 por cento B em 20-24 min, 65-75 por cento B em 24-28 min, 75-95 por cento em 28-28,5 min, 95 por cento em 28,5 –32 min, 95–13% em 32–32,1 min e 13% em 32,1–44 min. A taxa de fluxo foi de 0,450 mL/min e o volume de injeção foi de 5 µL. Tanto para lignanas quanto para triterpenos, os dados foram adquiridos com o método de massa descrito por Ceccacci et al. [17]. Adquirimos nortachelogenina (#LCA52174) da Biosynth Carbosynth, matairesinol (#80497) e ácido maslínico (#83209) da PhytoLab GmbH & Co.KG, secoisolariciresinol (#60372) e ácido arjunólico (#SMB00119) da Sigma-Aldrich (Saint Louis , MI, EUA), ácido asiático (#0027), ácido oleanólico (#0041 S) e ácido ursólico (#0037 S) da Extrasynthèse (Genay, França). As curvas de calibração foram obtidas pela injeção de padrões na concentração de 0,05 a 25 µM para lignanas e 0,1 a 25/250 µM para triterpenos. O limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) para os padrões foram determinados com base na relação sinal-ruído (S/R).

2.5. Culturas e Explantes de Células da Pele

Os queratinócitos humanos imortalizados (HaCaT), adquiridos da Addexbio Technologies (San Diego, CA, EUA), foram preservados em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) que foi suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em 95 por cento de ar, 5 por cento de CO2 e atmosfera umidificada a 37 ◦C. Fibroblastos dérmicos humanos (HDF) foram preservados em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal (FBS; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EUA ) em 95% de ar, 5% de CO2 e atmosfera umidificada a 37 ◦C. Explantes de pele, obtidos da pele de doadoras saudáveis ​​(31 e 40 anos) no centro cirúrgico Villa Cinzia (Nápoles, Itália), foram cultivados em 24-placas transwell em DMEM/FBS mais antibióticos em condições ar-líquido a 37 ◦C em ar umidificado com 5% de CO2. Todos os doadores deram seu consentimento informado por escrito para o uso dos tecidos da pele, de acordo com a Declaração de Helsinki.

2.6. Ensaio ROS citosólico em H2O2-Células HaCaT estressadas

Para este processo, 1,8 × 104 HaCaT foram semeados em 96-placas de poços e cultivados por 20 h. As células foram então tratadas por 2 h com diferentes concentrações de JasHEx (00,0006 por cento, 0,002 por cento e 0,006 por cento p/v) ou com 500 µM de ácido ascórbico, usado como controle positivo. Em seguida, foram lavadas em PBS (fosfato-tampão salino) e incubadas a 37 ◦C com 100 µL/poço de uma solução contendo: 10 mM de Hepes, 1,3 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 5 mM de glicose e 5 µM CM-H2DCFDA (5-(e-6)-clorometil-20,70 -diacetato de diclorodihidrofluoresceína, Invitrogen). Após 45 min, uma lavagem com PBS foi realizada e a intensidade de fluorescência basal das células foi medida a 535 nm (excitação 485 nm), usando o instrumento EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). Em seguida, o estresse oxidativo foi induzido pela adição de 450 µM de H2O2, e a fluorescência das amostras foi medida após 30 min.

2.7. Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para detecção de AGE em células de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) estressados ​​com glioxal

Para esta etapa, 1,5 × 104 HDF foram semeados em 96-placas de poços e cultivados por 2 dias. Após a lavagem com PBS, as células foram fixadas por 1{{10}} min com 100 µL de formaldeído a 4 por cento em PBS. Posteriormente, foram tratados com JasHEx (0,0006 por cento e 0,002 por cento p/v) ou o controle positivo de 1 µM de Aminoguanidina na presença de 0,5 por cento de glioxal a 50 ◦C por 1 semana. Após a incubação, eles foram processados ​​para um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) usando um anticorpo específico contra AGE (Abcam ab23722).

2.8. Ensaio de imunohistofluorescência em explantes de pele estressados ​​com metil-glioxal para detecção de fibrilina-1

Explantes de pele foram derivados de dois pacientes, 31 e 40 anos de idade. A partir de cada biópsia de pele, três punções foram gerados para cada tratamento que ocorre na interface ar-líquido. No primeiro dia, os punções foram tratados com JasHEx (0.002 por cento e 0,006 por cento p/v) ou o controle positivo (1 mM Aminoguanidina) e após 24 h, 500 µM metil- glioxal foi adicionado. Os tratamentos foram atualizados a cada dois dias por um total de sete dias. Ao final do período, os punções foram processados ​​para análise histológica, fixados em PFA a 4 por cento, incubados em sacarose a 15 por cento, depois em sacarose a 30 por cento e crioarmazenados em composto OCT (Temperatura de corte ideal) a -80 ◦C . A criossecção de 5 µm foi obtida com o criostato CM1520 Leica (Leica Biosystems, Buffalo, IL, EUA). As lâminas com criosseções foram hidratadas por 30 min em PBS e colocadas em uma solução de "bloqueio" (6 por cento BSA, 5 por cento de soro, 20 mM MgCl2, 0,2 por cento Tween) por 1 hora. Posteriormente, foram incubados com o anticorpo primário anti-Fibrilina 1 (MA5-12770, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). por 16 horas a 4 ◦C. As lâminas foram lavadas com PBS por 30 minutos e depois incubadas com o anticorpo secundário anti-coelho Alexa-Fluor 546 (A11035, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) por 1 hora. Os núcleos foram corados com DAPI (40, 6-5 diamidino-2-fenilindole) 1 g/mL em PBS por 10 min. As imagens foram adquiridas com microscópio de fluorescência e analisadas com o software ImageJ (Versão 1.53a, National Institutes of Health, EUA).

2.9. Ensaio AlphaLISA para Medir o Conteúdo do Procolágeno Tipo I C-Peptídeo (PIP)

Nesta etapa, 8 × 103 HDF foram semeados em uma placa de 96-poços e tratados por 24 h com JasHEx (0.0006 percent , 0,002 percent , e 0,006 por cento p/v) ou com TGF- (2,5 ng/mL). Após o tratamento, as células foram processadas de acordo com as instruções do fornecedor do kit de colágeno alfa LISA hPIP (AL353HV, (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA)).

2.10. Ensaio de ativação de transcrição baseado em luciferase Nrf2

Aqui, 6 × 103 células HaCaT em uma 96-placa de poços foram semeadas e cultivadas por 16 h. Depois disso, eles foram submetidos a um ensaio de ativação de transcrição baseado em luciferase Nrf2, usando o kit ARE reporter BPS Bioscience (San Diego, CA, EUA, #60514). Um vetor repórter ARE luciferase pronto para transfecção (contendo um gene de luciferase de vaga-lume sob o controle de elementos responsivos a ARE localizados a montante de um promotor mínimo) juntamente com um controle interno (um vetor Renilla luciferase expressando constitutivamente) foram co-transfectados transitoriamente em células HaCaT usando Reagente de transfecção de DNA HP do gene X-TREME (Roche, Basilea, Suíça, nº 6366244001). Após a transdução por 24 h, as células foram tratadas por 2 h com o extrato (0,0006 por cento, 0,002 por cento e 0,006 por cento p/v) ou o controle positivo Resveratrol (50 µM). Depois disso, eles foram submetidos ao ensaio de luciferase com o Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Rome, Italy #E2920). Resumidamente, as células foram incubadas com substrato de luciferase de vaga-lume por 10 min antes de medir a luminescência em um leitor de placas de 96-poços (Victor Nivo, Waltham, MA, EUA). A proporção de luminescência de vaga-lume e Renilla foi calculada para normalizar e comparar a atividade transcricional de Nrf2.

2.11. Análise da Expressão dos Genes SOD-1(NM_000454.5) e OH-1(NM_002133.3) em Células HaCaT

Para este processo, 1,5 × 105 células HaCaT por poço foram cultivadas em 6-placas de poços por 16 h e incubadas por 6 h com o extrato (0,002 por cento e 0,006 por cento p/v) ou 50 µM de Resveratrol como controle positivo. Ao final da incubação, o RNA total foi extraído usando o kit "GenElute™ Total RNA Purification" (da Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, EUA) e tratado com DNase I (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) a 37 ◦C por 30 min, para remover o contaminante de DNA genômico. 500 ng de RNA total foram retrotranscritos usando a enzima transcriptase reversa (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). RT-PCRs semiquantitativos foram conduzidos usando o par de primers 18S primer/competitor (Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) como padrões internos.Os produtos de PCR foram separados em gel de agarose 1,5% e visualizados usando o instrumento iBright (Invitrogen Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). As sequências dos primers utilizados para amplificação foram as seguintes: HsSOD1Fw: GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG; HsSOD1Rv: ATTGGGCGATCCCAATTACACC; OH-1Fw GAACTTTCAGAAGGGTCAGG; OH-1Rv GCTCAATGTTGAGCAGGAA.

2.12. Ensaio de óxido nítrico em RAW 264.7 estimulado por LPS

A concentração de NO foi determinada em macrófagos murinos RAW 264.7, semeados na concentração de 1,5 × 105 células/poço em placas de 96-poços por 24 h e pré-tratados com o extrato ({{1 0}}0,0006 por cento, 0,002 por cento e 0,006 por cento p/v) ou com 10 µM TPCK (controle positivo) por 2 h, antes da incubação com 2 µg/mL LPS por 18 h. A quantidade de NO, convertida em nitrito, foi calculada pela adição do reagente de Griess (solução de N-(1-naftil)etilenodiamina e ácido sulfanílico, Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e, após 30 min, a absorbância foi medida a 540 nm pelo leitor de placas de poços múltiplos (EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA, EUA)

3. Resultados

3.1. Análise Qualitativa e Quantitativa de Cultura Celular Jasminum sambac Extrato Hidro-Etanólico (JasHEx)

A análise UPLC-MS/MS de JasHEx foi realizada e os dados espectrométricos de alta resolução foram analisados ​​usando Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), um sistema de espectrometria de massa baseado na web que auxilia na anotação de produtos naturais (NPs) [18] . Em particular, uma biblioteca espectral GNPS foi realizada para obter a desreplicação online. As espécies químicas não identificadas pelo GNPS foram atribuídas de acordo com a literatura. Conforme mostrado nas Figuras 1 e 2 e na Tabela 1, foram identificados mais de 50 compostos pertencentes a várias classes de metabólitos secundários, principalmente polifenóis e terpenos. De fato, o extrato de JasHEx contém derivados de ácido fenólico, lignanas (secoisolariciresinol, nortrachelogenina e matairesinol) e triterpenóides (ácido arjunólico, ácido aspártico, ácido maslínico, ácido oleanólico e ácido ursólico).

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