Isquemia in vivo induz oxidação de cardiolipina em mitocôndrias de rim de rato

Resumo Simples

A cardiolipina mitocondrial é um fosfolípido único que desempenha um papel vital na síntese de ATP. Observou-se que a isquemia/reperfusão causa danos às cardiolipinas no coração ou nos tecidos cerebrais; no entanto, poucos dados foram encontrados sobre cardiolipinas renais e danos relacionados após isquemia/reperfusão. O estresse oxidativo desempenha um papel fundamental durante a reperfusão. No entanto, mesmo durante a isquemia, as cardiolipinas podem ser oxidadas. Portanto, nosso objetivo foi avaliar in vivo a oxidação da cardiolipina durante a isquemia renal. A isquemia renal in vivo foi induzida em ratos machos Wistar por um período de 30–60-minutos; nós então isolamos as mitocôndrias renais, extraímos os lipídios e analisamos a cardiolipina aplicando métodos cromatográficos e espectrométricos de massa. Os resultados mostraram que mesmo após 30 min de isquemia in vivo, as quantidades das espécies dominantes de cardiolipina diminuíram quase pela metade, e diminuíram ainda mais ao estender o tempo de isquemia. A cardiolipina foi oxidada com até oito átomos de oxigênio adicionais, produzindo oito espécies diferentes com múltiplas formas isoméricas. Isso mostra que, mesmo após a isquemia, os níveis de cardiolipina são alterados e muitos produtos de oxidação da cardiolipina são produzidos, que também podem ser potencialmente modificados em moléculas de sinalização lipídica mais prejudiciais que podem induzir mais danos às mitocôndrias.

Abstrato

A cardiolipina é um fosfolípido mitocondrial que desempenha um papel significativo na bioenergética mitocondrial. A cardiolipina é oxidada em condições como o estresse oxidativo que ocorre durante a isquemia/reperfusão; entretanto, sabe-se que mesmo durante a isquemia, muitas espécies reativas de oxigênio são geradas. Nosso objetivo foi analisar o efeito da isquemia in vivo na oxidação da cardiolipina. Ratos Wistar machos adultos foram anestesiados; seus abdomes foram abertos e clipes microvasculares foram colocados nas artérias renais por 30, 40 ou 60 min, causando isquemia. Após a isquemia, os rins foram colhidos, as mitocôndrias foram isoladas e os lipídios foram extraídos para análise cromatográfica e espectrométrica de massa da tetralina oleoil cardiolipina e seus produtos de oxidação. A análise cromatográfica e de espectrometria de massa revelou uma diminuição de 47%, 68% e 74% na tetralina oleoil cardiolipina após 30 min, 40 min e 60 min de isquemia renal, respectivamente (p < 0,05). Oito diferentes produtos de oxidação da cardiolipina com até oito oxigênios adicionais foram identificados em mitocôndrias renais de ratos. Um total de 40 min de isquemia causou um aumento médio de 6,9-vezes em todas as formas de cardiolipina oxidada. Apresentamos evidências de que a isquemia renal in vivo isoladamente induz oxidação e depleção de tetralina oleoil cardiolipina em mitocôndrias renais de ratos.

Palavras-chave

cardiolipina; isquemia; oxidação; mitocôndria; rim; estresse oxidativo.

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Introdução

A cardiolipina (CL) é um fosfolipídio único que é encontrado principalmente nas membranas mitocondriais e nas membranas plasmáticas bacterianas [1]. Nas mitocôndrias, a maior parte do CL está localizada na membrana interna (IMM), perfazendo cerca de 20% do conteúdo total de fosfolipídios do IMM [2]. A estrutura desse fosfolipídio é dimérica e inclui quatro cadeias de acil graxo, que dão origem a uma variedade de combinações decadentes de ácidos e espécies moleculares de cardiolipina. Embora muitas espécies de CL sejam encontradas em tecidos de mamíferos, existe uma espécie, tetralinoleil-CL, que é a mais abundante [3,4]. Por exemplo, esta espécie de CL compreende aproximadamente 80% de todas as cardiolipinas nos corações de humanos, roedores e bovinos. Foi observado que o ácido linoleico é o ácido graxo mais abundante nas cardiolipinas que são encontradas nos tecidos do fígado, rins, músculos e baço [5,6]. Esta estrutura única da cardiolipina confere-lhe propriedades e funções especiais dentro das mitocôndrias. O CL participa da morfologia da membrana mitocondrial, bioenergética, transporte de metabólitos, mitofagia, resposta imune e apoptose [7-10]. Talvez uma das funções mais importantes das cardiolipinas seja sua interação com os complexos da cadeia respiratória mitocondrial – a cardiolipina é essencial para sua estabilidade e o funcionamento ideal do sistema de fosforilação oxidativa. Estudos anteriores mostraram que a cardiolipina é necessária para o funcionamento ideal do complexo I, complexo II, complexo III, citocromo c e adenosina trifosfato (ATP) sintase [10-15]. Também foi demonstrado que a cardiolipina pode aumentar a eficiência da fosforilação oxidativa em pelo menos 35% [16]. Assim, qualquer dano à cardiolipina pode causar disfunção mitocondrial e outras cascatas patológicas. Alterações na estrutura e nas quantidades de cardiolipina foram observadas durante patologias como a síndrome de Barth, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas e isquemia/reperfusão miocárdica [3,17–20].

Alterações estruturais na cardiolipina podem ocorrer principalmente durante o estresse oxidativo quando a cardiolipina é oxidada pelo ataque de espécies reativas de oxigênio (ROS). As mitocôndrias são consideradas uma fonte significativa de produção de ROS; portanto, considerando a localização da cardiolipina, bem como seu alto número de ácidos graxos poliinsaturados, o CL torna-se altamente suscetível à oxidação [21,22]. Sob condições fisiológicas, a produção e eliminação de ROS são altamente controladas; no entanto, observou-se que a produção de ROS aumenta em várias condições patológicas, como isquemia/reperfusão, envelhecimento e doenças degenerativas [23]. Foi demonstrado que a isquemia/reperfusão miocárdica causa perda significativa de cardiolipina nas mitocôndrias cardíacas de ratos e atividade reduzida nos complexos da cadeia de transporte de elétrons I, III e IV [11-13]. Curtos períodos de isquemia podem não alterar o sistema antioxidante; no entanto, a isquemia prolongada (por exemplo, 60 min de isquemia cardíaca) danifica a cadeia de transporte de elétrons e aumenta a geração de ERO mesmo quando resta 1,5 por cento de oxigênio [23,24]. O aumento da geração de ERO durante a isquemia já pode induzir a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados no CL com a formação de peróxidos lipídicos e causar mais danos às mitocôndrias.

Muitas pesquisas têm sido feitas analisando as alterações da cardiolipina após isquemia/reperfusão miocárdica [18,19,25,26]. No entanto, não há informações suficientes sobre as implicações da isquemia/reperfusão renal na cardiolipina nas mitocôndrias renais. Como não existem dados sobre as alterações da cardiolipina durante a isquemia renal, este estudo teve como objetivo avaliar as alterações qualitativas e quantitativas da cardiolipina nas mitocôndrias renais após isquemia quente in vivo. Este estudo demonstra que a isquemia renal in vivo causa peroxidação do CL. Várias espécies moleculares de cardiolipina contendo até oito átomos de oxigênio adicionais ligados a ácidos graxos poliinsaturados foram identificadas usando o método de cromatografia líquida de alta performance-espectrometria de massa (UPLC-MS).

Efeitos de Cistanche

Materiais e métodos

1. Animais e Modelo Experimental de Isquemia In Vivo

Os procedimentos experimentais usados ​​no presente estudo foram realizados de acordo com o Comitê Lituano de Boas Práticas de Uso de Animais de Laboratório (No. G{{0}}, 2021-03- 02). Ratos Wistar machos adultos pesando 200–250 g foram alojados em condições padrão de laboratório, mantidos em um ciclo natural de luz e escuridão e tiveram livre acesso a comida e água ad libitum. Os animais foram aclimatados às condições de laboratório antes do experimento. Pentobarbital e cetamina foram usados ​​para realizar a anestesia. Clipes vasculares foram colocados sobre as artérias renais dos ratos para induzir isquemia renal (37 ◦C) in vivo. A isquemia foi confirmada observando a mudança de cor dos rins de vermelho para roxo em ~ 2 min. No final da isquemia (30 min, 40 min ou 60 min), os clipes foram retirados e os rins foram removidos e lavados para retirar o sangue em uma solução fria (0–4 ◦C) de KCl a 0,9 por cento. Em seguida, o tecido renal foi utilizado para o isolamento das mitocôndrias. Ratos sham-operados (grupo controle) foram submetidos a procedimentos cirúrgicos idênticos, exceto pela aplicação de clipes vasculares.

2. Isolamento de mitocôndrias renais

O tecido renal foi cortado em pequenos pedaços e homogeneizado em um meio de isolamento contendo 250 mM de sacarose, 10 mM de Tris HCl e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (pH 7,3). As frações citosólica e mitocondrial foram separadas por centrifugação diferencial (5 min a 750× g e 10 min a 10,000× g, duas vezes), e o pellet foi suspenso em um meio de isolamento. O pellet foi utilizado para determinação de proteínas pelo método do Biureto, determinação da função mitocondrial e extração de fosfolipídios.

3. Determinação da Função Mitocondrial

A função mitocondrial foi determinada para confirmar o dano isquêmico às mitocôndrias. Isso foi feito medindo a respiração mitocondrial (consumo de oxigênio) com o sistema de polígrafo Oroboros{{0}}k em um meio de incubação de 2 mL (150 mM KCl, 10 mM Tris ·Cl, 5 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2 × 6H2O) a pH 7,3 e 37 ◦C. A respiração do estado II (V0) foi medida na presença de 5 mM de glutamato e 5 mM de malato como substratos dependentes do complexo I. A respiração do estado III (V3) foi medida pela adição de 2 mM de difosfato de adenosina (ADP). A permeabilidade da membrana externa mitocondrial foi avaliada pela adição de 32 µM de citocromo c (V3 mais cytc). A respiração foi inibida pela adição de 0,12 mM de carboxiatractilosídeo (Vcat), e as mudanças nas taxas de respiração foram avaliadas, o que indicou alterações na permeabilidade da membrana interna mitocondrial. A aquisição e análise de dados em tempo real foram realizadas com o software Datlab 5 (Oroboros Instruments, Innsbruck, Áustria). As taxas de consumo de oxigênio foram expressas em pmol/s/0,25 mg de proteína mitocondrial. As curvas originais da respiração mitocondrial nos grupos controle e isquêmico (30, 40, 60 min) estão representadas na Figura 1.

Figura 1. Consumo de oxigênio nas mitocôndrias renais nos grupos controle e isquemia. Nas curvas, o traço azul representa a concentração de oxigênio (nmol/mL) e o traço vermelho representa o fluxo de oxigênio (pmol/s/00,25 mg de proteína mitocondrial). Vg: frequência respiratória na presença de 0,5 mg/mL de mitocôndrias (mix) e substratos, 5 mM de glutamato e 5 mM de malato; V3: frequência respiratória máxima após adição de 2 mM de ADP; V3 mais cito: taxa de respiração após adição de 32 uM de citocromo c; Vcat: taxa de respiração após a adição de 0,12 mM de carboxil tractilosídeo. Observou-se que a respiração mitocondrial foi diminuída em todos os grupos de isquemia em relação ao controle.

cistanche tubulosa

4. Extração de fosfolipídios das mitocôndrias renais

A extração de fosfolipídios de mitocôndrias renais foi realizada usando um método de Folch modificado [27]. Um total de 500 µL de suspensão mitocondrial foi misturado com 1 mL de água deionizada, 2 mL de metanol e 4 mL de clorofórmio (1:2:4 vol.). A mistura foi centrifugada à temperatura ambiente na velocidade de 2000 × g por cinco minutos. Os lipídios contendo a fase inferior de clorofórmio foram recuperados e evaporados sob uma corrente de N2 em um frasco de vidro. A fase superior restante foi misturada com 2 mL adicionais de clorofórmio e centrifugada novamente. Depois disso, a fase inferior foi recuperada e adicionada ao frasco de vidro. Esta última etapa foi repetida duas vezes para recuperar o máximo possível de lipídios da mistura. Após concentração em fluxo de N2, o pellet foi ressuspenso em 100 µL de clorofórmio e 500 µL de isopropanol (1:5 vol.) e filtrado através de um filtro de seringa de 45 µm antes da análise.

5. Oxidação do Padrão de Cardiolipina

Cardiolipin standard (cardiolipin sodium salt from bovine heart, >97 por cento (TLC))pó liofilizado, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi oxidado usando um método baseado no relatado por Kagan e Tyurina (28,29). O padrão de cardiolipina foi dissolvido em tampão fosfato (K2HPO{{ 4}} mM, KHPO4 50 mM, H2O duplamente destilada; pH 7,4) e vórtex. A mistura foi colocada em um banho ultrassônico por 3 min para formar vesículas lipídicas. A mistura foi tratada com citocromo c (30 uM) e HO, (400 uM) por uma hora a 37 C em banho-maria. HO foi adicionado a cada 15 min (um total de quatro vezes) durante o período de incubação. Os lipídios foram então extraídos em solvente clorofórmio/metanol usando um método descrito anteriormente.

6. Separação e Avaliação da Cardiolipina

A separação e análise de cardiolipina de nossas amostras padrão e mitocondriais foram realizadas por cromatografia líquida ultra-eficaz—espectrometria de massa (UPLC-MS) usando um cromatógrafo Waters Acquity UPLC acoplado a um espectrômetro de massa Xevo TQD (triplo quadrupolo) com ionização por eletrospray (ESI). Para análise UPLC, uma coluna Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm foi usada. O método utilizado foi baseado no método de par iônico de fase reversa cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa em tandem (HPLC-MS/MS) que foi descrito por Kim et al. [30]. A eluição gradiente usou dois eluentes: eluente A (450 mL de acetonitrila, 50 mL de água, 2,5 mL de trietilamina, 2,5 mL de ácido acético glacial) e eluente B (450 mL de isopropanol, 50 mL de água, 2,5 mL de trietilamina, 2,5 mL de ácido acético glacial). O gradiente de eluição é mostrado na Tabela 1.

7. Análise Estatística

Os dados quantitativos são apresentados como média ± erro padrão. A análise estatística e a visualização gráfica foram realizadas usando o pacote de software SigmaPlot v14.0 (Systat Software Inc., Chicago, IL, EUA). Para a comparação das médias dos grupos, foi aplicada a ANOVA one-way, seguida do teste post hoc de Dunn para o procedimento de comparação múltipla pairwise. Além disso, o teste t de Student/Welch foi usado para cada comparação de média de pares se o teste de normalidade de Shapiro-Wilk fosse aprovado; O teste Mann-Whitney Sum Rank foi usado de outra forma. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Cápsulas Cistanche

Discussão

A isquemia e a reperfusão continuam sendo um grave problema clínico que danifica os órgãos e tecidos afetados. O mecanismo molecular dessa lesão envolve aumento da geração de espécies reativas de oxigênio nas mitocôndrias e peroxidação e depleção de cardiolipina, que por sua vez prejudica a fosforilação oxidativa mitocondrial e a integridade mitocondrial e celular [21,32,33]. O dano mitocondrial já ocorre durante a isquemia e, embora o nível de oxigênio seja reduzido, espécies reativas de oxigênio ainda são geradas em um nível suficiente para oxidar e depletar a cardiolipina [34]. A peroxidação da cardiolipina durante a isquemia-reperfusão tem sido analisada principalmente nas mitocôndrias cardíacas; no entanto, há uma falta de pesquisa feita sobre cardiolipina em mitocôndrias renais.

Este estudo mostra pela primeira vez que a tetralina oleoil cardiolipina é modificada oxidativamente e esgotada em mitocôndrias de rim de rato durante a isquemia renal in vivo. Na primeira etapa, uma tetralina oleoil cardiolipina padrão foi utilizada para oxidação in vitro com citocromo c e peróxido de hidrogênio para a análise dos produtos de oxidação da cardiolipina. Como a cardiolipina interage intimamente com o citocromo c nas mitocôndrias, a cardiolipina pode ser prontamente oxidada pela citocromo c peroxidase [35]. Além disso, Aluri et al. mostraram que durante a isquemia e reperfusão do coração do camundongo, a inibição da parte distal da cadeia de transporte de elétrons, principalmente o complexo IV, evoca a atividade da citocromo c peroxidase, que, juntamente com o peróxido de hidrogênio, pode prontamente oxidar a cardiolipina [36]. Usando UPLC-MS, foram avaliados oito produtos de oxidação da cardiolipina que continham de um a oito átomos de oxigênio adicionais ligados aos ácidos linoléicos. Com base nos resultados da espectrometria de massa, até quatro átomos de oxigênio podem ser encontrados em um único ácido linoleico na forma de hidróxidos ou hidroperóxidos. Achados semelhantes também foram publicados por Kim et al.; no entanto, diferentes agentes oxidantes foram usados, especificamente ar/2,2'-azobis-2-metil-propanimidamida, dicloridrato (AAPH)/fotossensibilizador e luz. Além disso, achados semelhantes também foram publicados por Helmer et al., que aplicaram uma reação de Fenton. Os autores descreveram detalhadamente os produtos de oxidação da cardiolipina com dois e quatro átomos de oxigênio adicionais. Embora Helmer et al. mostraram que até oito átomos de oxigênio foram detectados na cardiolipina, não foram fornecidos mais detalhes sobre o restante das formas de cardiolipina [30,37]. Os padrões de fragmentação iônica foram semelhantes aos descritos neste estudo, o que pode mostrar que a oxidação da cardiolipina com citocromo c e peróxido de hidrogênio segue os mesmos padrões de oxidação. Entre os produtos de oxidação da cardiolipina padrão, a forma dominante foi a cardiolipina com dois átomos de oxigênio adicionais – hidroperóxido de cardiolipina, que também foi observado por Helmer et al. [37]. No entanto, nosso estudo mostra que no cenário in vivo, as quantidades relativas de formas de cardiolipina oxidada podem diferir, uma vez que as formas mais abundantes foram cardiolipina com cinco e quatro átomos de oxigênio adicionais no controle e mitocôndrias de rim de rato isquêmica. Isso indica que o hidroperóxido de cardiolipina ainda pode ser reativo e sofrer oxidação adicional in vivo, produzindo formas de cardiolipina oxidadas um pouco mais estáveis.

No próximo conjunto de experimentos, analisamos as alterações quantitativas e qualitativas da cardiolipina renal de rato após 30-60 min de isquemia in vivo. Em primeiro lugar, foi determinado que os níveis de tetralin oleoyl cardiolipin e trilinoleoyl-monooleoyl cardiolipin são quase os mesmos nas mitocôndrias de rim de rato, o que os torna dominantes. Após 30 min de isquemia in vivo, os níveis de ambas as espécies de cardiolipina diminuem pela metade; no entanto, somente após 30 min e 40 min de isquemia é que a diminuição é significativa para tetralina oleoil cardiolipina. Petrosillo et ai. analisaram a peroxidação de cardiolipina em corações de ratos isquêmicos e demonstraram que 30 minutos de isquemia causaram uma diminuição no conteúdo de cardiolipina em 28% [33]. Resultados semelhantes foram obtidos por Lesnefsky et al. ao analisar mitocôndrias de coração de coelho em condições isquêmicas. Um total de 30 min de isquemia causou uma ligeira diminuição no conteúdo de cardiolipina e citocromo c nas mitocôndrias subsarcolemais; no entanto, nenhuma alteração no conteúdo de cardiolipina ou citocromo c foi observada nas mitocôndrias interfibrilares [25]. Chen e Lesnefsky investigaram ainda mais este modelo de isquemia e descobriram que após 30 e 45 minutos de isquemia, a produção de peróxido de hidrogênio aumentou significativamente, o que significa que a cardiolipina pode ser facilmente oxidada em condições isquêmicas [38]. Também foi demonstrado que mesmo 20 minutos de isquemia renal quente in vitro causaram danos significativos ao sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial, bem como um aumento na atividade do fator pró-apoptótico [39]. No entanto, esses experimentos foram feitos ex vivo/in vitro e, até o momento, poucos experimentos in vivo foram feitos para fornecer qualquer informação sobre as alterações da cardiolipina durante a isquemia isoladamente, especialmente nos rins. Kim e outros. analisaram o conteúdo de cardiolipina no cérebro e coração de ratos após parada cardíaca induzida por asfixia e descobriram que tetralina oleoil cardiolipina é apenas ligeiramente esgotada no coração de ratos, mas não no cérebro, após 30 minutos de parada cardíaca [40]. Liu et ai. induziu 45 min de isquemia renal de rato in vivo e descobriu que as mitocôndrias das células endoteliais dos capilares renais ficavam inchadas com uma perda das membranas das cristas que era atenuada por um peptídeo SS direcionado à cardiolipina-31. Embora os autores não tenham analisado a cardiolipina, seus resultados indicam que a perda de cardiolipina pode ter induzido alterações morfológicas nas mitocôndrias [41].

Não se sabe muito sobre os produtos de oxidação da cardiolipina durante a isquemia, especialmente na isquemia in vivo. Este estudo mostra que a isquemia renal de rato in vivo causa oxidação de tetralina oleoil cardiolipina com até oito átomos de oxigênio adicionais, formando oito produtos de oxidação. Foi demonstrado, por Lesnefsky et al., que 25 minutos de isquemia do coração de ratos envelhecidos causaram um aumento significativo na cardiolipina 1496 Dalton (com três átomos de oxigênio adicionais) nas mitocôndrias subsarcolemais e interfibrilares. Curiosamente, a quantidade dessa espécie de cardiolipina nas mitocôndrias cardíacas de ratos após 25 minutos de isquemia foi maior em comparação com 25 minutos de isquemia seguidos por 30 minutos de reperfusão [26]. Nosso estudo mostrou que esta espécie de cardiolipina oxidada aumenta significativamente após 30 min de isquemia renal in vivo em ratos; no entanto, diminui quase aos níveis de controle após 60 min de isquemia. Tal tendência foi observada com outros óxidos de cardiolipina que tinham quatro, cinco, seis, sete e oito átomos de oxigênio extras. Nossa hipótese é que tempos de isquemia mais longos podem desencadear a hidrólise da cardiolipina oxidada por fosfolipases em várias espécies de lisocardiolipina e peróxidos de ácido linoleico [42,43]. De fato, Smaalen et al. usaram um modelo suíno de desenho clínico de transplante renal com perfusão isquêmica subnortérmica (28 ◦C) e mostraram que a isquemia renal em porcos causa elevação significativa de monolisocardiolipina (trilinoleoil cardiolipina) [44]. Tais monolisocardiolipinas não são mais adequadas para a indução da curvatura da membrana interna mitocondrial, nem se associam a proteínas mitocondriais ou cardiolipina nativa, o que causa diminuição da atividade de fosforilação oxidativa e liberação de citocromo c [45]. Paradies et ai. mostraram que a perda de cardiolipina causou uma diminuição na atividade dos complexos I, III e IV, que foi restaurada com cardiolipina exógena, mas não com monolisocardiolipina ou cardiolipina oxidada [11-13].

extrato de cistanche

Conclusões

Este estudo mostra que a isquemia renal in vivo sozinha causa oxidação severa de cardiolipina e depleção em mitocôndrias renais de ratos. Mais estudos são necessários para avaliar possíveis metabólitos (como monolisocardiolipina, peróxidos de ácido linoleico livre e 4-hidroxinonenal) que podem sair do catabolismo da cardiolipina oxidada e participar da sinalização celular que pode levar à morte das células renais. Além disso, a prevenção da oxidação e depleção de cardiolipina durante a isquemia pode proteger os rins do aumento do dano que ocorre durante a reperfusão.

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Arvydas Strazdauskas 1,2, Sonata Trumbeckaite 1,3, Valdas Jakstas 3,4, Justina Kamarauskaite 3,4, Liudas Ivanauskas 5 e Rasa Baniene 1,2

1 Laboratório de Bioquímica, Instituto de Neurociências, Universidade Lituana de Ciências da Saúde, LT-50162 Kaunas, Lituânia; sonata.trumbeckaite@lsmuni.lt (ST); rasa.baniene@lsmuni.lt (RB)

2 Departamento de Bioquímica, Academia Médica, Universidade Lituana de Ciências da Saúde, LT-50161 Kaunas, Lituânia

3 Departamento de Farmacognosia, Academia Médica, Universidade Lituana de Ciências da Saúde, LT-50162 Kaunas, Lituânia; valdas.jakstas@lsmuni.lt (VJ); justina.kamarauskaite@lsmu.lt (JK)

4 Laboratório de Pesquisa Biofarmacêutica, Instituto de Tecnologias Farmacêuticas, Universidade Lituana de Ciências da Saúde, LT-50162 Kaunas, Lituânia

5 Departamento de Química Analítica e Toxicológica, Academia Médica, Universidade Lituana de Ciências da Saúde, LT-50162 Kaunas, Lituânia; liudas.ivanauskas@lsmuni.lt