Avaliação in vitro da fotorreatividade e fototoxicidade de antioxidantes polifenóis naturais

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Abstrato:Os polifenóis são uma grande família de compostos naturais amplamente utilizados em produtos cosméticos devido às suas propriedades benéficas antioxidantes e anti-inflamatórias e à sua capacidade de prevenir o estresse oxidativo induzido pela radiação UV. Como esses compostos apresentam cromóforos e são aplicados diretamente na pele, podem reagir com a luz solar e exercer efeitos fototóxicos. As informações científicas disponíveis sobre o potencial fototóxico desses compostos naturais são escassas e, portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a fotorreatividade e a fototoxicidade de cinco compostos fenólicos.antioxidantescom uso documentado em produtos cosméticos. Um ensaio padrão de ROS foi validado e aplicado para rastrear a fotorreatividade dos antioxidantes fenólicos naturais ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico,3,4-ácido diidroxifenilacético (DOPAC) e rutina. O potencial de fototoxicidade foi determinado usando uma linhagem de células de queratinócitos humanos (HaCaT), com base no teste de fototoxicidade de 3T3 Neutral Red Uptake. Embora todosantioxidantes fenólicos estudadosabsorveu radiação UV/Vis na faixa de 290 a 700 nm, apenas o DOPAC foi capaz de gerar oxigênio singlete. A geração de espécies reativas de oxigênio é uma reação química em estágio inicial como parte do mecanismo de fototoxicidade. No entanto, nenhum dos compostos estudados diminuiu a viabilidade dos queratinócitos após a irradiação, levando à conclusão de que não possuem potencial fototóxico. Os dados obtidos com este trabalho sugerem que esses compostos são seguros quando incorporados em produtos cosméticos.

Palavras-chave:segurança fotográfica; fotorreatividade; fototoxicidade; polifenóis;antioxidantes fenólicos naturais; espécies que reagem ao oxigênio; queratinócitos; cuidados com a pele; Produtos cosméticos

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Introdução 

Os polifenóis (PPs) constituem um dos grupos de produtos naturais mais numerosos e amplamente distribuídos no reino vegetal. A estrutura química dos PPs é caracterizada pela presença de um ou mais grupos hidroxila fenólicos, ligados a um ou mais sistemas de anéis benzênicos [1]. Os polifenóis exibem uma variedade de atividades biológicas benéficas em humanos, incluindo ação antiviral, antibacteriana, anticarcinogênica, hepatoprotetora, anti-inflamatória e antioxidante.Como antioxidantes, os polifenóis podem proteger os constituintes das células contra os efeitos nocivos oxidativos de espécies reativas de oxigênio (ROS), como oxigênio singlete, superóxido e radicais hidroxila, limitando o risco de várias doenças associadas ao estresse oxidativo [6,7]. Devido às suas propriedades químicas, os PPs são capazes de seqüestrar ROS e quelar íons de metais de transição, como ferro e cobre, o que tem despertado o interesse da indústria cosmética para seu uso em formulações de cuidados com a pele [8-10]. A exposição ultravioleta (UV) é um dos principais fatores indutores do câncer de pele, e as células cutâneas podem ser danificadas diretamente pela radiação UV ou indiretamente pela superprodução de ROS mediada por UV [11]. Estudos experimentais e epidemiológicos sugeriram que os polifenóis protegem a pele dos efeitos adversos da radiação UV através de múltiplas vias [12]. Portanto, vários compostos pertencentes a esta família já são utilizados como ingredientes em diversos produtos cosméticos comerciais disponíveis no mercado [13]. O aumento da demanda dos consumidores por cosméticos naturais incitou a indústria a desenvolver formulações utilizando extratos naturais com ingredientes ativos, como polifenóis, como uma solução promissora e eficaz para o cuidado da pele [13]. No entanto, os cromóforos presentes na estrutura dos polifenóis têm a capacidade de absorver a radiação UV/Vis e sofrer reações químicas resultando em uma cascata de eventos que podem resultar em reações fototóxicas [14]. A fototoxicidade é definida como uma resposta tóxica desencadeada por produtos químicos fotorreativos administrados tópica ou sistemicamente após a exposição do corpo à luz ambiental [15]. Ingredientes farmacêuticos ativos e excipientes para administração sistêmica, formulações clínicas para aplicação tópica, adesivos dérmicos, entre outros, possuem potencial fototóxico e podem causar reações fototóxicas notáveis. Consequentemente, as agências reguladoras, FDA dos EUA, EMA da UE e ICH, fornecem diretrizes de segurança fotográfica, introduzindo métodos de teste e estratégias de avaliação [15-17]. A avaliação da segurança dos produtos cosméticos é obrigatória de acordo com a legislação da União Europeia [18]. A avaliação de segurança exigida inclui estudos toxicológicos relevantes sobre ingredientes cosméticos, incluindo uma avaliação de toxicidade foto-induzida [18]. Como os testes em animais foram proibidos para produtos cosméticos, vários testes de segurança fotográfica in vitro foram propostos nos últimos anos, incluindo análise de espectro UV, um teste de fototoxicidade de absorção de vermelho neutro 3T3 (3T3 NRU PT) e uma espécie reativa de oxigênio ( ensaio ROS) [18-20]. O ensaio ROS foi projetado para avaliação de fotorreatividade de drogas, cujo princípio é monitorar reações fotoquímicas nos produtos químicos de teste expostos à luz solar simulada [19,20]. Por meio dessas reações fotoquímicas, ROS, como ânion superóxido e oxigênio singlete, podem ser gerados, e esses processos fotoquímicos podem ser um gatilho para a fototoxicidade induzida por drogas [19,20]. Altos níveis de ROS podem causar citotoxicidade através de danos ao DNA, lipídios e proteínas pelo estresse oxidativo.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlA metodologia in vitro 3T3 NRU-PT utiliza a linha celular de fibroblastos de camundongo Balb/c 3T3 e a captação de vermelho neutro como o ponto final de citotoxicidade. A fototoxicidade é então determinada pela redução relativa da viabilidade das células expostas ao produto químico em estudo na presença e na ausência de luz que simule a luz solar. Estudos relatados na literatura concluíram que este teste é supersensível, prevendo erroneamente os riscos de segurança fotográfica de animais e humanos, levando a um alto número de falsos positivos quando comparados aos resultados in vivo [21-23]. Considerando essa limitação, uma modificação da metodologia 3T3 NRU-PT foi proposta por nosso grupo com base no uso de uma linhagem de células de queratinócitos humanos (HaCaT) [24]. Uma vez que esta metodologia utiliza células de queratinócitos humanos, representa um modelo mais realista, uma vez que estas são as células mais abundantes presentes na camada externa da pele, onde são aplicados compostos tópicos e expostos à radiação solar [24]. O objetivo do presente estudo foi estimar o potencial de toxicidade foto-induzida dos polifenóis naturais ácido p-cumárico, ácido cafeico, ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC), ácido ferúlico e rutina (Figura 1), que já são usados ​​como ingredientes cosméticos ou estão sendo considerados devido às suas interessantes propriedades químicas e antioxidantes [25-27]. Um ensaio ROS foi validado e implementado para a avaliação exploratória de fotosegurança dos compostos, e sua citotoxicidade e fototoxicidade foram ainda avaliadas usando uma linhagem de células de queratinócitos humanos (HaCaT).

2. Resultados e Discussão 

A consideração inicial para a avaliação do potencial fotorreativo é se um composto absorve fótons em qualquer comprimento de onda entre 290 e 700 nm. Um composto que tem um coeficiente de extinção molar (MEC) maior que 1000 L mol−1 cm−1 em qualquer comprimento de onda entre 290 e 700 nm é considerado suficientemente fotorreativo para resultar em fototoxicidade direta [15]. Os espectros de absorção dos ácidos cafeico, p-cumárico e ferúlico, DOPAC e rutina em DMSO na luz UV-visível são mostrados na Figura 2. Todos os compostos absorvem na faixa espectral de 200 a 700 nm, com comprimento de onda máximo em ou acima de 290 nm e com MEC tipicamente maior que 4000 L mol−1 cm−1 (Tabela 1). Os polifenóis são compostos biológicos contendo sistemas conjugados π com grupos hidroxila fenólicos. As transições eletrônicas dos orbitais moleculares do tipo π são responsáveis ​​pelo espectro UV-visível deste grupo de compostos [28]

Todos os compostos testados apresentaram MEC superior a 1000 L mol−1 cm−1, o que significa que todos são possíveis compostos fototóxicos que merecem ser estudados [15]. Antes de realizar o ensaio de ROS, o simulador solar foi avaliado e as condições experimentais foram otimizadas para garantir que os valores medidos de oxigênio singlete (SO) e ânion superóxido (SA) estivessem próximos aos mencionados na literatura [29]. A otimização do ensaio de geração de ROS foi realizada usando controles positivos e negativos e um estudo de viabilidade foi realizado usando produtos químicos de referência. Nas condições experimentais utilizadas, todas as substâncias testadas no estudo de viabilidade atenderam aos critérios de aceitação dando valores para SO e SA dentro das faixas de valores admissíveis [29].

O ensaio de ROS foi realizado para os compostos polifenólicos, e a capacidade das substâncias testadas em gerar ROS, na concentração de 200 µM, é mostrada na Tabela 2. Tabela 2. Os resultados foram obtidos para os compostos testados usando o ensaio de ROS.

Os resultados obtidos mostram que, com exceção do DOPAC, todos os compostos podem ser classificados como não fotorreativos. Embora essas substâncias tenham apresentado absorção de luz UV-visível e MEC superior a 1000 L mol−1 cm−1, elas não geraram ROS nas condições testadas, tanto das espécies SO quanto SA. Surpreendentemente, o DOPAC foi capaz de induzir a geração de espécies SO e, portanto, foi classificado como fotorreativo, apesar deste composto apresentar o menor valor de MEC na faixa UV-visível entre todos os compostos estudados. Mais estudos são necessários para entender os resultados obtidos para o DOPAC, o que também pode ser importante, em um futuro próximo, para estabelecer uma correlação entre a estrutura química de um composto e sua capacidade de ser fotorreativo. Foi avaliada a citotoxicidade do DMSO utilizado para avaliação dos efeitos fototóxicos, na presença e ausência de irradiação, após 1h de exposição. Para a placa não irradiada, o DMSO não apresentou diferença estatisticamente significativa em relação aos controles negativos. No entanto, para a placa irradiada, houve diferença significativa entre o DMSO 1 por cento e o controle de solvente em relação aos controles negativos (p < 0,0001),="" o="" que="" justificou="" o="" uso="" do="" controle="" de="" solvente="" em="" todos="" os="" experimentos="" para="" garantir="" que="" as="" diferenças="" na="" viabilidade="" celular="" foram="" atribuídas="" apenas="" aos="" compostos="" em="" estudo.="" para="" garantir="" a="" viabilidade="" do="" ensaio="" de="" fototoxicidade="" usando="" uma="" linhagem="" de="" células="" de="" queratinócitos="" humanos="" (hacat),="" 5-metoxipsoraleno,="" cloridrato="" de="" clorpromazina="" e="" quinina="" foram="" testados="" como="" controles="" positivos,="" e="" ácido="" acetilsalicílico,="" hexaclorofeno="" e="" lauril="" sulfato="" de="" sódio="" como="" controles="" negativos="" [24].="" os="" resultados="" obtidos="" a="" partir="" do="" ensaio="" de="" fototoxicidade="" comparando="" a="" viabilidade="" celular="" das="" células="" hacat,="" irradiadas="" e="" não="" irradiadas,="" na="" presença="" dos="" compostos="" (poli)fenólicos="" testados="" estão="" representados="" na="" figura="" 3.="" as="" faixas="" de="" concentração="" dos="" produtos="" químicos="" testados="" na="" presença="" (irr="" plus="" )="" e="" a="" ausência="" (irr−)="" de="" luz="" foram="" determinados="" em="" experimentos="" de="" determinação="" de="" faixa="" de="" dose,="" considerando="" a="" concentração="" máxima="" de="" 1000="" µm.="" uma="" série="" geométrica="" de="" diluições="" foi="" utilizada="" e="" ajustada,="" quando="" necessário,="" em="" função="" da="" concentração-resposta="" na="" presença="" e="" ausência="" de="" irradiação.="" dentro="" da="" faixa="" de="" concentração="" testada="" (12,5;="" 31,25;="" 62,5;="" 125;="" 250;="" 500="" e="" 1000="" µm)="" nenhuma="" das="" substâncias="" de="" teste="" induziu="" uma="" diminuição="" de="" 50="" por="" cento="" na="" viabilidade="" celular,="" portanto,="" não="" foi="" possível="" calcular="" os="" valores="" de="" ic50="" e="" pif="" correspondentes="" .="" ao="" contrário,="" foi="" possível="" perceber="" um="" aumento="" dose-dependente="" na="" viabilidade="" das="" células="" irradiadas="" na="" presença="" das="" substâncias="" testadas,="" possivelmente="" devido="" aos="" efeitos="" fotoprotetores="" desses="" antioxidantes="" contra="" o="" dano="" oxidativo="" induzido="" pela="" radiação="" levando="" a="" um="" maior="" percentual="" de="" células="" viáveis="" ​​quando="" comparado="" ao="" controle="" (células="" irradiadas="" não="" tratadas).="" é="" descrito="" na="" literatura="" que="" a="" radiação="" uv="" leva="" à="" geração="" de="" eros,="" superprodução="" de="" óxido="" nítrico="" e="" depleção="" das="" defesas="" antioxidantes="" nos="" queratinócitos="" [30].="" por="" esses="" motivos,="" polifenóis="" com="" capacidade="" antioxidante="" têm="" sido="" estudados="" como="" agentes="" fotoprotetores.="" embora="" a="" maioria="" dos="" estudos="" se="" concentre="" na="" capacidade="" fotoprotetora="" dos="" polifenóis,="" eles="" não="" estudaram="" seu="" potencial="" fototóxico.="" estudos="" anteriores="" confirmaram="" a="" capacidade="" dos="" ácidos="" cafeico,="" ferúlico="" e="" p-cumárico="" de="" eliminar="" ros="" e="" espécies="" reativas="" de="" nitrogênio="" (rns).="" além="" disso,="" a="" proteção="" contra="" os="" efeitos="" deletérios="" da="" radiação="" uv="" também="" foi="" estabelecida="" in="" vivo="" ou="" células="" da="" pele="" para="" esses="" três="" compostos="" fenólicos="" [31-34].="" esses="" dados="" podem="" explicar="" o="" aumento="" da="" porcentagem="" de="" células="" viáveis="" ​​quando="" expostas="" à="" irradiação="" na="" presença="" dos="" compostos="" em="" estudo.="" a="" rutina,="" assim="" como="" os="" ácidos="" cafeico,="" ferúlico="" e="" p-cumárico="" testaram="" negativo="" no="" ensaio="" de="" geração="" de="" ros="" e="" não="" induziram="" fototoxicidade="" na="" linhagem="" de="" células="" hacat.="" existem="" algumas="" informações="" contraditórias="" na="" literatura="" quanto="" ao="" potencial="" fototóxico="" da="" rutina,="" daí="" o="" interesse="" dos="" resultados="" obtidos.="" a="" avaliação="" do="" potencial="" fototóxico="" usando="" um="" sistema="" de="" células="" de="" queratinócitos="" (hacat),="" mostrou="" que="" a="" rutina="" demonstrou="" fototoxicidade="" [35].="" ao="" contrário,="" usando="" uma="" configuração="" experimental="" que="" emprega="" eletroforese="" capilar="" com="" detecção="" eletroquímica="" e="" uv="" para="" testar="" a="" fototoxicidade="" de="" extratos="" e="" componentes="" vegetais="" em="" termos="" de="" consumo="" de="" oxigênio="" e="" geração="" de="" espécies="" reativas="" de="" oxigênio="" sob="" irradiação="" com="" luz="" visível,="" foi="" possível="" concluir="" que="" a="" rutina="" foi="" não="" fototóxico="" [36],="" o="" que="" está="" de="" acordo="" com="" os="" resultados="" obtidos="" neste="" trabalho="" onde="" a="" rutina="" não="" apresentou="" fotorreatividade,="" pois="" não="" gerou="" nem="" so="" nem="" sa="" no="" ensaio="" de="" geração="" de="" ros.="" por="" outro="" lado,="" neste="" trabalho="" também="" foi="" demonstrado="" que="" a="" rutina="" por="" si="" só="" não="" apresenta="" potencial="" fototóxico="" na="" linhagem="" celular="" hacat.="" esses="" achados="" contraditórios="" destacam="" a="" importância="" do="" uso="" de="" condições="" de="" teste="" padronizadas="" e="" também="" o="" uso="" de="" uma="" fonte="" de="" luz="" apropriada="" para="" evitar="" resultados="" enganosos.="" curiosamente,="" e="" apesar="" da="" semelhança="" estrutural="" entre="" o="" dopac="" e="" os="" demais="" pps="" estudados,="" o="" dopac="" gerou="" so="" no="" ensaio="" de="" geração="" de="" ros="" e="" foi="" classificado="" como="" fotorreativo.="" no="" entanto,="" quando="" testado="" na="" linhagem="" celular="" hacat,="" o="" dopac="" mostrou-se="" não="" fototóxico.="" pelos="" resultados="" obtidos,="" o="" dopac="" parece="" ser="" fotorreativo,="" mas="" não="" fototóxico,="" portanto="" não="" se="" espera="" que="" ocorram="" reações="" fototóxicas="" após="" a="" aplicação="" tópica="" deste="">

3. Materiais e Métodos

3.1. Reagentes

3,4-ácido diidroxifenilacético (DOPAC), ácido cafeico, ácido transferúlico, ácido p-cumárico, rutina, cloridrato de clorpromazina, hidrogenofosfato dissódico dodecahidratado, fosfato de sódio monobásico monohidratado, vermelho neutro (NR) e dimetilsulfóxido (DMSO) foram adquiridos da Sigma–Aldrich (Madri, Espanha). Cloridrato de quinina, benzocaína, diclofenaco e eritromicina foram adquiridos da Acofarma (Madri, Espanha). A linha celular imortalizada de queratinócitos humanos (HaCaT) foi obtida de Cell Lines Service (CLS) (Eppelheim, Alemanha). Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/L de D-glicose, L-glutamina, 25 mM de HEPES e DMEM com 4,5 g/L de D-glicose, L glutamina, 25 mM de HEPES sem vermelho de fenol, solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), Soro Fetal Bovino (FBS) e tripsina EDTA foram adquiridos da Gibco Life Technologies (Waltham, MA, EUA). O etanol foi fornecido pela Aga (Lisboa, Portugal). N, N-Dimetil-4-nitroguanidina (RNO), imidazol e Nitro Blue Tetrazólio (NBT) foram adquiridos da Alfa Aesar (Kandel, Alemanha).

3.2. Absorção Espectral 

O espectro de absorção de cada composto estudado foi determinado na faixa de 290 a 700 nm, de acordo com o OECD Test Guideline 101, usando um espectrofotômetro Jasco V650 UV/VIS [37]. As substâncias foram dissolvidas em DMSO para obter uma concentração final de 10 µg/mL e os espectros de absorção foram medidos usando cubetas de quartzo transparente UV (comprimento do caminho=10 mm). Cada espectro foi corrigido para absorção de linha de base específica do solvente. Os coeficientes de extinção molar (MEC) foram calculados usando os maiores picos de absorção de 290 a 700 nm [15].

3.3. Ensaio de Espécies de Oxigênio Reativo (ROS) 

O protocolo de ensaio de ROS foi estabelecido e os estudos de validação foram conduzidos de acordo com o procedimento descrito na literatura [19,29]. As soluções estoque de todas as substâncias testadas foram preparadas na concentração de 10 mM em DMSO e usadas no mesmo dia, protegidas da luz. Resumidamente, a geração de oxigênio singlete (SO) foi detectada por medição espectrofotométrica do branqueamento de p-nitrosodimetilanilina (RNO) a 440 nm usando imidazol como um aceptor seletivo de oxigênio singlete. Amostras, contendo o produto químico testado (200 µM), RNO (50 µM) e imidazol (50 µM) em tampão fosfato de sódio 20 mM (PB, pH 7,4), foram colocadas em um tubo e misturadas com um misturador de vórtice e sonicadas, protegido da luz, por 10 min. A mistura foi transferida para uma célula de vidro de quartzo Hellma de alto desempenho e verificada a precipitação sob um microscópio antes da exposição à luz. Em seguida, as amostras foram irradiadas usando um simulador solar termostático Fitoclima S600PL (Aralab, Portugal), equipado com oito lâmpadas UV-Vis Repti Glo (20 W), por 90 min a 25 ◦C. Após irradiação, a absorbância foi lida novamente em 440 nm. A geração de ânion superóxido (SA) foi detectada observando a redução de nitroazul tetrazólio (NBT) a monoformazan (NBT plus ), cuja formação pode ser monitorada espectrofotometricamente em 560 nm. Amostras contendo os compostos testados (200 µM) e NBT (50 µM) em NaPB 20 mM foram irradiadas, e a redução em NBT foi medida pelo aumento da absorbância em 560 nm da mesma maneira que para determinação de SO. As experiências foram realizadas em triplicado. Como o simulador solar utilizado era diferente dos modelos recomendados, foi necessário validar as condições de irradiação. Um ensaio de ROS foi realizado para garantir que as condições de irradiação satisfizessem os critérios recomendados usando controles positivos (quinina) e negativos (sulisobenzona) e compostos químicos de referência [29]. De acordo com o resultado (média das determinações em triplicado) do ensaio ROS, os compostos polifenólicos testados foram classificados como substâncias fotorreativas quando foi medido um valor de SO 25 ou mais e/ou um valor de SA de 20 ou mais; por sua vez, foi determinado como substância não fotorreativa quando foram registrados valores inferiores a 25 para SO e inferiores a 20 para SA [29].

3.4. Cultura de células 

As células HaCaT foram mantidas a 37 ◦C em uma atmosfera umidificada de 95 por cento de ar e 5 por cento de CO2 na incubadora em DMEM com 10 por cento de FBS e 1 por cento de antibióticos. Usando um microscópio invertido, a confluência celular foi observada e se as células atingiram 7{85}}–80 por cento de confluência, a subcultura foi feita para evitar a morte celular. Para isso, o meio de cultura foi aspirado e as células foram lavadas com DPBS, 2 mL de tripsina 0,25 por cento foram adicionados e incubados por 7 a 8 min a 37 ◦C em atmosfera de 5 por cento de CO2. Após a separação das células, um meio fresco foi adicionado para bloquear a ação da tripsina. Para contagem de células, 10 µL de suspensão de células foram colocados em uma câmara de Neubauer onde as células foram contadas. A suspensão de células obtida foi então subdividida em novos frascos com meio de cultura de células fresco. Para o congelamento das células, DMSO (5 por cento v/v) foi usado como crioconservante para evitar a formação de cristais durante a fase de armazenamento. Para determinar o tempo necessário para a duplicação das células, 1 × 106 células foram semeadas em cinco frascos de 75 cm2 e incubadas por 24 h a 37 ◦C em atmosfera de 5% de CO2 para atingir a aderência completa. Em seguida, as células de cada frasco foram contadas em tempos diferentes. Os resultados foram plotados em um gráfico representando número de células versus tempo, a partir do qual o tempo de duplicação foi calculado usando análise de regressão linear. O tempo de duplicação calculado obtido foi de 20,43 h, o que está de acordo com os valores relatados na literatura, confirmando assim que as células utilizadas estavam em condições normais de crescimento [38]. 3.5. Ensaio de fototoxicidade Para o estudo de fototoxicidade, foi seguido um protocolo anterior implementado em nosso laboratório [24]. A altura da lâmpada UVA/UVB Osram (240V E27) foi ajustada para irradiar as células com uma dose de irradiação UVA de 1,7 mW/cm2 (Cosmedico radiometer, UVM-7), de acordo com a diretriz da OCDE [23] . Durante a irradiação (10 min), as placas foram mantidas dentro de um recipiente de isopor contendo um sistema de resfriamento a água, e a temperatura foi monitorada durante todo o procedimento. Resumidamente, para realizar o ensaio de absorção de NR, as células HaCaT foram semeadas (2 × 104 células/poço) e incubadas a 37 ◦C em uma atmosfera de 5 por cento de CO2 por 24 h. Em seguida, o meio foi removido, diferentes concentrações das substâncias de teste foram adicionadas e as células foram incubadas nas mesmas condições por 1 h. Uma placa foi mantida no escuro enquanto a outra placa foi irradiada por 10 min com a temperatura mantida em 29–32 ◦C. Depois, o meio de células foi substituído por DMEM fresco sem vermelho de fenol e incubado por 18-22 h. Após este período de incubação, as células de ambas as placas foram lavadas com DPBS e DMEM completo contendo 50 µg/mL de NR foi adicionado a cada poço e incubado por 3 h. Após incubação com NR, a solução de NR foi removida e uma solução de NR desorb (50 por cento de etanol: 1 por cento de ácido acético: 49 por cento de água destilada) foi adicionada para extrair o corante de NR das células. Para o procedimento de leitura, a absorbância foi medida em 540 nm. Dentro de cada placa, os controles de DMSO foram testados. Os dados de viabilidade celular obtidos de cada placa foram expressos como a razão de absorbância de células tratadas para células de controle de solvente e foram ainda usados ​​para estimar os valores de IC50 usando análise de regressão linear. O valor do Fator de Foto-Irritação (PIF) para cada substância de teste foi calculado como a razão entre o valor de IC50 das células irradiadas (Irr mais ) versus o valor de IC50 das células não irradiadas (Irr−). De acordo com a diretriz da OCDE, um índice PIF inferior a 2 prevê a ausência de um efeito fototóxico, um índice PIF entre 2 e 5 prevê um provável efeito fototóxico e um PIF superior a 5 prevê um efeito fototóxico [23]. Os compostos testados foram avaliados em uma faixa de concentrações: 12,5; 31,25; 62,5; 125; 250; 500 e 1000 µM. 3.6. Análise estatística Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão (SD) de pelo menos três experiências independentes realizadas em triplicado. Para confirmar a normalidade e homogeneidade da variância, foi utilizado o teste de normalidade omnibus de D'Agostino–Pearson e, posteriormente, a análise de variância One-way (ANOVA), seguida do teste post hoc de Dunnett (comparação com células de controle negativo com solvente), foi realizada. Os gráficos foram gerados com o software GraphPadPrism for Windows (versão 6.0, GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA, EUA).

4. Conclusões

Neste estudo, um ensaio de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) e um ensaio de Fototoxicidade de 3T3 Neutral Red Uptake (3T3 NRU-PT) foram usados ​​para examinar o comportamento de antioxidantes fenólicos naturais quando expostos à radiação que mimetiza a luz solar, a fim de examinar sua fotorreatividade e fototoxicidade. potencial. Os resultados obtidos permitiram concluir que, embora a rutina e os ácidos cafeico, p cumárico e ferúlico absorvam a radiação UV-visível e apresentem CEM superior a 1000 L mol−1cm−1, são classificados como não fotorreativos. Além disso, esses compostos não induziram fototoxicidade quando testados com a linhagem celular HaCaT. Os dados encontrados sugerem queesses antioxidantespor si só não são esperados para causar fototoxicidade e, portanto, podem ser considerados seguros para uso em formulações cosméticas. Por outro lado, foi possível observar um aumento na viabilidade das células expostas à radiação quando na presença desses antioxidantes revelando um possível efeito fotoprotetor que poderia ser interessante estudar para fundamentar seu uso como possíveis agentes fotoprotetores em formulações cosméticas. No caso do DOPAC, este composto mostrou-se fotorreativo, embora não tenha sido observada fototoxicidade no ensaio de Captação do 3T3 Neutral Red. No entanto, mais estudos devem ser realizados para entender os mecanismos por trás da fotorreatividade do DOPAC, para garantir sua fotosegurança e também para compreender o papel e a relação entre a estrutura química e o potencial de um composto ser fotorreativo. Contribuições dos Autores: Análise Formal, BA; Redação—Preparação do Projeto Original, BA; Conceituação IFA, HC e JG: Recursos, IFA, HC, JMSL e JG; Redação—Revisão e Edição, IFA, HC, JMSL e JG; Supervisão, IFA, HC e JG; Aquisição de financiamento, IFA, HC, JMSL e JG Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.Financiamento: Esta pesquisa não recebeu financiamento externo.Declaração do Conselho de Revisão Institucional: Não aplicável.Declaração de consentimento informado: Não aplicável.Dados Declaração de Disponibilidade: Todos os dados apresentados neste estudo estão contidos no artigo.Agradecimentos: Este trabalho é financiado por fundos nacionais da FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, IP, no âmbito do projeto UIDP/04378/2020, UIDB /04378/2020 da Unidade de Investigação em Biociências Moleculares Aplicadas-UCIBIO e o projeto LA/P/0140/2020 do AssociateLaboratory Institute for Health and Bioeconomy-i4HB e UIDB/00081/2020 financiado pela FCT/MCTES (PIDDAC). Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesse. Disponibilidade da amostra: Não aplicável.

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