Hipotermia induzida por oxcarbazepina após isquemia transitória do prosencéfalo exerce neuroproteção terapêutica por meio de potencial receptor transitório vanilóide tipo 1 e 4 em gerbos, parte 3

4. Materiais e Métodos

4.1. Animais Experimentais

Gerbilos machos (número total=252) foram utilizados aos 6 meses de idade (peso corporal, 63-78 g). Os gerbos foram criados no Centro de Animais Experimentais da Universidade Nacional Kangwon (Chuncheon, Coreia).

Gerbils são animaizinhos muito fofos. Eles vivem em áreas desérticas, são bons em cavar cavernas e têm fortes instintos para armazenar e localizar alimentos. Entre esses pequeninos, os gerbos machos têm uma memória particularmente boa, o que faz com que as pessoas queiram conhecer seus segredos.

Primeiro, quando os gerbos machos procuram comida, utilizam uma série de sinais, como pontos de referência e terreno, para determinar a direção. Através da observação e da prática a longo prazo, estabeleceram o seu próprio “sistema de informação geográfica”. Em contraste, os gerbilos fêmeas têm uma memória pior para estes sinais, especialmente num ambiente em constante mudança.

Em segundo lugar, os gerbos machos também apresentam uma memória forte quando lutam contra inimigos naturais. Segundo os cientistas, quando os gerbos são ameaçados, eles entram rapidamente na toca e tentam escapar. Mas quando enfrentam a mesma ameaça, os gerbos machos lembram-se do modo de ataque dos inimigos naturais e evitam-nos, aumentando as suas hipóteses de sobrevivência.

Finalmente, a memória dos gerbos machos também reside no comportamento social entre eles. Cada gerbil tem seu cheiro único. Quando encontrarem outros gerbos, eles usarão o olfato para identificar a identidade e o status um do outro. Esta capacidade de memória não só permite aos gerbilos estabelecer uma ligação social relativamente estável, mas também é uma garantia importante para a sua reprodução.

Em resumo, a relação entre gerbos machos e memória é inseparável. No processo de busca de sobrevivência e reprodução na natureza, contam com sua forte memória para se adaptarem constantemente ao meio ambiente e se aprimorarem. Como humanos, devemos aprender com esses pequeninos e aprimorar constantemente nossa memória para nos adaptarmos melhor a este mundo em constante mudança. Percebe-se que precisamos melhorar nossa memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento, que são muito importantes para a memória e o aprendizado. Além disso, Cistanche também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro obtenha nutrição e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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Para este estudo, o protocolo experimental foi aprovado (aprovação nº KW-200113-1; data de aprovação, 18 de fevereiro de 2020) pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais.

O protocolo de pesquisa seguiu as diretrizes sugeridas nas "Leis e Políticas Internacionais Atuais" do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pela The National Academies Press (8ª Ed., 2011).

4.2. Grupos Experimentais, Indução de tFI e Tratamentos HyT e OXC

Para comprovar os efeitos protetores do OXC contra lesão isquêmica após tFI em gerbilos, os gerbilos foram divididos em seis grupos: (1) grupo simulado + veículo (n=24); (2) grupo tFI + veículo (n {{5 }}); (3) grupo sham+HyT (n=24); (4) grupo tFI+HyT (n=60);(5) grupo sham+OXC (200 mg/kg) (n=24); e (6) grupo tFI+OXC (n=60).

Sete e cinco gerbilos nos três grupos tFI foram utilizados para análise Western blot e exame histológico, respectivamente, aos 30 min, 12 h, 1 dia, 2 dias e 4 dias após a operação tFI, e nos três grupos sham, sete e cinco gerbilos foram usados ​​30 minutos e 4 dias após a operação simulada para minimizar os números. Neste experimento, o tFI foi desenvolvido conforme descrito anteriormente [34].

Em resumo, os gerbilos foram anestesiados com isoflurano a 2,5% (em 32% de oxigênio e 68% de óxido nitroso). Sob anestesia, ambas as artérias carótidas comuns foram isoladas da bainha carótida e ocluídas com clipes de aneurisma (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Tuttlingen, Alemanha ) por cinco minutos.

A parada perfeita do suprimento sanguíneo para o cérebro foi confirmada através da observação do fluxo sanguíneo arterial em ambas as artérias da retina (ramos das artérias carótidas internas) utilizando um oftalmoscópio (HEINE K180®) da Heine Optotechnik (Herrsching, Alemanha).

A temperatura corporal antes e durante a cirurgia em todos os grupos foi controlada em normotermia (37 ± 0,2 ◦C) por meio de manta termométrica. Após cinco minutos de oclusão, os clipes foram retirados.

Neste estudo, uma operação simulada foi realizada submetendo-os à mesma cirurgia tFI sem a oclusão das artérias carótidas comuns. O HyT nos dois grupos sham+HyT e tFI+HyT foi controlado (semelhante à mudança na temperatura corporal no grupo tFI+ Grupo OXC) por resfriamento de todo o corpo com bolsa de gelo por seis horas.

A temperatura corporal dos dois grupos sham + OXC e tFI + OXC foi registrada por seis horas após injeção intraperitoneal imediata de 200 mg/kg de OXC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) após a operação tFI.

A dosagem de OXC foi selecionada com base em um estudo anterior relatando que 200 mg/kg de OXC protegeram efetivamente contra a morte celular no cérebro após o [36]. Para registrar a mudança de temperatura corporal, a temperatura corporal foi medida no reto a cada uma hora após tFI, mais um período de 6 horas, em temperatura ambiente (cerca de 22 ◦C).

Os gerbos receberam um tempo de recuperação de quatro dias após o tFI porque as células piramidais localizadas na região CA1 do hipocampo começam a morrer quatro dias após o tFI [30,34,62].

4.3. Teste SMA

O teste SMA foi realizado para examinar alterações na hiperatividade em todos os grupos. Resumindo, conforme descrito anteriormente [63], o teste SMA foi realizado no Dia 1 após o tFI, uma vez que a atividade locomotora atinge o ponto mais alto no Dia 1 após a lesão isquêmica após o tFI.

Os gerbilos de todos os grupos receberam adaptação ambiental por duas horas e foram colocados em uma gaiola de campo aberto (largura, 44 cm; comprimento, 44 ​​cm; altura, 30) obtida de Ugo Basile SRL (Gemonio, Itália), na qual duas linhas horizontais paralelas Foram instalados feixes infravermelhos 4 × 8 acima do chão, durante uma hora. A SMA foi registrada usando um Photobeam Activity System-Home Cage da San Diego Instruments (San Diego, CA, EUA).

O movimento (trajetória e distância total percorrida) foi detectado através da interrupção do conjunto de feixes infravermelhos produzidos pelas fotocélulas.

A SMA foi monitorada continuamente por uma hora e os dados foram coletados usando um analisador AMB da IPC Electronics (Cumbria, Reino Unido).

A coleta de dados foi iniciada 15 minutos após a habituação na gaiola de campo aberto. Por fim, os resultados obtidos foram avaliados como a distância (metros) de movimento no período de teste (uma hora).

4.4. Testes de Funções Cognitivas

4.4.1. RAMT

Para comparar a memória espacial entre todos os grupos, o RAMT foi realizado de acordo com estudos anteriores [38,44]. Um labirinto de braço radial 8-da Stoelting Co (Wood Dale, IL, EUA) foi usado para este teste.

O instrumento do labirinto consistia em uma plataforma central e oito braços (largura de cada braço, 5 cm; altura, 9 cm; comprimento, 35 cm). Os gerbos foram treinados uma vez por dia durante três dias antes do.

Nomeadamente, a ração granulada obtida da DBL Co (Chungbuk, Coreia) foi colocada na extremidade de cada braço e cada gerbil foi colocado na plataforma central.

Após a operação simulada ou tFI, o teste real foi realizado uma vez por dia durante quatro dias, começando um dia após a operação.

Para a análise, foi avaliado o número de erros, ocorrendo um erro cada vez que o gerbil entrava em um braço que já havia sido visitado anteriormente. O teste foi finalizado quando o gerbil consumiu a ração.

4.4.2. PAT

Para comparar a memória de curto prazo entre os grupos, o PAT foi conduzido de acordo com métodos relatados anteriormente [64,65] com algumas modificações. Em suma, os gerbilos foram testados usando o Gemini Eviteance System (GEM 392) da San Diego Instruments (SanDiego, CA, EUA), que consiste em dois compartimentos (escuro e claro) que se comunicam entre si através de uma porta deslizante verticalmente.

As sessões experimentais foram realizadas em duas fases: uma sessão de treinamento e uma sessão de teste real realizada um dia antes e quatro dias após a operação tFI ou simulação.

O teste real foi realizado 20 minutos após a sessão de treinamento, medindo o tempo de latência (segundos) durante a permanência na sala escura. Ou seja, na sessão de treinamento, o gerbil foi autorizado a explorar livremente os dois compartimentos por um minuto enquanto o portão era aberto. .

Depois disso, quando o gerbil entrou no compartimento escuro, a porta foi fechada e o gerbil recebeu um choque elétrico no pé (0,5 mA) de uma grade de aço no chão durante cinco segundos.

Na sessão de teste real, no dia 4 após o tFI, o gerbil foi colocado no compartimento claro e o tempo de latência no compartimento claro antes de entrar no compartimento escuro foi registrado.

4.5. Análise Western Blot para TRPV1 e TRPV4

Para examinar os níveis de expressão de TRPV1 e TRPV4 no hipocampo CA1 de gerbil, a técnica de Western blot foi realizada de acordo com métodos descritos anteriormente [66,67].

Resumidamente, de acordo com o cronograma designado (30 min, 12 h, 1 dia, 2 dias e 4 dias após a operação simulada ou tFI), os gerbilos (n=5 para cada grupo) receberam anestesia para eutanásia por injeção intraperitoneal com 200 mg/kg de pentobarbital sódico (JW Pharm.Co., Ltd., Seul, Coreia).

Posteriormente, seus cérebros foram colhidos e homogeneizados com solução salina tamponada com fosfato 50 mM (PBS, pH 7,4) contendo 00,1 mM de etilenoglicol-bis (éter aminoetílico) -N, N, N{{ 11}}, ácido N0-tetracético (EGTA) (pH 8.0), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 10 mM (pH 8,0), 0,2% Nonidet P{{17 }}, pirofosfato de sódio 15 mM, -glicerofosfato 100 mM, ortovanadato de sódio 2 mM, NaF 50 mM, NaCl 150 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonil 1 mM (PMSF) e ditiotreitol (DTT) 1 mM.

Em seguida, as amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes foram retirados para determinar os níveis de proteína usando um kit de ensaio Micro BCA da Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EUA) com albumina de soro bovino da Pierce Chemical Co (Rockford, IL, EUA).

Alíquotas incluindo 20 µg de proteína total foram fervidas em tampão de carga, Tris 150 mM (pH 6,8) contendo 6% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 3 mM DTT, 0,3% de azul de bromofenol e 30% de glicerol.

As amostras foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS a 10% (PAGE). Em seguida, os géis foram transferidos para membranas de nitrocelulose da Pall Co (East Hills, NY, EUA) a 350 mA e 4 ◦C por 90 min.

Para bloquear a coloração inespecífica, as membranas foram incubadas em leite desengordurado a 5% durante 60 min à temperatura ambiente. Posteriormente, eles reagiram imunologicamente com cada anticorpo primário: anti-TRPV1 de coelho (diluído 1:1000) (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-TRPV4 de coelho (diluído 1:1000) (Abcam) e anti-coelho- - actina (diluída 1:2000)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a 4 ◦C por 7 h.

Posteriormente, eles reagiram com IgG anti-coelho de burro conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (diluído 1: 4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) em temperatura ambiente por 1 h.

Finalmente, foi utilizado um kit de quimiluminescência à base de aluminol da Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EUA) para melhorar a visualização.

Conforme descrito anteriormente (68), os imunotransferências de TRPV1 e TRPV4 foram analisados ​​usando o software Scion Image da Scion Crop (Frederick, MD, EUA). As bandas foram escaneadas e realizada análise densitométrica. Os níveis de proteína foram normalizados em relação ao nível correspondente de -actina.

4.6. Preparação de Cortes Histológicos

Para exames imuno-histoquímicos e histopatológicos, os gerbilos (n=7 para cada grupo) foram sacrificados de acordo com o cronograma designado (30 min, 12 h, 1 dia, 2 dias e 4 dias após tFI ou operação simulada).

Conforme descrito anteriormente [34], os gerbils foram profundamente anestesiados com pentobarbital sódico (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Seul, Coréia). Sob anestesia, os gerbilos foram enxaguados transcardialmente com solução salina tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) e fixados com paraformaldeído a 4% (em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4).

Posteriormente, seus cérebros foram obtidos e pós-fixados com o mesmo fixador por seis horas. Posteriormente, os tecidos cerebrais foram cortados (25 µm de espessura dos planos coronais) em acriostato (Leica, Wetzlar, Alemanha).

4.7. Coloração histoquímica usando CV

Para examinar o dano morfológico e neuronal no hipocampo de cada grupo, a coloração com violeta de cresil (CV) foi realizada conforme descrito anteriormente (69). Resumidamente, acetato de violeta de cresil (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi dissolvido a 1,0% (p/v) em água destilada e ácido acético glacial (00,28 %) foi adicionado a esta solução. Os cortes foram corados e montados com bálsamo canadense (Kanto, Tóquio, Japão).

4.8. Coloração FJ B

A coloração FJ B foi realizada para examinar a degeneração neuronal (morte ou perda). De acordo com o procedimento publicado [34], as seções cerebrais preparadas foram embebidas em hidróxido de sódio a 1%, imediatamente transferidas para 0.06% de permanganato de potássio e prontamente reagiram com 0,0004% de Fluoro-Jade B (Histochem , Jefferson, AR, EUA).

As seções foram brevemente lavadas e colocadas em um aquecedor de lâminas (cerca de 50 ◦C) para reação com FJ B. Para avaliar o efeito terapêutico de OXC contra tFI, o número de células FJ B+ foi contado na região CA1 de acordo com um método publicado em [ 70].

Resumidamente, imagens digitais de células FJ B + foram capturadas a partir de cinco seções por gerbil usando um microscópio epifluorescente (Carl Zeiss) (Oberkochen, Alemanha) no comprimento de onda de 450-490 nm. As células foram contadas em 250 µm2, que incluía o SP, no centro da região CA1 utilizando um sistema de análise de imagens (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, EUA).

4.9. Imunohistoquímica

Para investigar alterações na imunorreatividade de NeuN, TRPV1 e TRPV4 na região CA1, foi realizada imuno-histoquímica geral. Em resumo, de acordo com um método publicado [34], as seções cerebrais preparadas foram incubadas com anticorpos primários - anti-NeuN de camundongo (diluído, 1: 1100) (Chemicon, Temecula, CA, EUA), anti-TRPV1 de camundongo (diluído, 1:500) (Abcam, Cambridge, Reino Unido) e anti-TRPV4 de coelho (diluído, 1:500) (Abcam, Cambridge, Reino Unido).

Posteriormente, essas seções incubadas foram incubadas nos anticorpos secundários correspondentes (diluídos, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EUA) e desenvolvidos utilizando Vectastain ABC (diluído, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA , EUA). Finalmente, estas secções imunorreagidas apresentaram cor após visualização com 3,3'-diaminobenzidina.

Os números de células NeuN+ foram contados como se segue. Imagens digitais de células NeuN+ foram capturadas de cinco seções por gerbil usando um microscópio óptico (AxioM1) (Carl Zeiss, Alemanha).

As células foram contadas da mesma forma que a contagem de células FJ B+. Para avaliar a densidade das estruturas TRPV1+ e TRPV4+, as áreas correspondentes na região CA1 foram utilizadas em cinco seções por animal. Imagens das estruturas TRPV1+ e TRPV4+foram capturadas usando um microscópio óptico AxioM1 (Carl Zeiss) (Alemanha).

As densidades das estruturas TRPV{{0}} e TRPV4+foram avaliadas como a densidade óptica relativa (ROD). Para tanto, as imagens foram transformadas para o nível médio de cinza. O ROD foi apresentado em porcentagem utilizando o software Adobe Photoshop (versão 8.0) e NIH Image J (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, EUA).

4.10. Análise Estatística

Apresentamos os dados como média ± erro padrão da média (EPM). Todas as análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do GraphPad Prism (versão 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, EUA). As diferenças nas médias entre os grupos experimentais foram analisadas estatisticamente por análise de variância bidirecional (ANOVA) com um teste de comparação múltipla post hoc de Bonferroni para elucidar diferenças relacionadas ao tFI entre todos os grupos. A significância estatística foi considerada em p < 0. 05.

Contribuições dos Autores: Conceitualização: M.-HW e T.-KL; Metodologia, J.-CL e DWK; Software, H.-IK e MCS; Validação, JHA, IJK e JHP; Investigação, J.-CL, H.-IK e M.CS; Curadoria de dados, JHC, IJK e JHP; Redação-Preparação do Rascunho Original, H.-IK e J.-CL; Redação-Revisão e Edição, M.-HW; Supervisão, S.-SL; Administração de Projetos, M.-HW; Aquisição de financiamento, S.-SL e T.-KL Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities for Research (FOUR, 4220200913807) financiado pela National Research Foundation (NRF) da Coreia, e pelo Basic Science Research Program através da National Research Foundation of Korea (NRF) financiado pelo Ministério da Educação (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Declaração do Conselho de Revisão Institucional: Os gerbos foram criados no Centro de Animais Experimentais da Universidade Nacional de Kangwon (Chuncheon, Coréia). Para este estudo, o protocolo experimental foi aprovado (número de aprovação, KW-200113-1; data de aprovação, 18 de fevereiro de 2020) pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais.

O protocolo de pesquisa seguiu as diretrizes sugeridas nas "Leis e Políticas Internacionais Atuais" do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pela The National Academies Press (8ª Ed., 2011).

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido: Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados: Os dados apresentados neste estudo estão disponíveis mediante solicitação ao autor correspondente.

Agradecimentos: Os autores agradecem Hyun Sook Kim e Seung Uk Lee pela ajuda técnica neste estudo.

Conflitos de interesse: Os autores declararam que não há conflito de interesse financeiro.

Abreviações

CA1: subcampo Cornu Ammonis 1; SNC, sistema nervoso central; CV, cresil violeta; DG, giro denteado; FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, hipotermia; NeuN, núcleos neuronais; OXC, oxcarbazepina; TAP, teste de evitação passiva; ROD, densidade óptica relativa; AMS, atividade motora espontânea; SO, estrato oriens;SP, estrato piramidal; SR, estrato radiado; tFI, isquemia transitória do prosencéfalo; TRPV1, potencial receptor transiente vanilóide tipo 1.

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