A espectrometria de massa em tandem de alta resolução identifica um padrão gangliosídeo específico na doença renal diabética precoce de pacientes com diabetes mellitus tipo 2

Abstrato:

Considerando as valiosas informações fornecidas pelos glicoesfingolipídios comomarcadores molecularese os dados limitados disponíveis para a sua detecção e caracterização em pacientes que sofrem deDoença renal diabética tipo 2(DKD), desenvolvemos e implementamos um método superior baseado em espectrometria de massa (MS) de alta resolução (HR) e MS tandem (MS/MS) para a determinação de gangliosídeos na urina dePacientes com DKD. Este estudo focou em: (i) testar a viabilidade e desempenho do HR MS e MS/MS no mapeamento esequenciamento de gangliosídeos renais no DM tipo 2pacientes; (ii) determinação das alterações nogangliosídeo urinário de DKDpacientes emdiferentes estágios da doença-normo-, micro- e macroalbuminúria - em um ensaio comparativo com controles saudáveis. Devido à alta resolução e precisão de massa, a triagem comparativa de MS revelou que o estado de sialilação dos componentes gangliósidos; sua modificação por O-acetil, CH3COO−, O-fucosil e O-GalNAc; bem como a composição da ceramida representam possíveis marcadores para a detecção precoce de DKD, a avaliação da progressão da doença e o tratamento de acompanhamento. Além disso, a investigação estrutural por MS/MS demonstrou que GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) e GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) isômeros estão associados à macroalbuminúria, merecendo investigação adicional em relação ao seu papel na DKD.

Palavras-chave: nanoeletrospray; espectrometria de massa em tandem de alta resolução; triagem; análise de fragmentação; doença renal diabética; biomarcadores gangliósidos

1. Introdução

O diabetes mellitus tipo 2 (DM) continua sendo um desafio terapêutico com prevalência global em constante aumento, apesar dos avanços científicos na área. Associado a danos macrovasculares e microvasculares devastadores a longo prazo, o DM tipo 2 leva ao aumento da mortalidade. A doença renal diabética (DKD) é a causa mais comum de doença renal terminal (DRT) em países desenvolvidos e em desenvolvimento [1,2]. Assim, a detecção precoce da DKD e o manejo ideal do DM tipo 2 são cruciais para reduzir complicações, morbidade e mortalidade. Atualmente, o diagnóstico e a progressão da DKD baseiam-se na medição da albuminúria e na redução constante da taxa de filtração glomerular (TFGe), ambos parâmetros mostrando uma previsão modesta do estado renal futuro. A história natural da DKD inclui vários estágios clínicos, incluindo os seguintes: hiperfiltração glomerular precoce, ocorrência de microalbuminúria ou macroalbuminúria, declínio da taxa de filtração glomerular e doença renal terminal. No entanto, pesquisas recentes consideram a albuminúria um marcador de deterioração da condição [3].

Na última década, foi demonstrado particular interesse no conceito subtelocêntrico, segundo o qual o túbulo proximal e o compartimento tubulointersticial poderiam ter um papel essencial no início e progressão da DKD [4–6]. Neste contexto, o desenvolvimento de biomarcadores glicómicos prognósticos e preditivos está a ganhar cada vez mais atenção e tornou-se o foco de muitos grupos de investigação ao longo dos anos [7–11].

Os gangliósidos representam uma classe particular de glicoesfingolípidos com uma estrutura complexa identificada em todos os tecidos e fluidos corporais e particularmente abundante no sistema nervoso central (SNC) [12]. Como constituintes essenciais das membranas da bicamada celular neuronal, os gangliosídeos desempenham um papel vital no desenvolvimento, maturação e envelhecimento do cérebro, mediando a adesão, ativação, proliferação, motilidade e crescimento celular. Os gangliosídeos consistem em uma ceramida de composição diferente em relação à base esfingóide, resíduos de ácidos graxos enraizados na camada externa da membrana e uma cadeia de oligossacarídeos sialilados cobrindo a membrana e participando de interações específicas e essenciais com outras moléculas no ambiente circundante. Através da renovação normal da superfície celular, conhecida como "eliminação da superfície celular", os gangliosídeos são liberados, até certo ponto, no espaço intercelular.

Como se sabe que a expressão, distribuição e estrutura dos gangliosídeos são específicas do tipo de célula e tecido e variam durante o desenvolvimento, maturação, envelhecimento do tecido e, acima de tudo, em estados patológicos [12], os gangliosídeos são considerados entre os mais valiosos. marcadores diagnósticos e possíveis agentes terapêuticos.

Vários métodos utilizando fragmentos de biópsia de soro ou rim têm sido aplicados para identificação de gangliosídeos renais em pacientes com DM tipo 2, como imunocoloração em camada fina [7,8], cromatografia em camada fina de alto desempenho (HPTLC) [9], espectrofotometria [10 ] e espectrometria de massa (MS) [11].

Tendo em vista a informação valiosa que pode ser fornecida pelos gangliósidos como marcadores moleculares do tecido neuronal [12] e os dados limitados disponíveis até agora na detecção e caracterização de glicoesfingolípidos na urina de pacientes com DKD, desenvolvemos e implementamos um método superior baseado em nanoeletrospray (nanoESI) MS de alta resolução (HR) para a determinação de gangliosídeos na urina de pacientes com DM. Esta opção pela HR MS foi norteada pelas vantagens oferecidas por este método na análise das misturas complexas de gangliosídeos extraídos da urina humana. O elevado poder de resolução do instrumento: (i) permite a detecção de íons de valores m/z próximos, que de outra forma não poderiam ser discriminados em uma amostra multicomponente heterogênea contendo espécies de vários comprimentos e arquiteturas da cadeia de glicano e composições diferentes do ceramida; (ii) basicamente elimina a necessidade de separação da mistura por métodos cromatográficos líquidos ou eletroforéticos antes da análise por MS; (iii) proporciona alta precisão de massa, o que aumenta muito a confiabilidade da identificação estrutural; e (iv) oferece não apenas uma melhor visão sobre a complexidade do gangliosidome associado ao DM, mas também dados sobre as espécies com potencial papel de biomarcador com base na alta confiança na determinação de massa para íons moleculares e fragmentos.

Este estudo piloto, com o objetivo de caracterizar gangliosídeos urinários com funções de biomarcadores nodiagnóstico precoce de DKD, concentrou-se em: (a) testar a viabilidade e o desempenho do HR MS e do MS tandem (MS/MS) por dissociação induzida por colisão de alta energia (HCD) no mapeamento de gangliosídeos renais em pacientes com DM tipo 2; (b) determinação das alterações na expressão de misturas de gangliosídeos nativos das amostras de urina de pacientes com DM tipo 2 em um ensaio comparativo com controles saudáveis ​​e caracterização dos biomarcadores descobertos. Para tanto, otimizamos uma plataforma bioanalítica moderna baseada em nanoESI HR MS em um instrumento Orbitrap ajustado para operação em modo de íon negativo tanto na triagem de MS quanto na fragmentação de MS/MS para análise estrutural detalhada.

2. Resultados e Discussões

2.1. Triagem Comparativa das Amostras por nanoESI HR MS

As amostras de gangliosídeos A1, A2, A3 e C foram infundidas por nanoESI uma após a outra em um Orbitrap MS e examinadas em modo de íon negativo sob condições instrumentais idênticas. Em cada caso, o sinal da corrente iônica total (TIC) foi adquirido por 2 min, gerando espectros a partir do acúmulo de 100 varreduras. Devido à alta sensibilidade do método, mesmo sob as condições restritivas de tempo empregadas, os espectros de massa adquiridos apresentavam uma alta relação sinal-ruído e um rico padrão de íons moleculares.

A avaliação dos dados de mapeamento gerados nas mesmas condições revelou diferenças significativas no número e tipo de componentes gangliósidos expressos nas amostras A1, A3 e C, enquanto não foram observadas diferenças entre as amostras A1 e A2. Esses resultados estão resumidos na Tabela 1, que lista comparativamente as estruturas identificadas nas misturas nativas A1, A3 e C, juntamente com os valores experimentais m/zexp dos sinais detectados e os valores teóricos m/ztheor correspondentes às estruturas propostas.

A alta resolução e precisão de massa da plataforma MS empregada melhoraram a discriminação e identificação com base em medições de massa precisas de nada menos que 37 componentes distintos de gangliosídeos e fucogangliosídeos na urina nas três amostras. As espécies descobertas pertencem a 15 classes diferentes, incluindo as modificações da cadeia principal de glicanos (Tabela 2), e foram atribuídas a excelente precisão de massa média de 4 ppm.

Uma avaliação detalhada das estruturas na Tabela 1 revelou que de todas as amostras, a mistura A3, que corresponde à macroalbuminúria (portanto, a um estágio avançado de DKD), contém o maior número de compostos gangliósidos distintos, ou seja, 19, seguido por amostra C, com 12 espécies distintas, e amostra A1, com 10.

Em comparação com as amostras A1 e C, A3 também: (i) abrange o maior número de espécies com a cadeia mais longa de O-glicano pertencente à classe G1 e a diversidade mais proeminente de composições de ceramida; (ii) apresenta o maior número de classes de gangliosídeos expressas-12 classes vs. apenas 6 na amostra A1 e 6 na amostra C, respectivamente; (iii) contém o maior número de gangliosídeos, que exibem um núcleo sacarídico alterado por O-acetil não carboidrato, bem como modificações biologicamente relevantes de carboidratos O-fucosil e O-GalNAc; (iv) é o único extrato urinário contendo estruturas gangliosídicas modificadas pela ligação O-GalNAc, nomeadamente GalNAc-GS1 (t18: 1/18: 0), detectado como uma molécula quádrupla desprotonada e sodiada em m/z 1176,8266 , e GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), como uma molécula duplamente desprotonada em m/z 1310.1271. Como é visível na Figura 1a-c, mostrando a proporção das classes de gangliosídeos expressas nas três amostras, e no histograma comparativo representado na Figura 2, o extrato A3 apresenta um estado de sialilação particular, sendo dominado por polisialocompostos. Exceto para a gangliotetraose monosialilada GM1(d18:1/16:1) detectada como [M-2H+] 2− em m/z 756,9078 e a GM3 monosialilada(d18:0/24: 0) detectada como uma molécula duplamente desprotonada em m/z 645,3956, todas as outras 17 espécies contêm mais de um resíduo Neu5Ac em sua porção glicano. Além disso, como foram descobertos nada menos que sete trisialos GT1, quatro pentasialos GQ1 e até mesmo um GS1 heptasialilado, obviamente, junto com o aumento do número e da diversidade de estruturas, o comprimento dos núcleos de glicano e suas modificações periféricas, a alta sialilação geral o conteúdo representa outra característica específica da macroalbuminúria.

Tabela 1. Espécies de gangliosídeos foram identificadas nas amostras A1, A3 e C pela triagem de (-) nanoESI Orbitrap MS. d: base esfingóide diidroxilada; t: base esfingóide tri-hidroxilada.

Uma observação clinicamente relevante também emerge do ensaio comparativo A1 vs. C. Enquanto na amostra de controle, C, o maior grau de sialilação dos gangliosídeos detectados é quatro, identificado através de duas gangliotetraose tetrasialilada GQ1 diferindo na composição de sua aglicona lipídica, na amostra A1, o maior grau de sialilação é quatro. Ao lado dos gangliosídeos di-, tri- e tetrasialilados, a mistura A1 contém uma pentasialo gangliotetraose GP1 (d18:1/18:0), detectada como [M-4H+ ] 4− íon em m/z 676,5569, ao qual foi atribuída a excelente precisão de massa de 2,95 ppm. Tais dados relacionados ao estado de sialilação das amostras investigadas mostram que o grau de sialilação dos gangliosídeos renais segue o traço C < A1 < A2=A3, observação que enfatiza a precocidade dessas modificações, mesmo na fase de normoalbuminúria de Pacientes com DM tipo 2. O grau de sialilação aumenta com a progressão da doença, o que o torna um parâmetro molecular a ser considerado não só para a detecção precoce da DKD, mas também para a avaliação daProgressão DKDeeficácia do tratamento.

Tabela 2. Visualização tabulada das classes identificadas de gangliosídeos urinários juntamente com sua expressão diferencial nas amostras A1, A3 e C. Símbolos: x=a classe foi detectada; -=a classe não foi detectada.

Uma inspeção detalhada da constituição da aglicona revela que, exceto pelas diferenças marcantes na composição da cadeia de glicano, os gangliosídeos expressos nas três amostras também apresentam diferenças na estrutura das suas ceramidas. As alterações mais evidentes da parte lipídica estão relacionadas ao processo menos comum de triidroxilação de bases esfingóides, que ocorre nas misturas de gangliosídeos A1 e A3, e ao comprimento incomum das cadeias de ácidos graxos, presentes apenas em A3. Verificou-se que cada uma das amostras A1 e A3 continha duas espécies com bases esfingóides tri-hidroxiladas da ceramida. Portanto, GT1(t18:0/18:0) e GT1(t18:0/20:0) foram descobertos na amostra A1, enquanto quanto mais Estruturas complexas tri-hidroxiladas GT1 (t18:1/24:3) e Fuc-GT3 (t18:1/18:3) foram encontradas na amostra A3.

Notavelmente, a amostra A3 também mostra evidências de espécies contendo ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA). Um VLCFA é considerado uma estrutura lipídica de ocorrência rara, abrangendo 23 a 27 átomos de carbono na cadeia de ácidos graxos. Quatro dessas espécies incomuns de VLCFA transportando 24 átomos de carbono na cadeia de ácidos graxos foram detectadas na amostra A3: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1 /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0) e Fuc-GT1(d18:0/24:0), dos quais uma estrutura também apresenta a tri-hidroxilação de base esfingóide incomum e três ligações duplas na cadeia de ácidos graxos, enquanto duas estruturas apresentam ligações ao núcleo glicano do grupo O-Ac e fucosil, respectivamente.

Estas características das porções de ceramida nas amostras A1 e A3, que não foram encontradas na amostra controle; as semelhanças entre A1 e A2; e as diferenças marcantes detectadas no A3 sugerem que, junto com a composição de carboidratos e o estado de sialilação, a estrutura da porção lipídica nos gangliosídeos renais é outro possível marcador de DKD precoce. Além disso, as modificações na composição da ceramida parecem depender dos estágios da albuminúria; ceramidas complexas, exibindo triidroxilação da base esfingóide e VLCFA parecem estar ligadas aos estágios avançados de albuminúria. Considerando que o número incomum de três ligações duplas na cadeia de ácidos graxos foi encontrado apenas na amostra A3 através de duas espécies diferentes Fuc-GT3(t18:1/18:3) e GT1(t18:1/24:3) aparentemente, o mecanismo de formação de ligações duplas também está relacionado à progressão da DKD.

Os efeitos negativos exercidos pela acumulação de lípidos no rim, tanto a nível glomerular como tubular, são específicos da célula. Além disso, a lipotoxicidade está associada a vários tipos de lipídios, entre os quais os gangliosídeos apresentam um papel de estágio central [13].

O conteúdo renal de gangliosídeos, entre outras classes lipídicas, foi aumentado nos podócitos, bem como nas células do túbulo proximal, em um modelo de camundongo DN [14]. Os túbulos proximais podem ser expostos a altos níveis de lipídios urinários, incluindo gangliosídeos, devido ao aumento do conteúdo de ácidos graxos por molécula de albumina no início da DKD [15]. As consequências diretas do acúmulo lipídico nos segmentos do néfron estão relacionadas a modificações estruturais e funcionais, que levam ao comprometimento do processamento da albumina no início do curso do DM tipo 2.

A grande maioria dos estudos que focam na caracterização do gangliosídeo renal baseia-se em modelos experimentais de nefropatia diabética. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo translacional em humanos, desde a pesquisa básica até a aplicabilidade clínica, a relatar um padrão específico de gangliosídeos urinários em pacientes com DM tipo 2. O significado prático do nosso estudo está na demonstração de uma associação do grau de sialilação dos gangliosídeos urinários e da estrutura de suas ceramidas com DKD precoce, estadiada pelo nível de albuminúria.

Serviço de apoio da Wecistanche - o maior exportador de cistanche da China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Compre para obter mais detalhes de especificações:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

OBTENHA EXTRATO DE CISTANCHE ORGÂNICO NATURAL COM 25% EQUINACOSÍDEO E 9% ACTEOSÍDEO PARA INFECÇÃO RENAL