DNA tumoral circulante em pacientes com carcinoma de células renais. Uma revisão sistemática da literatura
Nov 06, 2023
Contexto abstrato:Durante a última década tem havido um interesse crescente no potencial das biópsias líquidas e dos biomarcadores sistemáticos no diagnóstico e tratamento decancêr de rins, pois podem fornecer uma ferramenta paradetecção precoce de doençasemonitoramento da resposta ao tratamento. Objetivo: Identificar e resumir dados relevantes publicados sobre DNA tumoral circulante (ctDNA) em pacientes comcarcinoma de células renais(RCC). Aquisição de evidências: Realizamos uma revisão sistemática de acordo com a declaração Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA) de estudos identificados no PubMed, MEDLINE, EMBASE e Cochrane Library até 15 de janeiro de 2021. Dois revisores examinaram todos de forma independente. artigos e realizou a extração dos dados.
Síntese de evidências:Dezenove estudos que investigaram o ctDNA no CCR (1.237 pacientes) foram incluídos e analisados na revisão final. O tamanho e o desenho do estudo variaram amplamente, e os estudos foram divididos em cinco grupos de acordo com o método utilizado para detecção de ctDNA. Os dados dos resultados incluíram (1) a sensibilidade/especificidade, se disponível; (2) o método utilizado para detecção de ctDNA; e (3) os principais achados dos estudos.
Conclusões:Os estudos destacam que o nível de ctDNA no CCR parece ser baixo. Estudos que utilizam múltiplos métodos para detecção de ctDNA indicam que a análise guiada por tumor melhora a taxa de detecção de ctDNA e sugere que a imunoprecipitação de DNA metilado livre de células e o sequenciamento de alto rendimento podem ser um método muito sensível para detecção de ctDNA em RCC.
Resumo do paciente: Revisamos sistematicamente a literatura para identificar todos os estudos relevantes que investigam o DNA tumoral circulante em pacientes comcancêr de rinsinvestigar seu uso e potencial nesta doença altamente maligna. Descobrimos que o nível de DNA tumoral circulante é baixo emcancêr de rinse que métodos muito sensíveis devem ser usados para a detecção desta doença.
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1. Introdução
As malignidades urológicas são um problema crescente de saúde em todo o mundo, com mais de um milhão de pacientes diagnosticados anualmente [1]. O carcinoma de células renais (CCR) é uma doença altamente maligna e representa 3% de todas as malignidades nos países ocidentais, com sua incidência aumentando anualmente [2].
O diagnóstico e tratamento de pacientes com CCR apresentam muitos desafios. Isto ocorre principalmente porque o CCR é caracterizado por manifestação assintomática nos estágios iniciais e uma fraca resposta à radioterapia e quimioterapia nos estágios metastáticos [3,4]. Nas últimas décadas, tem havido um interesse crescente na investigação de biópsias líquidas e biomarcadores circulantes de cancro porque podem fornecer uma ferramenta para a detecção precoce de doenças e para a monitorização da resposta ao tratamento. Ellinger et al [5] relataram que a presença de DNA livre de células (cfDNA) na corrente sanguínea foi detectada pela primeira vez há mais de 50 anos. O cfDNA pode ser facilmente obtido a partir do sangue periférico e foi demonstrado que está presente em pacientes com múltiplas malignidades sólidas [6]. A presença de cfDNA na corrente sanguínea dos pacientes e alterações nos níveis desses ácidos nucleicos circulantes estão associadas à carga tumoral e à progressão tumoral. No entanto, os estudos divergem quanto à capacidade de mostrar uma correlação entre os níveis de cfDNA e o estágio e grau do tumor no CCR [7–9]. O DNA tumoral circulante (ctDNA) é cfDNA derivado de células tumorais apoptóticas ou necróticas, secreções de macrófagos ou células tumorais circulantes (CTCs) [10]. A análise do ctDNA pode abrir a possibilidade de detecção não invasiva do perfil mutacional de câncer específico durante a progressão do tumor, e estudos mostraram que a presença de ctDNA se correlaciona com doença avançada e progressão da doença durante o tratamento [7,11,12]. Embora vários estudos sobre ctDNA no CCR tenham sido realizados, ainda não existem recomendações claras ou resumos da literatura.
Relatamos aqui uma revisão sistemática de todos os dados publicados sobre ctDNA em pacientes com CCR para investigar o uso e o potencial do ctDNA no CCR.
2. Aquisição de evidências
2.1. Estratégia de pesquisa
Esta revisão sistemática foi realizada de acordo com as diretrizes Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA) [13] (Fig. 1). A revisão foi registrada na plataforma PROSPERO sob número de identificação CRD42020208730. Pesquisaram um autor (LG) e um bibliotecário especialista, cuja estratégia está disponível no material suplementar. A busca bibliográfica foi realizada nas bases de dados PubMed, MEDLINE, EMBASE e Cochrane Library para identificar estudos relevantes até 15 de janeiro de 2021, com classificação e remoção de artigos duplicados realizada na Covidence.
2.2. Critérios de triagem e seleção
A seleção dos estudos foi realizada em três etapas sequenciais: os artigos foram avaliados primeiro pelo título, segundo pelo resumo e terceiro pelo texto completo. Os estudos foram incluídos se atendessem aos seguintes critérios de inclusão: (1) pacientes com diagnóstico de qualquer estágio de CCR; (2) análise de DNA em plasma/soro; (3) análise de mutações ao nível do DNA ou alterações epigenéticas; e (4) artigo escrito em inglês. Foram excluídos artigos relativos a outras doenças malignas que não o CCR, estudos em animais e linhagens celulares, estudos publicados antes de 2010 e pequenos estudos piloto contendo menos de cinco pacientes.
Dois autores (LG e KMK) examinaram independentemente os títulos e resumos e selecionaram estudos potencialmente elegíveis. O texto completo dos estudos potencialmente elegíveis foi então selecionado. Os autores discutiram quaisquer divergências até que um consenso fosse alcançado.
2.3. Extração de dados
Uma planilha de extração de dados foi desenvolvida e resultados de interesse pré-especificados foram coletados. Dois revisores (LG e KMK) extraíram independentemente os dados dos estudos incluídos. As divergências foram resolvidas por consenso.
As características do ensaio extraídas incluíram: (1) nome do primeiro autor e ano de publicação; (2) método aplicado para detecção de ctDNA; (3) número de pacientes/casos; e (4) número de controles. Os dados dos resultados incluíram: (1) sensibilidade e especificidade, quando disponíveis; (2) o método utilizado para detecção de ctDNA; e (3) principais conclusões dos estudos específicos.
A avaliação da qualidade não foi realizada de acordo com critérios pré-definidos devido à variação no desenho e nos métodos dos estudos incluídos. A qualidade dos estudos foi avaliada por um autor (KMK) com ampla experiência com métodos utilizados para detecção de ctDNA.
3. Síntese de evidências
3.1. Estudos incluídos
De acordo com nossos critérios de busca, 3.439 artigos potencialmente relevantes foram identificados e selecionados na busca primária. Todos os artigos foram adicionados ao EndNote e as duplicatas foram removidas, restando 1.670 estudos. Os títulos, resumos e textos completos foram selecionados manualmente e 19 estudos atenderam aos critérios de inclusão [9,14–31]. Todos os estudos incluídos foram publicados entre 2010 e 2020. Eles foram publicados na íntegra, mas o tamanho e o desenho dos estudos variaram muito e, portanto, foram divididos em cinco grupos de acordo com o método utilizado para detecção de ctDNA: (1) guiado por tumor análise de plasma; (2) sequenciamento direcionado de plasma; (3) sequenciamento global de plasma; (4) análise de metilação direcionada do plasma; e (5) análise global de metilação do plasma.
Para cobrir o uso de ctDNA no CCR, examinamos os estudos em cada um dos grupos de detecção de ctDNA para encontrar a taxa de detecção de ctDNA e a sensibilidade e especificidade, se disponíveis. Além disso, identificamos estudos que investigam a concordância entre amostras de ctDNA e tecido tumoral do mesmo paciente, e estudos que investigam o potencial do ctDNA para prognóstico e monitoramento de doenças. Finalmente, resumimos os métodos utilizados para detecção de ctDNA e qual método escolher com base em nossas descobertas.
3.2. taxas de detecção de ctDNA
3.2.1. Análise de plasma guiada por tumor
Cinco estudos [14–18] aplicaram análise de plasma guiada por tumor (Tabela 1). Este tipo de análise baseia-se na identificação de mutações no DNA do tecido tumoral e posterior análise dessas mutações no cfDNA. A vantagem deste método é que pode ser alcançada uma sensibilidade técnica muito elevada quando as mutações do tumor são conhecidas. A desvantagem é que a análise não identifica mutações recém-adquiridas. Os cinco estudos incluíram entre cinco e 24 pacientes com CCR e a taxa de detecção de ctDNA variou de 17% a 54%.
Em um estudo inicial de referência sobre ctDNA, Bettegowda et al [14] investigaram a presença de ctDNA em 640 pacientes com vários tipos de câncer, incluindo cinco pacientes com CCR metastático. A detecção de ctDNA no plasma foi feita por reação em cadeia da polimerase (PCR) ou análise baseada em sequenciamento de uma mutação identificada no tumor. O ctDNA foi detectado em 40% dos pacientes com CCR com doença metastática, o que levou à classificação do CCR como uma malignidade com baixo ctDNA. Embora a classificação tenha sido baseada em um número muito baixo de pacientes, ela foi apoiada por vários estudos realizados desde então [15–18].
Os estudos de Corrò et al [15] e Lasseter et al [18] usaram sequenciamento profundo direcionado de uma ou algumas mutações identificadas no tecido tumoral e tiveram uma taxa de detecção de ctDNA de 17% e 52%, respectivamente. Os pacientes do estudo de Corrò e cols. apresentavam doença não metastática, enquanto os pacientes do estudo de Lasseter e cols. apresentavam CCR metastático.
A diferença na taxa de detecção pode resultar das diferentes coortes de pacientes; no entanto, as taxas de detecção relativamente baixas nestes estudos são surpreendentes, uma vez que a estratégia informada pelo tumor tem potencial para ser um dos métodos mais tecnicamente sensíveis. O estudo de Lasseter et al também mostrou que o sequenciamento de cfDNA em uma profundidade extremamente alta (122 035 ) melhorou a detecção de ctDNA porque aumenta a detecção de variantes presentes em frequências muito baixas.
Dois estudos muito recentes com coortes mistas de pacientes (CCR não metastático e metastático) [16,17] aplicaram a análise de ctDNA de um grande número de variantes identificadas no tecido tumoral. No estudo de Smith et al [16], 91 pacientes foram investigados usando uma variedade de métodos (Tabelas 1–3). Os autores descobriram que uma abordagem personalizada visando uma média de 297 variantes específicas de tumor por paciente, usando sequenciamento de painel personalizado de mutações identificadas por sequenciamento de exoma de tecido tumoral, melhorou a detecção de ctDNA em comparação com uma abordagem não direcionada. A análise do plasma guiada pelo tumor foi realizada em 29 pacientes e identificou ctDNA em 54% dos pacientes para os quais a análise passou no controle de qualidade. Wan et al [17] aplicaram uma abordagem metodológica semelhante a 24 pacientes e descobriram que a fração de ctDNA em pacientes com CCR era de aproximadamente 10 4 . Esta descoberta destaca que são necessários métodos extremamente sensíveis para a análise de ctDNA no CCR.
3.2.2. Sequenciamento direcionado de plasma
Oito estudos [16,18–24] (Tabela 2) aplicaram sequenciamento de painel direcionado de DNA de plasma sem análise prévia de DNA de tecido tumoral. A vantagem desta estratégia é que ela não requer amostra de tecido (ou seja, é menos invasiva) e permite a identificação de mutações recém-adquiridas. No entanto, a análise pode ser menos sensível do que a análise guiada por tumor. Em geral, os estudos incluíram um número maior de pacientes, variando de 19 a 220, e a taxa de detecção foi consideravelmente melhor, variando de 19% a 100%. A maioria dos estudos foi realizada em pacientes com doença metastática; apenas 14 pacientes no estudo de Yama moto et al [22] e dois pacientes no estudo de Smith et al [16] apresentaram CCR não metastático (taxas de detecção de 30% e 19%, respectivamente). As altas taxas de detecção podem, portanto, refletir uma alta carga tumoral em muitos desses pacientes. Os resultados do estudo de Maia et al [20] apoiam esta hipótese. Os autores descobriram que a detecção de ctDNA estava correlacionada com a carga tumoral; a carga tumoral foi significativamente maior em pacientes com ctDNA detectável do que em pacientes sem ctDNA. Além disso, o número de mutações no ctDNA também foi significativamente correlacionado com a carga tumoral.
Bacon et al [23] encontraram uma taxa de detecção relativamente baixa de 33% em comparação com estudos semelhantes. Isto pode ocorrer porque em 40 dos 55 pacientes foram coletadas amostras de plasma após a remoção cirúrgica do tumor primário. No entanto, num estudo realizado por Hahn et al [19], no qual 15 de 19 pacientes também tiveram o seu tumor primário removido cirurgicamente antes da colheita da amostra, a taxa de detecção de ctDNA foi de 68%. A baixa taxa de detecção também pode ser explicada pela sensibilidade técnica do ensaio, que não permitiu a detecção de variantes presentes em uma frequência alélica variante (VAF) de<1% [23].
Parece haver uma tendência para uma melhor detecção em estudos nos quais a análise do ctDNA foi baseada em um painel genético cobrindo um grande número de genes, profundidades de sequenciamento muito altas ou uma combinação destes. Por exemplo, os estudos de Maia et al [20] e Pal et al [21] sequenciaram 73 genes com cobertura 15 000 e tiveram taxas de detecção de 53% e 79%, respectivamente. Em comparação, Smith et al [16] sequenciaram dez genes até uma profundidade de 9.688 e Lasseter et al [18] sequenciaram 27 genes até uma profundidade de 989 e tiveram taxas de detecção de ctDNA de 19% e 28%, respectivamente.
3.2.3. Sequenciamento global de plasma
Foram identificados dois estudos [16,25] que utilizaram sequenciamento global de plasma (Tabela 3), ambos aplicando sequenciamento superficial do genoma completo (sWGS). Este método não direcionado não requer conhecimento prévio de mutações específicas no tumor e tem baixa sensibilidade para mutações de base única, mas pode identificar grandes deleções e duplicações. O sWGS é relativamente barato e fácil de executar. Mouliere et al [25] realizaram sWGS a uma profundidade de 0 0,4 em 344 amostras de 200 pacientes com vários tipos de câncer, incluindo 33 com CCR (estágio desconhecido da doença). A detecção de ctDNA foi baseada na análise do comprimento dos fragmentos de cfDNA em pacientes com câncer e indivíduos saudáveis. Eles descobriram que o enriquecimento in silico de fragmentos entre 90 e 150 pb de tamanho melhorou a detecção de ctDNA em todos os tipos de câncer. No entanto, no CCR a proporção de fragmentos<150 bp was very similar to that in healthy individuals, indicating a low amount of ctDNA in RCC. The ctDNA detection rate was 65% for ''low-ctDNA cancers'' (RCC, pancreatic cancer, and glioma).
Smith et al [16] aplicaram a mesma seleção de tamanho in silico de fragmentos de cfDNA que Mouliere et al [25] e descobriram que isso melhorou a detecção de ctDNA. Em uma coorte de pacientes com vários estágios de CCR e em uma coorte de pacientes com CCRm, eles descobriram que a taxa de detecção de ctDNA foi de 23% (11 de 48) e 33% (14 de 43), respectivamente, quando a abordagem sWGS não direcionada foi combinada com seleção de tamanho.
Embora existam algumas vantagens deste método não direcionado e relativamente menos dispendioso, os resultados sugerem que ele tem sensibilidade relativamente baixa para o CCR e que é necessária otimização.
3.2.4. Análise de metilação direcionada do plasma
A análise de metilação direcionada do plasma usando um método baseado em PCR é muito barata e fácil de realizar. A desvantagem é que poucos genes são analisados e se o paciente não apresentar mutação em um desses genes, o resultado do teste de ctDNA será negativo. Identificamos cinco estudos [9,28–31] que utilizaram esse método (Tabela 4) e incluíram entre 27 e 157 pacientes com vários estágios de CCR. Quatro dos estudos incluíram um grupo de controles saudáveis.
Em geral, os autores concluíram que a análise de metilação proporcionou alta especificidade, mas baixa sensibilidade na distinção entre pacientes com câncer e controles saudáveis. Hauser et al [28] e Skrypkina et al [29] realizaram uma análise combinatória de múltiplos genes, o que aumentou a sensibilidade e especificidade diagnóstica. Lin et al [30] e Jung et al [31] investigaram o status de metilação de PCDH17 e SHOX2, respectivamente. Lin et al descobriram que a presença de PCDH17 se correlacionava com o estágio avançado da doença, e Jung et al descobriram que pacientes com plasma SHOX2-positivo tinham um risco significativamente maior de morte.
A análise baseada em PCR pode ser muito menos dispendiosa do que a análise baseada em sequenciamento, mas só permite a investigação de um número limitado de mutações. Tanto a sensibilidade quanto a especificidade são frequentemente relativamente baixas, como visto nos estudos de Hauser et al [28] e de Martino et al [9]. Métodos tecnicamente mais sensíveis, como a PCR digital de gotículas, podem melhorar a sensibilidade para pacientes cujo tumor apresenta uma mutação na posição genômica alvo [32]. No entanto, é provável que outros métodos direcionados a regiões genômicas maiores sejam necessários para a detecção de ctDNA no CCR.
3.2.5. Análise global de metilação
Três estudos [18,26,27] investigaram padrões globais de metilação (aberrações epigenéticas) no cfDNA (Tabela 5). As alterações epigenéticas são mais abundantes do que as alterações genéticas no CCR, proporcionando assim mais alterações específicas do tumor. A análise de metilação global pode, assim, atingir maior sensibilidade. A imunoprecipitação de DNA metilado livre de células e o sequenciamento de alto rendimento (cfMeDIP-seq) é uma técnica livre de bissulfito que pode detectar a metilação do genoma completo do cfDNA. A vantagem desta técnica é que ela pode enriquecer o cfDNA metilado por CrG em todo o genoma com uma baixa entrada de DNA.<10 ng) [33]. cfMeDIP-seq was applied in two studies: Nuzzo et al [26] had a ctDNA detection rate of 97% (at the specificity of 100%) in a study of 69 patients with various stages of RCC, and Lasseter et al [18] had a ctDNA detection rate of 100% in a study of 34 patients with mRCC, although at lower specificity of 88%.
Num grande estudo que incluiu mais de 2.000 pacientes com diferentes tipos de câncer (incluindo 81 pacientes com vários estágios de CCR), Liu et al [27] descobriram que a taxa de detecção de ctDNA no CCR era baixa em comparação com outros tipos de câncer. O estudo foi conduzido em duas etapas usando dados de sequenciamento de bissulfito do genoma completo de 1.531 casos de câncer e 1.521 amostras de controle para construir um classificador para detecção de ctDNA. Os autores aplicaram o classificador a uma coorte de validação de 654 casos de câncer e 610 amostras de controle. A taxa de detecção neste estudo foi de 21% (especificidade de 99,8%) na coorte de treinamento e 12% (especificidade de 99,3%) na coorte de validação, e a detecção de ctDNA teve sensibilidade crescente com o aumento dos estágios da doença.
Estes estudos indicam que o cfMeDIP-seq pode ser uma estratégia promissora para a detecção de ctDNA no CCR, mas a validação em estudos maiores é de extrema importância antes que quaisquer conclusões claras possam ser tiradas.
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