Dieta rica em fósforo induz aumento da expressão de mRNA de Bmp2 e Spp1 em rim de rato

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

Para esclarecer o mecanismo do desenvolvimento da nefrocalcinose induzida por uma dieta rica em fósforo (P), nos concentramos em proteínas relacionadas ao osso, como proteína morfogenética óssea 2 e osteopontina. Este estudo investigou os efeitos de uma dieta rica em P na expressão de mRNA de Bmp2 e Spp1 em ratosrim. Ratos Wistar foram divididos em dois grupos e alimentados com dieta controle (grupo controle) ou dieta com alto teor de P (grupo com alto teor de P).Rimas concentrações de cálcio e P foram significativamente aumentadas no grupo de alto P em comparação com o grupo controle. A expressão de mRNA de Bmp2 e Spp1 foi significativamente aumentada no grupo de alto P em comparação com o grupo controle. Esses resultados indicam que uma dieta rica em P induz a regulação positiva do mRNA de Bmp2 e Spp1 norim.

Palavras-chave: dieta rica em fósforo, nefrocalcinose, Bmp2, Spp1,rim, rato

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Introdução

A nefrocalcinose é uma doença caracterizada por depósitos de cálcio (Ca) no parênquima renal. O fósforo dietético (P), em particular, é um fator fundamental no desenvolvimento desse distúrbio. Foi demonstrado que a administração de uma dieta rica em P resulta em aumento da concentração de Ca norime depósitos de Ca no parênquima renal1-6）. Embora o efeito de uma dieta rica em P no desenvolvimento da nefrocalcinose tenha sido foco de estudos em andamento, pouco se sabe sobre o mecanismo responsável pelo desenvolvimento desse distúrbio. Assim, é necessária uma resolução atempada desta questão.

Relatamos que ao exame histológico usando microscopia eletrônica de transmissão, cristais em forma de agulha semelhantes a hidroxiapatita foram observados nos túbulos renais de ratos alimentados com dieta rica em P6, 7）. A microanálise de raios-X indicou que os depósitos de Ca induzidos por uma dieta rica em P são compostos principalmente de Ca e P7）. Esses resultados revelaram que os depósitos de Ca induzidos por uma dieta rica em P são uma forma de hidroxiapatita. Com base nesse achado, postulamos que o desenvolvimento da nefrocalcinose é controlado por um mecanismo semelhante ao da formação óssea. Portanto, o presente estudo se concentrou em proteínas associadas ao osso, como a proteína morfogenética óssea 2 (BMP2). BMP2 é um fator osteogênico que exibe atividade indutora de osteogênese8,9）. Ressalta-se que BMP2 foi identificado como fator indutor deossoformação10, 11）. Assim, levantamos a hipótese de que se BMP2 desempenha um papel importante no desenvolvimento de nefrocalcinose, a expressão desta proteína norimseria regulado positivamente por uma dieta rica em P. O presente estudo teve como objetivo determinar se uma dieta rica em P afeta a expressão de mRNA de Bmp2 norim.

Enquanto isso, nosso estudo anterior relatou que uma dieta rica em P eleva a expressão de osteopontina (OPN) nos túbulos renais usando análise imuno-histoquímica, sugerindo que a OPN pode estar implicada no desenvolvimento de depósitos de Ca induzidos por uma dieta rica em P12）. Portanto, investigamos as mudanças na expressão de mRNA de Spp1 norimtambém.

Os resultados do presente estudo podem fornecer informações valiosas sobre o mecanismo responsável pelo desenvolvimento da nefrocalcinose induzida por uma dieta rica em P.

Materiais e métodos

Animais e dietas.

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Uso de Animais da Universidade de Agricultura de Tóquio e todos os animais foram mantidos de acordo com as diretrizes da universidade para o cuidado e uso de animais de laboratório (Aprovação nº 300049).

É importante notar que ratos fêmeas desenvolvem nefrocalcinose mais facilmente do que ratos machos13, 14）. Além disso, relatamos que uma dieta rica em P aumenta a expressão de OPN nos túbulos renais de ratas12）. O presente estudo utilizou ratas como animais experimentais. Ratos Wistar fêmeas de quatro semanas de idade (Clea Japan, Tóquio, Japão) foram alojados em gaiolas individuais de malha de aço inoxidável. Durante o período experimental, as gaiolas foram localizadas em uma sala com iluminação controlada sob uma luz de 12-h: ciclo escuro (luz, 0800-2000 h), temperatura de 22 ± 1 grau e umidade relativa de 60 por cento a 65 por cento.

A composição das dietas experimentais é mostrada emTabelae 1. As dietas experimentais foram preparadas em referência à dieta AIN{{0}}G diet15). As dietas experimentais continham duas concentrações diferentes de P (dieta controle, 0,3 por cento; dieta com alto teor de P, 1,5 por cento). A concentração de P na dieta rica em P foi fixada em 1,5 por cento, uma vez que nossos estudos anteriores observaram que uma concentração de P na dieta de 1,5 por cento induz

nefrocalcinose grave6, 7, 12, 14） e alta expressão de OPN12）. Todas as dietas experimentais tinham a mesma concentração de Ca (0,5 por cento). As concentrações de P e Ca, determinadas pela análise das dietas experimentais, são mostradas emTabelae 1. Antes do início do estudo, todos os ratos foram aclimatados por 7 dias, período durante o qual tiveram acesso livre à dieta controle e água deionizada. Após o período de aclimatação, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos com pesos corporais médios semelhantes e alimentados com dieta controle (grupo controle) ou dieta com alto teor de P (grupo com alto teor de P) por 14 dias. Os ratos tiveram acesso livre às dietas experimentais designadas e água deionizada durante todo o período experimental. Ao final do período experimental, os ratos foram eutanasiados por injeção intraperitoneal da mistura anestésica (medetomidina, midazolam e butorfanol), e sangue erimamostras foram coletadas para análise. As amostras de sangue foram centrifugadas e os sobrenadantes foram usados ​​como amostras de soro. Os rins foram removidos e a cápsula renal foi descartada. O soro erimas amostras foram armazenadas a -80 graus até serem necessárias para análise. O rim direito foi utilizado para análise quantitativa de mRNA de Bmp2 e Spp1, e o rim esquerdorimfoi utilizado para a análise das concentrações de Ca e P.

Análise mineral.

Amostras das dietas experimentais erinsforam incinerados a 550 graus por 48 h em forno mufla, e os minerais foram extraídos em 1 mol/L de HCl para análise. concentrações de Ca nas dietas experimentais erinsforam determinados por espectrofotometria de absorção atômica16）. concentrações de P nas dietas experimentais erinsforam analisados ​​pelo método de Gomori17）.

Análise quantitativa de mRNA de Bmp2 e Spp1.

O RNA total foi isolado do rim homogeneizado usando o reagente TRIzol (Life Technologies, CA, EUA) de acordo com as especificações do fabricante. A quantidade e a pureza do RNA foram avaliadas usando um NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). O cDNA foi sintetizado usando o SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix para qRT-PCR (Life Technologies) e depois submetido a RT-PCR quantitativo em tempo real usando SYBR Select Master Mix (Life Technologies). Iniciadores específicos18-20）foram usados ​​para a análise de Bmp2 (para frente, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; reverso, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (para frente, 5'- TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; reverso, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3') e Gapdh (para frente, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; reverso, 5'-GCAT-CACCCCATTTGATGTT{{26} }'). A reação de PCR em tempo real foi realizada usando um sistema StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, EUA), e os níveis de expressão de mRNA foram normalizados para níveis de mRNA de Gapdh. O valor do grupo controle foi considerado 1,00.

Análise estatística.

Os resultados são apresentados como as médias ± SEM para cada grupo de 6 ratos. Após a realização de um teste F para determinar a homogeneidade das variâncias, um teste t de Student foi usado para determinar diferenças significativas entre os dois grupos. Caso a homogeneidade das variâncias não fosse igual, foi utilizado o teste t de Welch em vez do teste t de Student. As diferenças foram consideradas significativas em p ＜ 0,05

Resultados

Peso corporal, ingestão alimentar e análise sérica.

O peso corporal final e a ingestão de alimentos foram significativamente diminuídos no grupo de alto P em comparação com o grupo controle (Mesa 2). Rimpeso e concentração de minerais.Rimpesos úmidos e secos foram significativamente aumentados no grupo de alto P em comparação com o grupo controle (Mesa 3). RimAs concentrações de Ca e P também foram significativamente aumentadas no grupo de alto P em comparação com o grupo controle.

Expressão renal de mRNA de Bmp2 e Spp1.

Os níveis de mRNA de Bmp2 no grupo de alto P foram significativamente aumentados em comparação com o grupo controle (FIG.1A). A expressão de mRNA de Spp1 também foi significativamente aumentada no grupo de alto P em comparação com o grupo controle (FIG. 1B).

Discussão

Um dos efeitos fisiológicos bem conhecidos de uma dieta rica em P é o desenvolvimento de nefrocalcinose. No presente estudo, as concentrações de Ca e P nos rins foram aumentadas no grupo de alto P em comparação com o grupo controle, o que é consistente com os resultados dos estudos anteriores1-6）. Estudos anteriores relataram que os escores histológicos de nefrocalcinose foram positivamente correlacionados com as concentrações de Ca e P nos rins4, 21）. Assim, embora nenhuma observação histológica do rim tenha sido realizada no presente estudo, as concentrações aumentadas de Ca e P nos rins indicam que a nefrocalcinose foi induzida pela dieta rica em P.

Como os depósitos de Ca induzidos por uma dieta rica em P são geralmente considerados uma forma de hidroxiapatita6, 7）, levantamos a hipótese de que o desenvolvimento de nefrocalcinose é controlado por um mecanismo semelhante ao da osteogênese. Assim, examinamos os efeitos de uma dieta rica em P na expressão de mRNA de Bmp2 no rim. Os resultados

mostraram que a expressão renal de mRNA de Bmp2 estava aumentada no grupo com alto teor de P e que uma dieta com alto teor de P induz a regulação positiva da expressão de mRNA de Bmp2 no rim. Este achado pode ajudar a explicar o mecanismo de desenvolvimento de nefrocalcinose induzida por uma dieta rica em P. Embora faltem evidências definitivas que sustentem nossa hipótese, uma possibilidade é que a expressão de fatores de transcrição osteogênicos esteja elevada em regiões calcificadas no rim. BMP2 induz a diferenciação de osteoblastos e formação óssea regulando fatores de transcrição osteogênicos como Osterix, Runx2 e Msx28, 9）; assim, BMP2 pode promover nefrocalcinose através da regulação de tais fatores de transcrição osteogênicos. Atualmente, o papel detalhado da BMP2 no desenvolvimento da nefrocalcinose permanece incerto. Além disso, como apenas a expressão do mRNA da Bmp2 foi medida neste estudo, não se sabe se há diferença na expressão da proteína BMP2. No entanto, nossos resultados sugerem um possível mecanismo pelo qual alterações na expressão de BMP2 desempenham um papel potente na patogênese da nefrocalcinose induzida por dieta rica em P.

O presente estudo focou na expressão de mRNA de Spp1 além da expressão de mRNA de Bmp2. Nosso estudo anterior usando análise imuno-histoquímica indicou altos níveis de expressão de OPN nos túbulos renais de ratos alimentados com dieta rica em P12）. O presente estudo descobriu que a expressão de mRNA de Spp1 foi aumentada em aproximadamente 10-vezes no grupo de alto P. Os resultados dos estudos atuais e anteriores revelam que uma dieta rica em P induz a expressão de OPN no rim. Por outro lado, outros pesquisadores mostraram que a OPN como matriz de cálculos é um fator importante na formação de cálculos urinários22,23）; assim, nosso relato anterior sugeriu que a OPN pode ter um papel como componente da matriz na formação de depósitos de Ca induzidos por uma dieta rica em P12）. No entanto, Paloian et al. relataram recentemente que a OPN desempenha um papel na prevenção da nefrocalcinose induzida por dieta rica em P em camundongos OPN KO24）. Ou seja, o papel fisiológico da OPN na nefrocalcinose induzida por dieta rica em P parece ser a supressão em vez de uma promoção da calcificação norim. Além disso, relatórios anteriores descrevem que os níveis de OPN aumentam para compensar mais calcificação ectópica patológica emrime vasculatura como OPN é upregulated no local da calcificação patológica.

Como mencionado acima, o presente estudo sugeriu a importância de BMP2 e OPN na nefrocalcinose induzida por dieta rica em P. Vale ressaltar que os efeitos de BMP2 e OPN no desenvolvimento de nefrocalcinose são regulados por diferentes mecanismos. Essas diferenças mecanísticas podem indicar que o mecanismo subjacente da nefrocalcinose é complicado. O próximo ponto a ser considerado é que a inibição do crescimento pode ter afetado a expressão de mRNA de Bmp2 e Spp1 norimporque o presente estudo observou uma redução do peso corporal final em um grupo de alto P. Observações em nossos estudos anteriores12） e atuais podem ajudar a explicar esse ponto. Anteriormente, relatamos aumento da expressão da proteína OPN nos túbulos renais de ratos cujo crescimento

não foi inibida por uma dieta rica em P12）. Além disso, o presente estudo mostrou inibição do crescimento no grupo de alto P, mas altos níveis de expressão de mRNA de Spp1 no rim. Com base nessas observações, o presente estudo parece ter pouco efeito de inibição do crescimento da expressão de mRNA de Bmp2 e Spp1. No entanto, os detalhes da relação entre a inibição do crescimento e a expressão dos genes Bmp2 e Spp1 permanecem obscuros. Portanto, mais investigações são necessárias para elucidar este ponto.

Em conclusão, para esclarecer o mecanismo do desenvolvimento de nefrocalcinose induzida por uma dieta rica em P, o presente estudo determinou os efeitos de uma dieta rica em P na expressão de mRNA de Bmp2 e Spp1 narim. As concentrações de Ca e P nos rins foram significativamente aumentadas no grupo de alto P em comparação com o grupo controle. Além disso, a expressão de mRNA de Bmp2 e Spp1 foi significativamente aumentada no grupo de alto P em comparação com o grupo controle. Esses resultados indicam que uma dieta rica em P promove a regulação positiva da expressão de mRNA de Bmp2 e Spp1 norim.

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