Efeitos de clareamento da pele e antirrugas de compostos bioativos isolados da casca de amendoim usando extração assistida por ultrassom

Contato:ali.ma@wecistanche.com

Da Hye Gam 1, Ji Woo Hong 1, Jun Hee Kim 1 e Jin Woo Kim 1,2,3,*

Abstrato:A metodologia de superfície de resposta foi empregada para otimizar as condições de extração assistida por ultrassom (UAE) para otimização simultânea de variáveis ​​dependentes, incluindo DPPHradical scavenging activity (RSA), inibição da atividade da tirosinase (TAI) e inibição da atividade da colagenase (CAI) de extratos de casca de amendoim. Os efeitos das principais variáveis, incluindo tempo de extração (5.0~55.0 min, X1), temperatura de extração (26.0~94.0 ◦C , X2) e concentração de etanol (0.0 por cento ~99,5 por cento ,X3) foram otimizados. Com base nos valores experimentais de cada condição, modelos de regressão quadrática foram derivados para a predição das condições ótimas. O coeficiente de determinação (R2) da variável independente ficou na faixa de 0,89~0,96, o que demonstra que o modelo de regressão é adequado para a predição. Na previsão das condições ideais dos Emirados Árabes Unidos com base no método de sobreposição, foram identificados tempo de extração de 31,2 min, temperatura de extração de 36,6 ◦C e concentração de etanol de 93,2 por cento. Nestas condições, foram previstos RSA de 74,9 por cento , TAI de 50,6 por cento e CAI de 86,8 por cento, mostrando boa concordância com os valores experimentais. Uma reação em cadeia de transcrição reversa da polimerase mostrou que o extrato de casca de amendoim diminuiu os níveis de mRNA detirosinaseproteínas relacionadas-1 e genes de metaloproteinase de matriz-3 em células B16-F0. Por isso, identificamos oClareamento da pelee anti-rugas de extratos de casca de amendoim em níveis de expressão proteica e gênica, e os resultados mostram que a casca de amendoim é um material cosmético eficaz paraClareamento da pelee efeitos anti-rugas. Com base neste estudo, a casca de amendoim, que era considerada um subproduto, pode ser utilizada para o desenvolvimento de alimentos saudáveis, medicamentos e cosméticos.

Palavras-chave:casca de amendoim; otimização;Clareamento da pele; anti-rugas; antioxidante;tirosinase; colagenase; proteína relacionada à tirosinase humana-1 (TRP-1); metaloproteinase de matriz (MMP)

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1. Introdução

A melanina é um pigmento polimérico de cor marrom ou preta que é sintetizado a partir dos melanossomas dos melanócitos na epiderme. Sua principal função é bloquear os raios ultravioleta (UV) para proteger a pele. Alternativamente, sua produção excessiva pode causar escurecimento de pigmentos, como melasma, verrugas e manchas da idade [1-3]. A tirosinase é a principal enzima que catalisa as reações de autooxidação e polimerização, através da qual a tirosina é convertida em dopaquinona via dihidroxifenilalanina e produz melanina através da dopacromia durante a biossíntese de melanina [4]. Assim, é amplamente utilizado para reduzir ou atenuar a produção de melanina através da inibição datirosinasepara potencializar o efeito clareador dos cosméticos [5]. A rápida industrialização e o aumento do uso de clorofluorcarbonos danificaram gravemente a camada protetora de ozônio da Terra, resultando em uma maior quantidade de UV atingindo o solo e expondo a pele. Este aumento da radiação UV, consequentemente, induz a geração ativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) no corpo humano, como ânions superóxidos, peróxidos de hidrogênio e radicais hidroxila. Tais espécies têm promovido a oxidação contínua da tirosina, resultando em aumento da produção de melanina. Nesse sentido, estudos são conduzidos ativamente sobre a inibição detirosinaseatividade, bem como a remoção de ROS, a fim de desenvolverClareamento da peleagentes [6]. O colágeno é uma matriz extracelular importante que compreende 90 por cento da derme. O colágeno protege e dá elasticidade à pele e está envolvido na rigidez mecânica da pele, resistência, ligação dos tecidos conjuntivos e proliferação e diferenciação das células [7]. As proteínas que compõem a matriz extracelular, como o colágeno, são decompostas por colagenase, como a metaloproteinase da matriz (MMP), causando rugas, diminuição da elasticidade e flacidez da pele [8]. Vários tipos de MMPs que são expressos por ROS hidrolisam a cadeia de colágeno, o tecido conjuntivo da pele e geram sua reticulação anormal para aumentar a decomposição do colágeno e acelerar a formação de rugas [9]. Por esta razão, a inibição da produção de melanina e decomposição do colágeno através da redução da geração de ROS tem sido o principal foco para o clareamento da pele e prevenção de rugas [10]. cosméticos anti-rugas, têm sido amplamente utilizados nos últimos anos. No entanto, o uso desses materiais é limitado, dada sua instabilidade na presença de luz e calor, bem como reações adversas, incluindo irritação da pele e dermatite de contato [11]. Com o crescente interesse em antioxidantes naturais para superar as deficiências dos ingredientes convencionais de clareamento e antirrugas, os extratos derivados de plantas têm sido usados ​​ativamente para desenvolver compostos bioativos para a pele amigáveis ​​e seguros.branqueamentoe cosméticos antirrugas [12,13].

Existem vários métodos de extração que são atualmente utilizados para a extração de compostos bioativos de plantas. No entanto, a extração de compostos bioativos de fontes naturais, especialmente plantas, tem sido realizada principalmente por métodos de extração por solvente, água quente e Soxhlet, que têm apresentado várias desvantagens, incluindo baixa eficiência de extração, decomposição de ingredientes, baixa estabilidade e alto custo de operação. [14]. Assim, métodos de extração foram recentemente testados, incluindo a extração assistida por ultrassom, assistida por micro-ondas e extração supercrítica [15]. Em particular, o ultrassom é uma onda sonora com frequência de aproximadamente 20 kHz ou mais, que resulta em compressão, cavitação e rarefação do líquido, maximizando assim o movimento molecular em um curto espaço de tempo para obter alta eficiência de extração [16]. Além disso, o ultrassom é vantajoso, pois seu curto tempo de extração minimiza a decomposição de compostos bioativos e é avaliado como um método eficaz para a extração de ingredientes naturais com ação antioxidante,branqueamento, e propriedades anti-rugas de muitas plantas e ervas [17]. A otimização da condição de extração é essencial para aumentar a eficiência da extração assistida por ultrassom (EAU), e o processo de otimização pode ser realizado por métodos experimentais ou estatísticos. O método tradicional de um fator de cada vez, com todas as variáveis ​​permanecendo constantes e mudando apenas um fator de cada vez, tem limitações na determinação dos efeitos interativos se for um experimento multivariado. Por outro lado, o RSM fornece informações estatísticas sobre a correlação entre variáveis ​​em experimentos multivariados, juntamente com experimentos efetivos usando número mínimo de amostras, bem como importantes técnicas matemáticas e estatísticas para avaliar a eficácia e adequação do modelo de regressão. vários projetos RSM, como projeto fatorial completo, projeto Box-Behnken e projeto composto central (CCD), têm sido amplamente utilizados. Entre eles, o CCD é muito eficiente e, portanto, fornece muitas informações sobre os efeitos das variáveis ​​do experimento e o erro experimental geral, com um número mínimo de execuções necessárias [18]. Portanto, em muitos estudos existentes, o CCD tem sido amplamente utilizado para desenvolver, melhorar e otimizar o processo condições para a extração de vários antioxidantes e outros metabólitos de produtos naturais.

O amendoim (Arachis hypogaea) é uma planta anual pertencente à família das leguminosas. É cultivada em mais de 50 países ao redor do mundo, incluindo Coréia do Sul, Índia, China e Estados Unidos [19]. Os amendoins são fontes ricas de proteínas (25%), lipídios (47%) e carboidratos (16%), bem como minerais, vitaminas, niacina, ácidos graxos insaturados e ácidos andoleicos [20]. Eles são consumidos como produtos não processados ​​ou processados, incluindo nozes, manteiga e óleo de cozinha. Estima-se que a produção anual mundial de amendoim seja de 4,1 milhões de toneladas no total e que a casca do amendoim represente 35% ~ 40% do peso total do amendoim [21]. Estima-se que mais de 1,5 milhão de toneladas de cascas de amendoim são descartadas anualmente como subprodutos. No entanto, tendo em vista que apenas uma parte das cascas de amendoim é utilizada como ração animal e que a maioria é incinerada ou aterrada, causando custos de descarte e problemas ambientais, é necessário produzir materiais de alto valor agregado utilizando cascas de amendoim para superar o problema dos subprodutos [22]. ]. Estudos anteriores sobre antioxidantes mostraram que atividades anti-inflamatórias e anti-obesidade de extratos de casca de amendoim foram relatadas [23,24]. No entanto, até o momento, não há pesquisas sobre a produção de materiais cosméticos funcionais para melhorarbranqueamentoe efeitos anti-rugas usando compostos bioativos de cascas de amendoim. Portanto, este estudo extraiu compostos bioativos de uma casca de amendoim empregando a extração assistida por ultrassom (EAU) para confirmar seus efeitos antioxidantes, clareadores e antirrugas e ainda apresentou uma condição ideal de EAU usando o método de superfície de resposta (RSM) e aumentou a funcionalidade dos extratos a fim de confirmar a possibilidade de seu uso como alimentos, cosméticos e ingredientes médicos.

2. Resultados e Discussão

2.1. Ajustando os modelos RSM

Neste trabalho, a temperatura de extração, o tempo de extração e a concentração de etanol foram selecionados como as principais variáveis ​​do CCD usando o experimento preliminar de um fator por vez para determinar as variáveis ​​significativas que afetam os EAU (Tabela 1).

Em seguida, foram construídas 17 corridas experimentais, incluindo 3 réplicas no ponto central usando 3-variáveis ​​e CCD de 5 níveis. Erros experimentais foram minimizados pela randomização da ordem experimental, a fim de minimizar o impacto da variabilidade inexplicada. Os resultados experimentais e previstos para a atividade de eliminação do radical DPPH (RSA),tirosinaseinibição de atividade (TAI) e inibição de atividade de colagenase (CAI) são mostradas na Tabela 2.

Para determinar a correlação entre as 17 corridas experimentais das condições experimentais do CCD e os resultados experimentais, foram propostos modelos de regressão múltipla para prever os níveis ótimos dessas 3 variáveis. Aplicando a análise de regressão múltipla aos dados experimentais, as variáveis ​​dependentes (Y) e as variáveis ​​testadas foram relacionadas pelas seguintes equações de regressão quadrática (Tabela 3).

A análise de variância (ANOVA) é um teste estatístico para analisar dados experimentais. Ele subdivide a variação total em um conjunto de dados em partes componentes que são associadas a fontes específicas de variação para testar uma hipótese sobre as variáveis ​​do modelo ou para estimar componentes de variância [25]. Análise de superfície de resposta e ANOVA foram empregados para determinar os coeficientes, avaliar a significância estatística dos termos do modelo e ajustar os modelos matemáticos dos dados experimentais que visavam otimizar a região global para as variáveis ​​de resposta [26]. Conforme estabelecido pelo modelo, os coeficientes de correlação (R2) usados ​​para determinar a relação entre as respostas experimentais e previstas pelos modelos de regressão ficaram na faixa de 0,8862~0,9622. Isso sugere que as variáveis ​​de processo analisadas explicam mais de 88,6% das variáveis ​​independentes. O software Design-Expert foi utilizado para calcular os coeficientes das equações de regressão quadrática e a adequação do modelo foi testada por ANOVA. De acordo com o valor do coeficiente monomial das equações de regressão quadrática estão listadas na Tabela 4 e a ordem de prioridade entre os principais efeitos das variáveis ​​independentes é concentração de etanol (X3) > temperatura de extração (X2) > tempo de extração (X1).

2.2. Efeito das Condições de Extração no RSA

A Tabela 2 mostra os dados experimentais do RSA de acordo com as diferentes condições dos EAU. O RSA do extrato de casca de amendoim foi determinado na faixa de 7,6 por cento ~ 89,9 por cento. O maior RSA foi identificado nas seguintes condições de extração: tempo de extração de 55.0 min, temperatura de extração de 60.{{10}} ◦C, e concentração de etanol de 5 0.0 por cento (Execução nº 10). O RSA mais baixo de 7,6 por cento, sob um tempo de extração de 30.0 min, temperatura de extração de 60,0 ◦C e concentração de etanol de 0,0 por cento, foi identificado como o valor experimental (Execução #13) . Aplicando a análise de regressão múltipla, os dados experimentais e as respostas foram relacionados por equações de regressão quadrática (Tabela 3). A análise estatística revelou que o R2 do modelo de regressão foi de 0,9308 (p=0,0027), o que indica que esta equação poderia explicar 93,0 por cento dos resultados das condições experimentais, implicando que o modelo era altamente significativo e poderia ser usado para prever com precisão a função de resposta.

O efeito de uma variável individual dos EAU em níveis fixos de outras variáveis ​​no RSA é previsto e mostrado na Figura 1a. A RSA tende a aumentar e depois diminuir à medida que todas as variáveis ​​dos EAU aumentaram. A concentração de etanol teve o maior efeito no RSA entre as três variáveis ​​de EAU, enquanto o tempo de extração e a temperatura de extração tiveram o menor efeito no RSA. Este resultado é consistente com os resultados da ANOVA em que a concentração de etanol mostrou um efeito mais significativo (p=0.0002) no RSA conforme mostrado na Tabela 4. O efeito da interação entre variáveis ​​independentes no RSA foi visualizado em 3D curvas de superfície de resposta. A temperatura de extração e o tempo de extração foram alterados simultaneamente no nível fixo de concentração de etanol (Figura 2A). À medida que as duas variáveis ​​(temperatura de extração e tempo) aumentaram, o RSA aumentou para o nível máximo e depois diminuiu novamente. A maior RSA foi obtida na temperatura de extração de 56,1 ◦C, o que sugere que a extração de compostos bioativos com potencial antioxidante, como os polifenóis, aumenta com a destruição de componentes da parede vegetal, como a lignina, em temperaturas de até 56,1 ◦C; no entanto, em temperaturas mais altas, o RSA foi diminuído devido à decomposição ou polimerização de ingredientes antioxidantes. A Figura 2B, C mostra que o RSA não foi significativamente afetado pelo tempo ou temperatura de extração, enquanto o RSA foi significativamente afetado pela concentração de etanol, que foi a mais alta na concentração de etanol de 61,0 por cento e que também diminuiu novamente. Este resultado é consistente com o experimento de extração de água quente de Lespedeza cuneata por Kim et al. em que RSA foi mais afetado pela concentração de etanol do que a temperatura de extração, e RSA foi o máximo na faixa de concentração de etanol de 60 por cento ~ 70 por cento [27]. Esses resultados indicam que a eficiência de extração do solvente binário (água e etanol) é mais eficaz para a extração de um único solvente nos Emirados Árabes Unidos de cascas de amendoim.

2.3. Efeito das Condições de Extração no TAI

Tirosinaseé uma enzima que promove a produção de melanina pela oxidação da tirosina na camada basal da epiderme e a inibição desta enzima é essencial para o aumento daClareamento da pele [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >temperatura de extração (p < {{0}},0598) > tempo de extração (p < 0,4329), o que confirmou que o efeito da concentração de etanol foi o mais significativo no IATF.

Para comparar o efeito das condições de EAU no TAI, o gráfico de perturbação foi utilizado para avaliar o efeito de variáveis ​​individuais no TAI, fixando duas variáveis ​​no ponto central. Conforme mostrado na Figura 1b, o TAI apresentou um padrão diferente em relação ao experimento RSA anterior; aumentou à medida que a concentração de etanol aumentou, enquanto o tempo de extração não afetou significativamente o TAI. O aumento proporcional significativo do IATF com a concentração de etanol pode ser explicado pelos resultados da ANOVA. O TAI foi afetado significativamente pelo termo primário de concentração de etanol (X3), e (p < 0.05)="" o="" termo="" quadrático="" não="" é="" estatisticamente="" significativo,="" mostrando="" assim="" uma="" forte="" relação="" proporcional="" entre="" o="" tai="" e="" a="" concentração="" de="" etanol.="" a="" curva="" de="" superfície="" de="" resposta="" 3d="" é="" a="" representação="" gráfica="" da="" equação="" de="" regressão="" quadrática="" e="" dos="" resultados="" do="" tai,="" conforme="" afetado="" pela="" temperatura="" de="" extração="" (x1),="" tempo="" de="" extração="" (x2)="" e="" concentração="" de="" etanol="" (x3).="" a="" figura="" 3a="" visualiza="" o="" efeito="" de="" interação="" do="" tempo="" de="" extração="" e="" concentração="" de="" etanol="" no="" tai.="" o="" resultado="" confirmou="" que="" o="" tempo="" de="" extração="" não="" apresentou="" efeito="" significativo="" sobre="" o="" iatf,="" enquanto="" a="" concentração="" de="" etanol="" teve="" uma="" forte="" relação="" proporcional="" com="" o="" iatf.="" da="" mesma="" forma,="" como="" mostrado="" na="" figura="" 3b,="" o="" tai="" foi="" mais="" dependente="" da="" concentração="" de="" etanol="" do="" que="" da="" temperatura="" de="" extração="" e="" o="" maior="" tai="" foi="" alcançado="" quando="" a="" concentração="" de="" etanol="" aumentou="" para="" 99,5="" por="" cento.="" ao="" explorar="" as="" condições="" dos="" eau="" para="" tai="" máximo,="" os="" valores="" máximos="" das="" condições="" tai="" foram="" previstos="" como="" 3{{20}},0="" min,="" 26,3="" ◦c="" e="" 99,5="" por="" cento.="" esse="" resultado="" é="" semelhante="" ao="" relatado="" por="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" em="" um="" estudo="" sobre="" a="" atividade="" biológica="" de="" folhas="" de="" cidra,="" quando="" 20,0="" por="" cento="" ~="" 80,0="" por="" cento="" de="" etanol="" foi="" usado="" como="" solvente="" de="" extração,="" o="" tai="" aumentou="" proporcionalmente="" em="" resposta="" ao="" aumento="" da="" concentração="" de="" etanol="" e="" mostrou="" valor="" máximo="" na="" extração="" usando="" 80="" por="" cento="" de="" etanol.="" isso="" sugere="" que="" o="" uso="" de="" uma="" maior="" concentração="" de="" etanol="" é="" vantajoso="" na="" extração="" de="" compostos="" bioativos="">Clareamento da peleefeito de cascas de amendoim ou outras plantas.

2.4. Efeito das Condições de Extração no CAI

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >concentração de etanol (p=0.0240) > tempo de extração (p=0.8505), indicando que o efeito da temperatura de extração e concentração de etanol foram significativos no CAI.

A Figura 1c mostra um gráfico de perturbação no qual duas variáveis ​​são fixas e visualiza o efeito de uma única variável no CAI. Os efeitos das três variáveis ​​no CAI mostraram-se semelhantes, e as três variáveis ​​apresentaram efeitos significativos e aumentaram e, posteriormente, diminuíram o CAI à medida que cada variável independente aumentava. Em nosso estudo, curvas de resposta de superfície 3D foram desenvolvidas para visualizar a interação de duas variáveis ​​independentes no CAI usando equações de regressão quadrática (Figura 4). Quando a concentração de etanol foi fixada no ponto central, o efeito do tempo e temperatura de extração no CAI foi avaliado na Figura 4A. À medida que as duas variáveis ​​mudaram simultaneamente, o CAI aumentou para 33,4 min e 76,8 ◦C e diminuiu novamente após um CAI máximo de 92,8%. Conforme mostrado na Figura 4B, C, CAI teve o maior valor na concentração de etanol de 64,3 por cento, mostrando uma tendência decrescente gradual depois, o que sugere que um solvente binário composto por 64,3 por cento de etanol é mais adequado como solvente de extração. Este resultado é consistente com pesquisas anteriores que relataram que um solvente binário de água e etanol apresentou um CAI maior que a água na extração de compostos bioativos de Orostachys japonica, o que sugere que 50% de etanol seria mais vantajoso na extraçãoClareamento da peleingredientes [34]. O IAC máximo do extrato de casca de amendoim previsto pelo modelo de regressão quadrática foi de 94,5 por cento , obtido nas condições de tempo de extração de 45,1 min, temperatura de extração de 93,6 ◦C e concentração de etanol de 42,3 por cento . O CAI obtido em nosso estudo foi de 94,5 por cento, o que é mais que o dobro dos efeitos de 39,4 por cento e 40,3 por cento dos valores de CAI dos extratos de chá verde relatados por Oh et al. [35].

2.5. Condições de extração ideais

antioxidante,Clareamento da pelee os efeitos anti-rugas são funções importantes para os cosméticos e é necessário derivar condições que possam maximizar essas três funções simultaneamente na otimização das condições dos Emirados Árabes Unidos. A Figura 5 mostra um procedimento de otimização que pode maximizar simultaneamente RSA (Y1), TAI (Y2) e CAI (Y3) sobrepondo cada condição ideal de um gráfico de contorno derivado de uma equação de regressão quadrática. Os intervalos de variáveis ​​independentes para a otimização de três variáveis ​​foram limitados ao tempo de extração de 5.0~55.0 min, temperatura de extração de 26.{{10}}~94 .0 ◦C e concentração de etanol de 0,0 por cento ~ 99,5 por cento (Tabela 5). De acordo com as condições de extração ótimas individuais, as condições ótimas dos EAU foram 31,2 min de tempo de extração, 36,6 ◦C de temperatura de extração, 93,2 por cento de concentração de etanol e, sob as condições acima, RSA de 74,9 por cento, TAI de 50,6 por cento e CAI de 86,8 por cento foi previsto. Quando os valores previstos de RSA, TAI e CAI foram comparados aos obtidos no experimento para validação, os valores do teste de validação foram semelhantes aos valores previstos, onde os valores foram 78,2 por cento , 52,3 por cento e 87,7 por cento , respectivamente.

2.6. Comparação de SE e Emirados Árabes Unidos

Para confirmar a eficácia da extração de EAU, comparamos RSA, TAI e CAI de extrato de casca de amendoim produzido usando as técnicas de extração de EAU e Soxhlet (SE). Quando o SE foi conduzido sob condições gerais de SE usando 99,5% de etanol a 7{15}} ◦C por 4 h de extração, RSA, TAI e CAI foram encontrados em 75,5%, 60,2% e 74,4%, que não foram muito diferente dos resultados obtidos sob condições ideais dos Emirados Árabes Unidos. No entanto, quando as condições SE foram definidas iguais às condições ideais dos Emirados Árabes Unidos de 31,2 min e 93,2 por cento de etanol, RSA, TAI e CAI diminuíram 62,0, 28,3 e 45,6 por cento, respectivamente, em comparação com os Emirados Árabes Unidos em condições ideais. A vantagem do ultrassom na produção de materiais úteis a partir da casca de amendoim foi avaliada como um processo adequado para alta produtividade e industrialização devido ao baixo consumo de solvente e curto tempo de extração.

2.7. Expressão de mRNA de MMP-3 e TRP-1

Em melanócitos de mamíferos, a melanogênese e a hidrólise do colágeno são controladas pelos genes TRP e MMP, respectivamente, e TRP{0}} e MMP-3 são conhecidos como os principais genes para a regulação da melanogênese e hidrólise do colágeno; portanto, a análise de RT-PCR em lisados ​​de células inteiras de células B16-F0 foi realizada e o efeito do extrato de casca de amendoim produzido a partir dos Emirados Árabes Unidos em condições ideais (31,2 min, 36,6 graus, 93,2 por cento) na expressão de mRNA de MMP-3 e TRP-1 foi estudado. Como mostra a Figura 6, o extrato de casca de amendoim reduziu significativamente a expressão de MMP-3 e TRP-1 em células B16-F0 quando os experimentos de expressão gênica foram realizados com um amendoim faixa de concentração de extrato de casca de 0~1 mg/mL. O extrato de casca de amendoim reduziu significativamente a expressão de MMP-3 e TRP-1 em 6.1-vezes e 8.7-vezes, respectivamente, em 1.0 mg /ml. Esses resultados sugerem que o extrato de casca de amendoim inibe a degradação do colágeno em células B16F0 pela inativação de MMP 3 para inativação de MMP-1 e interfere na cooperação de MMP-9 [36]. Estudos existentes mostraram que o tratamento com extratos de plantas inibiu a expressão do fator de transcrição associado à microftalmia (MITF) por fosforilação de proteína quinase regulada por sinal extracelular (ERK). Assim, o efeito inibitório da produção de melanina pelo extrato de casca de amendoim é atribuído à inibição datirosinaseatividade através da inibição da expressão de ERK e MITF [37]. Assim, os extratos de casca de amendoim reduziram os níveis de expressão de mRNA de TRP-1 e MMP-3, o que indica que o extrato de casca de amendoim possui fortes atividades inibitórias sobre colagenólise e melanogênese tornando-se um excelente material cosmético comClareamento da pelee efeitos anti-rugas.

3. Materiais e Métodos

3.1. Materiais e Reagentes

As cascas de amendoim foram compradas no Nonghyup mart (Gochang, Jeonbuk, Korea) em 2 de março019 e as cascas foram secas a 60 ◦C usando forno seco (FC 49, Lab House, Seoul, Korea) por 24 h até a peso seco permaneceu constante. Cascas de amendoim secas foram pulverizadas em processador de alimentos (Hanil HMF-3800, Seul, Coréia) e, em seguida, passadas em peneira de 600 µm. O etanol foi adquirido da Samchun Chemical (95,0 por cento v/v, Seul, Coréia). O reagente Folin-Ciocalteu, ácido gálico (97 por cento) e quercetina foram adquiridos da Merck (Kenilworth, NJ, EUA). 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), ácido ascórbico e 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Todos os outros produtos químicos usados ​​neste experimento eram de grau analítico e adquiridos da Sigma-Aldrich. Todas as soluções estoque foram preparadas com água deionizada purificada usando um sistema de purificação Milli-Q (Millipore, Burlington, VT, EUA).

3.2. Extração assistida por ultrassom e extração Soxhlet

Casca de amendoim em pó (1 g) foi colocada em um recipiente de extração, cada um com 10 mL de solvente e misturado usando um misturador de vórtice (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Coréia) para 1 minuto. A extração foi realizada por circulação de água no extrator ultrassônico (250 W, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Coréia) usando um circulador de banho refrigerado externo (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Coréia ) com temporizador digital e controlador de temperatura. A extração foi realizada com o aparelho ultrassônico equipado com um temporizador digital e um controlador de temperatura. A amostra foi sonicada por várias durações e temperaturas experimentais a uma frequência de trabalho de 40 kHz. Em seguida, o extrato foi centrifugado a 10,{10}} rpm por 10 min (236R, Labogene, Seul, Coréia). Após a centrifugação, os volumes de amostra foram completados até 5 mL e filtrados através de um filtro de membrana de 0,2 µm antes da análise. Para a extração em Soxhlet, a casca de amendoim em pó (5 g) foi extraída continuamente com 100 mL usando etanol 99,5 por cento por 4 h (8 ciclos) a uma temperatura máxima de 70 ◦C em um aparelho Soxhlet. A técnica de extração assistida por ultrassom mostrou-se muito eficiente na extração de óleo de semente de uva a vantagem do ultrassom, em comparação com os métodos convencionais de extração tanto de óleo quanto de polifenóis, foi semelhante, pois o rendimento de óleo/polifenóis obtido com menor consumo de solvente e menor tempo de extração.

3.3. Design experimental

O desenho experimental foi realizado utilizando CCD, um tipo de RSM para minimizar o número de execuções experimentais e estudar a interação entre os fatores. O software Design-Expert® 8.0 (State-Ease, City, MN, USA) foi utilizado para o desenho de experimentos, análise de dados e otimização das condições de extração para maximizar a extração de compostos bioativos com propriedades antioxidantes,Clareamento da pele, e efeitos antirrugas da casca de amendoim. Os experimentos foram desenhados de acordo com o CCD, os valores do intervalo e do ponto central das três variáveis ​​independentes apresentadas foram baseados nos resultados de experimentos preliminares (Tabela 1). O CCD foi aplicado para prever as condições ideais dos EAU para a maximização das respostas, incluindo RSA, TAI e CAI de cascas de amendoim. Como variáveis ​​independentes, as três variáveis ​​escolhidas foram tempo de extração (X1), temperatura de extração (X2) e concentração de etanol (X3). Um total de 17 corridas experimentais foram geradas com três repetições nos pontos centrais para estimar a reprodutibilidade. O modelo de regressão quadrática foi utilizado para ajustar os dados experimentais e aplicado para predizer as variáveis ​​de resposta, conforme mostrado na Equação (1):

Y= 0 mais 1X1 mais 2X2 mais 3X3 mais 11X12 mais 22X22 mais 33X32 mais 12X1X2 mais 13X1X3 mais 23X2X3 (1)

onde Y é a resposta prevista; 0 é a constante (interceptação); 1, 2 e 3 são os coeficientes de regressão para os termos do efeito linear; 11, 22 e 33 são os termos de efeito quadrático; e 12, 13 e 23 são os termos do efeito de interação, respectivamente. Uma análise de superfície de resposta e a ANOVA foram empregadas para determinar os coeficientes de regressão e significância estatística dos termos do modelo e para ajustar os modelos matemáticos do experimental [38].

3.4. Atividade de eliminação de radicais DPPH (RSA)

O RSA do extrato de casca de amendoim foi descrito por Pereira-Caro et al. [39]. Solução de 0.01 mM DPPH em metanol (95 por cento) foi preparada e 1,25 mL foi adicionado a 0,25 mL de extrato diluído. O RSA foi determinado para medir a absorbância a 517 nm usando espectrofotômetro UV-Vis (UV1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japão) após 20 min de incubação. O branco foi preparado usando água destilada e o RSA foi calculado de acordo com o abaixo. (Equação (2)):

RSA ( por cento )={1 −Abs (amostra) /Abs (controle) }× 100 (2)

3.5. Inibição da atividade da tirosinase (TAI)

A IATF foi realizada de acordo com o método modificado usando L-DOPA como substrato por Jo et al. [40]. As amostras foram misturadas com 200 µL de L-DOPA e 200 µL de tampão fosfato de potássio (pH 6,8) e 200 µL detirosinase(125 U/mL) foi adicionado ao tubo de ensaio e incubado a 37 ◦C por 20 min. A absorbância da amostra foi medida em 475 nm usando um espectrofotômetro UV-Vis e os resultados foram comparados com o controle. Para cada concentração, a atividade enzimática foi calculada como uma porcentagem em comparação com a do ensaio usando um tampão sem qualquer inibidor, e o TAI foi calculado com base na fórmula a seguir. (Equação (3)):

TAI ( por cento )={1 −Abs (controle) − Abs (amostra) /Abs (controle)}× 100 (3)

onde Abs (controle) é a absorbância do tampão mais colagenase; Abs (amostra) é a absorbância do tampão mais colagenase mais amostra/padrão.

3.6. Inibição da atividade da colagenase (CAI)

A mensuração do CAI dos extratos foi realizada modificando os métodos de Wünsch e Heindrich [41]. O substrato, 4-fenilazobeziloxilcarbonil-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA), foi dissolvido em 10 mL de tampão a 1,2 mg/mL e, em seguida, 125 µL de solução foi adicionado e incubado por 60 min a 37 ◦C. A colagenase foi dissolvida no tampão a 0,4 mg/mL, e 75 µL de solução enzimática foram adicionados à solução tampão. A mistura enzima-substrato foi incubada em banho-maria a 37 ◦C por 30 min e a reação foi interrompida pela adição de 75 µL de ácido cítrico a 20% (p/v). Após adição de 1,5 mL de acetato de etilo, a camada de acetato de etilo foi separada e a absorvância foi medida a 320 nm. A percentagem de inibição foi calculada de acordo com a fórmula seguinte.

CAI ( por cento )={1 − [Abs (controle) − Abs (amostra)] /Abs (controle)}× 100 (4)

onde Abs (controle) é a absorbância do tampão mais colagenase; Abs (amostra) é a absorção de tampão mais colagenase mais amostra/padrão.

3.7. Manutenção e Cultivo de Linhas Celulares

A célula de melanoma B16-F0 produtora de melanina foi obtida do Korea Cell Line Bank (KCLB, Chongno, Seoul, Korea) e foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com soro fetal bovino (FBS, 10 por cento, Welgene, Gyeongsan, Coréia) e solução antibiótica de penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). A tripsina-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, EUA) foi utilizada para a tripsinização das células. Todos os materiais utilizados eram de grau de cultura de células.

3.8. Reação em Cadeia da Polimerase de Transcrição Reversa (RT-PCR)

O RT-PCR foi realizado para medir as alterações nos níveis de expressão dos genes MMP-3 e TRP-1 associados abranqueamentoe antirrugas, células B16-F0 foram cultivadas em uma24-placa de poço tratada com as diferentes concentrações de extrato de casca de amendoim em DMEM sem soro e incubadas por 24 h. O controle de células não tratadas foi mantido nas mesmas condições do grupo testado durante o experimento. O isolamento de RNA das células foi realizado usando o AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, Daejeon, Coréia). O DNA complementar foi sintetizado usando a síntese de cDNA AmfiRiert Platinum MasterMix (GenDEPOT, Barker, TX, EUA). A análise de RT-PCR foi realizada usando o CFX 96 touch PCR System (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) para determinar os níveis de mRNA. Os primers utilizados foram os seguintes: MMP-3 sentido, {{10}}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-30 e antisense, 50-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-30; e TRP-1 sentido, 50-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 e antisense, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30. Um conjunto apropriado de primers mencionados acima foi usado para amplificar os respectivos genes usando as seguintes condições de ciclagem: 94 ◦C por 5 min, seguido por 25 ciclos a 95 ◦C por 5 s, 60 ◦C por 30 s (forMMP-3) , e 60 ◦C por 30 s (para TRP-1) e 72 ◦C por 30 s de extensão. Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e visualizados usando Gel Doc TM XR plus System e software Quantity One 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Uma proteína de manutenção, -actina, foi usada como controle de carga com a suposição de que os níveis de expressão dessas proteínas permanecem constantes.

4. Conclusões

Neste estudo, a abordagem complementar foi empregada para a recuperação e uso de substâncias bioativas de subprodutos agrícolas da casca de amendoim para desenvolver ingredientes de valor agregado com múltiplos usos. Em primeiro lugar, tentamos aumentar a eficiência de extração de compostos bioativos com efeitos antioxidantes, clareadores da pele e antirrugas, otimizando o processo dos Emirados Árabes Unidos. Portanto, este estudo empregou os Emirados Árabes Unidos para produção eficiente de compostos bioativos comClareamento da pelee efeitos anti-rugas de cascas de amendoim e otimização baseada em estatística aplicada para maximizar RSA, TAI e CAI simultaneamente. As condições dos EAU foram otimizadas usando CCD e foi confirmado que a escolha do solvente e da concentração deve ser considerada na extração de compostos bioativos das cascas de amendoim. Sobrepondo as superfícies de resposta, curvas de três variáveis ​​dependentes, tempo de extração de 31,2 min, temperatura de extração de 36,6 ◦C e concentração de etanol de 93,2 por cento foram determinadas como as condições ótimas dos Emirados Árabes Unidos. Foi confirmado que o RSA dos extratos de casca de amendoim é muito alto e pode-se esperar um aumento no IAT e CAI, que são indicadores deClareamento da pelee efeitos anti-rugas, respectivamente. A otimização das condições dos Emirados Árabes Unidos confirmou um aumento na produção de substâncias bioativas na casca de amendoim e atividades clareadoras e antirrugas do extrato de casca de amendoim por meio detirosinasee downregulations da atividade da colagenase. Com base nisso, o efeito das cascas de amendoim sobre os níveis de expressão de MMP e TRP foi avaliado para avaliar se eles têm efeitos clareadores e antirrugas em nível de expressão gênica. expressões de mRNA, bem como a inibição de expressões de proteínas de MMP-3 e TRP-1. Portanto, o extrato de casca de amendoim tem se mostrado eficaz embranqueamentoe melhora das rugas na expressão de proteínas e níveis gênicos. O extrato de casca de amendoim, usando Emirados Árabes Unidos, possui alta atividade antioxidante e excelentes efeitos clareadores e antirrugas da pele, dando à casca de amendoim um grande potencial como cosmético natural e ingrediente alimentar. Além disso, acredita-se que a produção de compostos bioativos utilizando EAU pode ser aplicada ao processo de comercialização para a produção de cosméticos, alimentos e insumos farmacêuticos, dado o maior rendimento de produção e menor custo de processamento em relação aos processos convencionais.