A hemodiálise aumenta o estresse oxidativo por meio de radicais centrados em carbono, apesar da biocompatibilidade melhorada

Ativação de leucócitos e a resultanteestresse oxidativoinduzido pormateriais bioincompatíveisduranteimpacto da hemodiáliseo prognóstico dos pacientes. Apesar dos múltiplos avançosdialisadores de hemodiálise, oprognóstico da hemodiálisepacientes com complicações profundamente relacionadasestresse oxidativo, comodiabetes mellitus permanece pobre. Assim, reavaliamos os efeitos dehemodiáliseon de múltiplas espécies reativas de oxigênio usando métodos baseados em ressonância de spin eletrônico para melhoria adicional debiocompatibilidadeemhemodiálise. Inscrevemos 31 pacientes em condição estável submetidos à hemodiálise com dialisadores de polissulfona de alto fluxo. Os efeitos da hemodiálise nas espécies reativas de oxigênio foram avaliados por dois métodos: MULTiS, que avalia atividades de eliminação de soro contra múltiplas espécies reativas de oxigênio hidrofílicas, e i-STrap, que detecta radicais lipofílicos no centro do carbono. Semelhante a estudos anteriores, descobrimos que a atividade de eliminação de radicais hidroxila séricos melhorou significativamente após a hemodiálise. Ao contrário de estudos anteriores, descobrimos que a atividade de eliminação de radicais alcoxila foi significativamente reduzida apóshemodiálise. Além disso, pacientes com diabetes mellitus apresentaram uma diminuição na atividade de eliminação de soro contra radicais alquil peroxil e um aumento nos radicais lipofílicos do centro de carbono após a hemodiálise. Estes resultados sugerem que, apesar das extensas melhorias nas membranas do dialisador, as formas deespécies que reagem ao oxigênioque podem ser eliminados durante a diálise são limitados e múltiplas espécies reativas de oxigênio permanecem em níveis elevados durante a hemodiálise.

Palavras-chave:hemodiálise, biocompatibilidade, ressonância de spin eletrônico do radical alquil peroxil, MULTiS, i-STrap

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Doença renal crônica(DRC) é conhecida por estar associada aalto estresse oxidativo. (-4)Acúmulo de toxina urêmicacom propriedades pró-oxidativas levando amicroinflamaçãocausado peloelevação da citocina pró-inflamatóriasé a principal característicaFisiopatologia da DRC. (s-, a hemodiálise (HD), uma terapia de substituição renal amplamente conduzida, atua como uma faca de dois gumes para reduzir o estresse oxidativo em pacientes com DRC. Ativação de leucócitos polimorfonucleares, devido ao contato com a membrana ou outras superfícies artificiais em circuitos de HD , é a principal causa do estresse oxidativo induzido pela DH.s-) Por outro lado, a remoção de toxinas urêmicas pró-oxidativas, especialmente compostos hidrofílicos de baixo peso molecular, como trimetilamina-Nóxido ou compostos de guanidino, pode melhorar a natureza antioxidante da DH, levando a uma melhoria a longo prazo da taxa de sobrevivência e da qualidade de vida empacientes com DRC. (2,13) ​​Além disso, a correção da acidose leva à reativação de enzimas antioxidantes e à redução da sobrecarga de volume, levando à prevenção do cardio. complicações vasculares são mecanismos antioxidantes. (4 Assim, é necessário que os materiais HD minimizem a ativação de leucócitos e maximizem os efeitos antioxidantes. Para superar esse problema, foram desenvolvidos materiais HD antioxidantes e biocompatíveis exemplificados pelo dialisador revestido com vitamina E. (si7) No entanto, apesar dos numerosos avanços nos dialisadores HD, o prognóstico dos pacientes em HD permanece insatisfatório, especialmente daqueles com diabetes mellitus (DM), uma doença que promove um estado altamente oxidativo.(8)Essas preocupações se devem em parte aos detalhes de estudos in vivo amplamente variados e complexos.reações relacionadas ao estresse oxidativonão foram suficientemente analisados. Assim, este estudo teve como objetivo esclarecer o efeito da HD na dinâmica das espécies reativas de oxigênio (ROS), como os eventos a montante das reações de estresse oxidativo, com base no conceito de que cada local alvo das reações oxidativas e antioxidantes no corpo precisa ser descrito bioquimicamente em um tempo e espaço específicos. Uma explicação para isso éfalta de análise detalhadado lado a montante das reações relacionadas ao estresse oxidativo que estimulam essas reações celulares. A identificação de EROs que atuam como estimuladores de reações de estresse oxidativo ou interações entre EROs para gerar estimuladores oxidativos é difícil devido às altas taxas de reação e cadeias de reação complexas. Como as ERO não são uniformes e as ERO individuais possuem características específicas durante reações in vivo, é necessária uma análise de múltiplas ERO. (9-2n Assim, para melhorar a biocompatibilidade com base no uso de materiais antioxidantes e biocompatíveis, é necessário compreender as mudanças na dinâmica das ERO causadas pela DH.

Para investigar a dinâmica das ROS durante a HD, empregamos dois métodos baseados em ressonância de spin eletrônico (ESR) recém-desenvolvidos. o ensaio de eliminação de radicais livres hidrofílicos múltiplos (MULTIS) e o ensaio de detecção de radicais lipofílicos no sangue total (i-STrap). Embora a pesquisa sobre a atividade de eliminação de ROS por ESR não seja extensa, continua sendo o único método disponível para identificar o tipo e examinar a dinâmica de ROS. O método combina um sistema de fluxo do tipo cromatografia líquida de alto desempenho com um sistema ESR e emprega 5-(2,2-dimetil-1.3-propoxiciclofosforil)-5- metil-1-pirrolinaNóxido(CYPMPO) como armadilha de spin. O MULTIS fornece maior sensibilidade e estabilidade para a medição de eliminação de ROS do que os ensaios convencionais de VHS.22-24) Um de nossos coautores relatou anteriormente atividades de eliminação de ROS medidas pelo MULTIS em pacientes com DRC em estágio 5. No entanto, eles não avaliaram o efeito da DH.e2) Além disso, o método i-STrap é um método baseado em ESR que detecta ROS no sangue total usando 2-difenilfosfinoil-2-metil-3,{ {20}}di-hidro-2H-pirrol N-óxidoDPhPMPO)como sua armadilha de spin e mede a ESR após uma extração orgânica, refletindo assim ROS lipofílicos.2s.26 Neste estudo, descobrimos que os níveis de vários ROS foram aumentado e não eliminado pela HD, indicando que as reações radicais em cadeia ainda não são adequadamente controladas após a HD. Isto pode afetar oprognóstico de pacientes com DRC.

Materiais e métodos

Sujeitos e consentimento informado. Todos os procedimentos realizados em seres humanos foram realizados após obtenção de consentimento individual por escrito. O protocolo utilizado foi aprovado pelo Comitê de Tecnologia da Universidade de Tsukuba (Autorização nº 201809). Este é um estudo observacional; portanto, intervenções foram realizadas nos pacientes. Um total de 31 pacientes em HD estáveis ​​foram incluídos no estudo. Obtivemos e registramos informações clínicas e demográficas de cada paciente. Todos os pacientes foram tratados com dialisadores de membrana de polissulfona de alto fluxo (Toray Medical Co., Ltd., Tóquio, Japão) com diversas áreas de superfície de membrana, adaptadas à constituição corporal de cada indivíduo. Os pacientes foram divididos em dois grupos dependendo da causa da doença renal terminal: o grupo não diabético (grupo não diabético, n=17) e o grupo diabético, n=14).

Coleta de amostras. Amostras de sangue foram obtidas no início e no final do tratamento dialítico a partir da amostragem localizada no lado arterial do circuito de HD. Para medições MULTIS, os soros foram separados e armazenados em freezer a {{0}} graus (até a medição ser realizada, para medições i-STrap. amostras de sangue total foram coletadas em tubos revestidos de heparina que foram permitidos repousar por uma hora antes das medições. Medições de múltiplas atividades de eliminação de radicais livres no soro. As atividades de eliminação de ROS hidrofílicos foram medidas com o método MULTIS usando protocolos descritos anteriormente com pequenas modificações.2227) Atividades de eliminação contra cinco ROS, nomeadamente radical hidroxila(OH) , superóxido(0,"), radical alcoxil (RO"), radical alquil peroxil (ROO") e oxigênio singleto ('0,), foram medidos. Um espectrômetro ESR de banda X( RR-Xl ESR: Radical Research Inc., Tóquio, Japão) empregando modulação de campo de 100 kHz e software de operação WN-RAD (Radical Research Inc.). Os reagentes de captura de spin ESR usados ​​foram CYPMPO para " OH, O, RO' e ROO' e 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina (TEMP)para 'O. As configurações típicas do espectrômetro foram as seguintes: largura de modulação de campo 0,1 mT; potência de microondas, 10 mW; largura e taxa de varredura de campo+70,5 mT/2 min; e constante de tempo, 0,1 s. Cada ROS foi gerado por meio de iluminação in situ com luz UV/visível de um iluminadorRUVF-203Iluminador UV SR, Radical Research Inc.) equipado com uma lâmpada de arco de mercúrio/xenon de média pressão de 200W e guia de luz de quartzo, conectado à cavidade do ressonador. As fontes de luz, tempos de iluminação, precursores e fotossensibilizadores usados ​​para produzir ROS estão resumidos na Tabela 1. As atividades de eliminação de ROS foram calculadas de acordo com um método descrito anteriormente e convertidas na unidade equivalente aos sequestrantes puros conhecidos: glutationa (GSH) para OH e 'O, superóxido dismutase (SOD) para O, 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-ácido carboxílico (Trolox)para RO', e um -ácido lipóico para ROO'MULTIS As medições para cada ROS foram realizadas em triplicata.

Medição de lipofílico

Atividade de eliminação de Ros no sangue total usando i-Strap. A atividade de eliminação de ROs lipofílicos foi medida usando a medição i-STrap ESR ki (Dojin-Glocal/Dojindo, Kumamoto, Japão) com base no protocolo do fabricante e em um relatório anterior.2s Este método é baseado na reação competitiva entre antioxidantes no sangue total e DPhPMPO com o hidroperóxido de terc-butila (BuOOHradical. Amostras de sangue total foram incubadas com DPhPMPO(1{{10}} mM) e teste-BuOOH (10 mM) por 30 min em temperatura ambiente. Após a incubação, a rotação os adutos na fase orgânica foram extraídos usando soluções de clorofórmio e metanol. As medições de ESR foram realizadas usando essas amostras orgânicas. As condições de medição foram as mesmas da medição MULTIS, exceto pela largura e taxa de varredura de campo, definidas em+5 0,0 mT/2 min, não havia antioxidantes específicos para a medição do i-STrap; portanto, a atividade de eliminação foi expressa como um valor de 10/-1, onde "0" denota a intensidade do sinal sem uma amostra e "' denota o sinal intensidade com uma amostra. (28)Reagentes. O CYPMPO foi obtido da RR INC.(Japão); riboflavina, dicloridrato de 2,2'-azobis (2-amidinopropano) (AAPH), texto-BuOOH, dimetilsulfóxido (DMSO) e rosa Bengala foram adquiridos da Sigma-Aldrich Japan (Tóquio, Japão) e TEMP foi adquirido da Tokyo Chemical Industry (Tóquio, Japão). O peróxido de hidrogênio e os tampões foram obtidos da WakoChemical Co. (Osaka, Japão). Análise estatística. A análise estatística foi realizada usando o software de computador Prism 6 para Mac OS X (GraphPad SoftwareInc., La Jolla, CA). teste t pareado. Os dados foram expressos como valores médios com intervalo de confiança de 95% (IC 95%.