Inibidor de farnesiltransferase LNK-754 atenua a distrofia axonal e reduz a patologia amilóide em ratos, parte 3

Resultados

Carga reduzida de placas amilóides e hiperfosforilação de tau nos cérebros de camundongos 5XFAD tratados cronicamente com LNK-754-

LNK-754 e lonafarnib são FTIs de moléculas pequenas que foram previamente testados em humanos em ensaios clínicos de câncer e são conhecidos por cruzar a barreira hematoencefálica [8, 9, 41, 42]. As inclusões de -sinucleína [8] e tau [9] são reduzidas por LNK-754 e lonafarnibe, respectivamente, mas ainda não foram avaliadas em relação ao fenótipo amilóide da DA. Neste estudo, investigamos seus efeitos na patologia amilóide no modelo de camundongo 5XFAD. Camundongos 5XFAD desenvolvem depósitos A começando aos 2 meses de idade [36, 37], e neurites distróficas são observadas nos estágios iniciais da deposição de amiloide [39, 43].

A barreira hematoencefálica e a imunidade são duas partes muito importantes do corpo humano e estão inextricavelmente ligadas. A barreira hematoencefálica é uma barreira protetora entre o cérebro e o sangue que protege o cérebro de substâncias nocivas externas. A imunidade é um mecanismo importante para o corpo humano resistir às doenças. Então, qual é a relação específica entre a barreira hematoencefálica e a imunidade?

Primeiro, a barreira hematoencefálica pode impedir que algumas bactérias e vírus nocivos entrem no cérebro, protegendo-o assim de danos. Além disso, a barreira hematoencefálica também pode controlar a permeabilidade de certas substâncias, permitindo-lhes entrar no cérebro apenas até certo ponto. Isto é fundamental para proteger a saúde do sistema nervoso, uma vez que o excesso de certas substâncias internas que entram no cérebro pode causar danos às células nervosas.

Ao mesmo tempo, a imunidade também pode desempenhar um papel na proteção do cérebro. O sistema imunológico do corpo humano pode reconhecer patógenos e substâncias nocivas e, em seguida, produzir anticorpos correspondentes para resistir à sua invasão, protegendo assim o corpo contra doenças. No entanto, quando certos patógenos ou substâncias atravessam a barreira hematoencefálica e entram no cérebro, o sistema imunológico responde rapidamente e produz anticorpos para atacá-los e eliminá-los.

Portanto, a barreira hematoencefálica e a imunidade desempenham um papel muito importante na manutenção da saúde humana. A barreira hematoencefálica impede a entrada de substâncias nocivas no cérebro, enquanto a imunidade remove patógenos e outras substâncias nocivas que contornam a barreira hematoencefálica e entram no cérebro. Os dois trabalham juntos para garantir o funcionamento saudável do cérebro.

Em resumo, a barreira hematoencefálica e a imunidade cooperam através dos seus respectivos mecanismos para desempenhar um papel importante na saúde humana. Devemos nos concentrar em proteger sua saúde para garantir a saúde geral do corpo. Percebe-se que precisamos melhorar nossa memória. Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da carne picada vem dos muitos ingredientes ativos que ela contém, incluindo ácidos, polissacarídeos, flavonóides, etc. Esses ingredientes podem promover a saúde do cérebro de várias maneiras.

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Portanto, para coincidir com o desenvolvimento da patologia amilóide em camundongos 5XFAD, tratamos camundongos cronicamente por 3 meses com o veículo, LNK-754 e lonafarnib, começando aos 2 meses de idade. LNK -754 e lonafarnib foram dissolvidos em um veículo de 0,5% de carboximetilcelulose sódica e injetados ip diariamente com uma dose de 1mg/kg [8, 44].

Primeiro procuramos determinar os efeitos do tratamento crônico com LNK -754 e lonafarnib na carga de placa A em camundongos 5XFAD por microscopia de imunofluorescência para A 42, que detecta amiloide difusa e agregada e vermelho de tiazina (TR), que detecta apenas placa fibrilar núcleos (Fig. 1A; Fig. S1). Encontramos uma diminuição significativa na área coberta nas regiões corticais do cérebro de camundongos tratados com LNK 754- em comparação com controles tratados com veículo (Fig. 1B). No hipocampo, a área coberta diminuiu significativamente em camundongos tratados com LNK-754- em comparação com camundongos tratados com lonafarnibe, e houve uma tendência de diminuição em camundongos tratados com LNK-754 em comparação com o tratamento com veículo (Fig. .1C).

Uma área coberta de 42 em camundongos tratados com lonafarnib não foi significativamente diferente dos camundongos tratados com veículo no córtex ou no hipocampo (Fig. 1A, B). O tamanho da placa diminuiu nas regiões cerebrais corticais e hipocampais pelo tratamento com LNK-754 em comparação com o tratamento com veículo; esta diferença foi estatisticamente significativa no hipocampo (Fig. 1D, E; Fig. S2A, B). Uma diferença significativa no tamanho da placa entre o tratamento com lonafarnib e LNK -754 também foi observada no hipocampo (Fig. 1D, E; Fig. S2A, B).

O tamanho da placa permaneceu inalterado em camundongos tratados com lonafarnib em comparação com camundongos tratados com veículo em regiões cerebrais corticais ou hipocampais (Fig. 1D, E; Fig. S2A, B). A semeadura de placa foi quantificada analisando o número de placa por coloração TR. O número de placas diminuiu significativamente no córtex, mas não no hipocampo, de LNK -754 em comparação com camundongos tratados com veículo (Fig. S2C, D). A redução da carga de placa foi confirmada medindo A42 por ELISA em PBS e homogenatos de hemicérebro solúveis em guanidina (Fig. 1F, G). Semelhante aos nossos resultados de microscopia de imunofluorescência, houve uma tendência para menos A 42 nas frações de guanidina e PBS em camundongos tratados com lonafarnib, enquanto um nível significativamente mais baixo de A 42 nas frações de guanidina foi alcançado com o tratamento com LNK-754 (Fig. 1. F, G).

Como foram relatados efeitos baseados no sexo no modelo de camundongo 5XFAD para níveis de APP em estado estacionário e carga de placa (45, 46), realizamos imunotransferências de camundongos machos e fêmeas tratados com veículo, LNK-754 ou lonafarnibe separadamente para expressão de APP transgênica (Fig. S3A). Os níveis de APP transgênica foram medidos por imunotransferência com o anticorpo APP 6E10, que reconhece apenas APP humana, e permaneceram inalterados em camundongos machos ou fêmeas tratados com LNK -754, lonafarnib ou veículo (Fig. S3B-D). Uma segunda característica definidora da DA é a presença de inclusões de tau hiperfosforiladas no cérebro e, juntamente com a deposição de placas, a tau endógena de camundongo é hiperfosforilada em camundongos 5XFAD [47, 48].

Para determinar se a hiperfosforilação da tau foi afetada pelo tratamento com FTI em um modelo de camundongo amilóide, a análise de imunotransferência foi realizada para fosfo-tau na serina 404 (Fig. 1H; Fig. S3E), um epítopo conhecido por ser hiperfosforilado em cérebros com DA e camundongos 5XFAD [ 47, 49]. Aqui, encontramos níveis reduzidos de fosfo-tau ser404 nos cérebros de ratos tratados com lonafarnib e LNK -754 (Fig. 1I), enquanto o nível total de tau permaneceu inalterado (Fig. 1J; Fig. S3F). No total, nossos resultados revelam que a carga da placa amilóide e a fosforilação da tau patogênica são reduzidas no modelo de camundongo 5XFAD pelo tratamento farmacológico com FTIs, embora o tratamento com LNK -754 tenha sido consideravelmente mais potente que o lonafarnib.

O tratamento crônico com LNK-754 inibe a farnesilação de proteínas no cérebro de camundongos 5XFAD

Para confirmar que o direcionamento de FTase com LNK-754 e lonafarnib por injeção ip inibiu a farnesilação de proteínas nos cérebros de camundongos 5XFAD, avaliamos vários substratos de FTase e marcadores a jusante de inibição de FTase em homogenatos de hemicérebro de camundongos 5XFAD cronicamente tratados com veículo, LNK -754 ou lonafarnibe por análise de imunotransferência. Analisamos primeiro a pré-lamina A, que se acumula quando a FTase é inibida (50). Um aumento na pré-lamina A foi observado nos cérebros de camundongos tratados com LNK-754 em comparação com o veículo, enquanto nenhuma alteração ocorreu em camundongos tratados com lonafarnib (Fig. S4A, D). Em seguida, analisamos HDJ -2, uma proteína acompanhante que sofre uma mudança de mobilidade ascendente após o tratamento com FTI e é amplamente utilizada como um marcador de inibição de FTase (50). Consistente com a pré-lamina A, uma forma de migração mais lenta de HDJ-2 estava presente em camundongos tratados com LNK-754-, mas não em camundongos tratados com lonafarnibe (Fig. S4B, E). Um aumento significativo nas espécies de migração mais lenta de HDJ -2 foi encontrado em camundongos LNK754 em comparação com camundongos tratados com veículo ou lonafarnib (Fig. S4E).

Além disso, a farnesilação ativa Ras, então também medimos a fosforilação de sua molécula efetora a jusante ERK1 (P44/P42) (Fig. S4C). Enquanto o HDJ -2 e a prelamina A permaneceram inalterados pelo tratamento com lonafarnib, foi observada uma tendência à redução do pERK1 (Fig. S4F). O pERK1 também diminuiu em camundongos tratados com LNK -754 (Fig. S4F). Nossos resultados sugerem que 1mg/kg de LNK-754 inibiu a FTase no cérebro, entretanto, o lonafarnib foi menos eficaz. Isso pode ser devido à menor potência e IC50 do lonafarnibe, conforme mostrado anteriormente [41, 51], ou possivelmente à redução da exposição cerebral.

Diminuição do acúmulo de LAMP1 em neurites distróficas em camundongos 5XFAD tratados cronicamente com LNK-754

Em neurônios saudáveis, os componentes lisossômicos são entregues aos endossomos e organelas autofágicas nas neurites distais, que se tornam acidificadas e maduras durante o tráfego retrógrado em direção ao soma neuronal (52, 53). As placas amilóides interrompem esse processo, resultando em neurites distróficas que aprisionam organelas autofágicas e endolisossomais disfuncionais.

Neurites distróficas bloqueiam o transporte axonal de BACE1, levando à geração A dentro de neurites distróficas e à deposição de placa extracelular [16–18]. Sabe-se que os FTIs melhoram a função lisossômica e a estabilidade dos microtúbulos, portanto, para investigar melhor como os FTIs reduzem a carga de placa, nos concentramos especificamente em neurites distróficas em camundongos 5XFAD.

Para quantificar o acúmulo de neurites distróficas ao redor das placas, avaliamos a proteína 1 da membrana associada ao lisossômico (LAMP1), um marcador de organelas endolisossomais e autofágicas heterogêneas. Tecidos cerebrais hipocampais e corticais de camundongos 5XFAD tratados com veículo, LNK -754 e lonafarnib foram co-corados para LAMP1 e A 42, e microscopia de imunofluorescência confocal foi realizada (Fig. 2A, B).
Foi estabelecido um limite para eliminar sinais de fluorescência LAMP1 de vesículas em neurites e somas saudáveis ​​para analisar especificamente neurites distróficas. A área coberta por LAMP1 foi significativamente diminuída nas regiões cerebrais corticais e hipocampais de camundongos tratados com LNK -754 (Fig. 2C, D), enquanto nenhuma diferença foi observada em camundongos tratados com lonafarnibe em comparação ao tratamento com veículo (Fig. 2C, D) . A deposição de placas amilóides inicia o desenvolvimento de distrofias em neurites próximas, principalmente axônios e terminais pré-sinápticos.

Correspondentemente, os efeitos do LNK-754 e do lonafarnib nas neurites distróficas são consistentes com os seus efeitos na carga de placa (Fig. 1). A análise adicional do efeito do tratamento com FTI nas neurites distróficas foi realizada quantificando a proporção entre a área coberta por LAMP1 e a área A42 para determinar se os FTI restringem o tamanho da distrofia em torno das placas. Uma diminuição na proporção de LAMP1: A 42 foi observada para camundongos tratados com LNK-754 em comparação com camundongos com veículo, e os tratamentos com LNK-754 e lonafarnibe foram significativamente diferentes (Fig. 2E, F), indicando que LNK -754 camundongos associados a menos neurites distróficas.
Níveis elevados de LAMP1 foram encontrados em homogeneizados de hemicérebro de camundongos tratados com LNK-754 ou lonafarnib (Fig. S5A, B), consistente com estudos anteriores mostrando que lonafarnib e LNK-754 aumentam o número de autolisossomos e níveis de proteínas da membrana lisossomal e hidrolases [8, 9]. De acordo com os resultados da análise de imunotransferência para LAMP1 (Fig. S5A, B), a intensidade média de fluorescência da imunocoloração total de LAMP1 foi significativamente aumentada nos cérebros de camundongos tratados com LNK-754 e lonafarnib em comparação com camundongos tratados com veículo (Fig. .S5C, D).

Em contraste com o nível total de fluorescência de LAMP1, a intensidade média de fluorescência de LAMP1 em neurites distróficas permaneceu inalterada entre camundongos tratados com veículo, LNK -754 e lonafarnib (Fig. S5E, F). No córtex de camundongos tratados com LNK -754, a intensidade de fluorescência de LAMP1 em distrofias e a carga de placas foram altamente correlacionadas, enquanto nenhuma correlação entre a intensidade de LAMP1 em distrofias e a carga de placas foi encontrada em lonafarnibe ou camundongos tratados com veículo (Fig. 2G, H), revelando uma conexão entre o acúmulo de neurites distróficas LAMP1 e a carga de placas em camundongos LNK-754. Uma tendência de correlação entre a intensidade da LAMP1 nas distrofias e a carga de placas foi observada no hipocampo. Juntos, nossos resultados demonstram que o tratamento com LNK-754 aumenta o nível total de LAMP1, mas atenua o acúmulo patológico de LAMP1 em neurites distróficas que geralmente estão presentes em camundongos 5XFAD.

Diminuição do acúmulo de BACE1 em neurites distróficas em camundongos 5XFAD tratados cronicamente com LNK-754

LAMP1 é encontrada nas membranas de organelas endolisossomais que direcionam o BACE1 axonal para os lisossomos maduros para degradação. Portanto, os FTIs poderiam inibir a geração A e a deposição de placas extracelulares, reduzindo a formação de distrofia axonal e o acúmulo de BACE1 ao redor das placas. Em apoio a esta hipótese, o nível de neurite distrófica LAMP1 e a carga de placas foram altamente correlacionados nas regiões corticais do cérebro em camundongos LNK -754.

Nossa análise da imunocoloração LAMP1 revelou que, em comparação com o tratamento com veículo ou lonafarnib, as placas em camundongos 5XFAD tratados com LNK -754 foram associadas a menos neurites distróficas (Fig. 2). Para determinar se o nível de BACE1 em neurites distróficas foi diminuído de forma semelhante por placa, realizamos microscopia de imunofluorescência confocal de tecidos cerebrais corticais e hipocampais de camundongos tratados com veículo, LNK -754 e lonafarnib para BACE1, além de LAMP1 e A 42 (Fig. 3A, B).

Aqui, a área coberta por BACE1 foi significativamente diminuída nas regiões corticais do cérebro de camundongos tratados com LNK -754, e uma tendência foi observada em camundongos tratados com lonafarnibe (Fig. 3C). A análise da área coberta por BACE1 em neurites distróficas no hipocampo foi impedida pelo alto nível de expressão de BACE1 em terminais pré-sinápticos da via da fibra musgosa do hipocampo CA3 [17]. Além disso, analisamos se menos BACE1 estava localizado nos endolisossomos em neurites distróficas, medindo o coeficiente de correlação de Pearson para BACE1 e LAMP1 em distrofias. Uma diminuição significativa na co-localização de BACE1 e LAMP1 por placa foi encontrada em regiões corticais do cérebro em camundongos tratados com LNK-754-em comparação ao tratamento com veículo (Fig. 3D).

No hipocampo, foi encontrada uma diminuição significativa na co-localização de BACE1 e LAMP1 por placa para LNK-754 em comparação com lonafarnib, e uma tendência para uma diminuição foi observada para o tratamento com LNK-754 em comparação com o veículo (Fig. .3E). Esses resultados são consistentes com nossas descobertas para carga de placa e área coberta por LAMP1, e apoiam ainda mais a ideia de que o tratamento com LNK-754 atenuou a formação de neurites distróficas, reduzindo o acúmulo de organelas endolisossomais prejudicadas que têm como alvo a degradação do BACE1.

O tratamento agudo com LNK-754 reduz o acúmulo tardio de endossomo e lisossoma em neurites distróficas em fatias cerebrais vivas de camundongos 5XFAD

Em seguida, testamos os efeitos agudos do LNK-754 e do lonafarnibe em neurites distróficas, realizando imagens confocal de tecidos cerebrais vivos. Neste experimento, camundongos 5XFAD com 5-meses de idade foram injetados diariamente com veículo, LNK-754 ou lonafarnibe durante 3 semanas. Coramos tecidos com LysoTracker-Green (LT), uma sonda comumente usada para rastrear e identificar seletivamente endossomos e lisossomos tardios acidificados em células vivas (53). O padrão de coloração com LT e vermelho tiazínico foi consistente com nossos resultados de imunocoloração para marcadores de neurites distróficas em camundongos 5XFAD (Fig. 2A, B; Fig. 3A, B); Os endossomas e lisossomos tardios positivos para LT estavam altamente concentrados em neurites distróficas intimamente associadas a placas amilóides em tecidos cerebrais vivos (Fig. 4A).

Um tratamento agudo de 3-semana de camundongos 5XFAD de 5-meses de idade com LNK-754 ou lonafarnibe foi insuficiente para reduzir o tamanho da placa (Fig. 4B), embora o tratamento com LNK-754 tenha causado uma diminuição significativa na proporção de LT: TR por placa e tamanho de neurite distrófica (Fig. 4C, D). Curiosamente, em contraste com os nossos resultados para LAMP1 ou BACE1, o tratamento agudo com lonafarnib também diminuiu o tamanho da distrofia e a proporção de LT: TR por placa (Fig. 4C, D). O tamanho da neurite distrófica e o tamanho da placa altamente correlacionados em camundongos 5XFAD tratados com LNK -754 (Fig. 4F), e uma correlação significativa também foi observada em camundongos tratados com lonafarnib (Fig. 4G). Não existiu correlação em ratinhos tratados com veículo (Fig. 4E). Nossos resultados confirmam que o LNK-754 diminuiu a distrofia axonal e sugere que os FTIs podem atenuar o acúmulo tardio de endossomos e lisossomos ao redor das placas, mesmo após extensa deposição de placas e degeneração de axônios.

Melhoria dos déficits de aprendizagem e memória em camundongos hAPP/PS1 após tratamento de curto prazo com LNK‑754

LNK-754 preveniu o acúmulo de LAMP1, BACE1 e LT em neurites distróficas em camundongos 5XFAD, sugerindo que o tratamento com LNK-754 protege contra disfunção sináptica associada a A. Para avaliar se o tratamento com LNK-754 teve um efeito benéfico na função cognitiva, avaliamos a eficácia a curto prazo do tratamento oral com LNK-754 na aprendizagem espacial e na memória no modelo de camundongo hAPP/PS1 AD [40] . A memória espacial de camundongos hAPP/PS1 foi melhorada após 12 dias de tratamento oral com LNK-754, conforme avaliado pelo Morris Water Maze (MWM).

Durante as sessões de treinamento de plataforma oculta, camundongos hAPP/PS1 tratados com LNK-754 aprenderam a localizar a plataforma mais rapidamente do que camundongos hAPP/PS1 tratados com veículo, o que resultou em uma curva de aprendizado que é significativamente diferente daquela do hAPP tratado com veículo Camundongos de controle /PS1 (Fig. 5A). Camundongos hAPP/PS1 tratados com veículo levaram significativamente mais tempo para localizar a plataforma em comparação com controles de tipo selvagem tratados com veículo nos dias 4 e 7 dos ensaios de treinamento, enquanto nenhuma diferença significativa foi encontrada entre hAPP/PS1 tratado com LNK-754 Camundongos PS1 e camundongos do tipo selvagem tratados com veículo (Fig. 5A-C).

Durante o teste de sonda, os animais hAPP/PS1 tratados com LNK-754- mostraram aumento do tempo gasto no quadrante alvo (Fig. 5D) e aumento da frequência de cruzamentos de plataforma (Fig. 5E), comparável aos animais do tipo selvagem tratados com veículo . 42 níveis foram medidos por ELISA e permaneceram inalterados em homogenatos cerebrais solúveis e insolúveis de camundongos hAPP/PS1 tratados com veículo ou tratados com LNK-754- (Fig. 5F, G), sugerindo que a melhora da memória e do aprendizado espacial não foram um resultado da redução da carga amilóide em camundongos hAPP/PS1 tratados com LNK-754.

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