Avaliação do transporte intestinal de um extrato rico em glicosídeo feniletanóide de Cistanche Deserticola através do modelo de monocamada celular Caco-2

Introdução

A linhagem celular Caco{0}}, derivada de adenocarcinomas de cólon humano, exibe características semelhantes às dos enterócitos. Em condições normais, as células Caco-2 diferenciam-se espontaneamente das células maduras e formam monocamadas intactas. As células adjacentes aderem através de junções estreitas formadas no lado apical da monocamada, que podem discriminar passivamentee transportou ativamente drogas através da camada epitelial. Devido à semelhança morfológica e bioquímica com os enterócitos normais, as monocamadas de células Caco-2 servem como um modelo in vitro bem aceito para o estudo do potencial de absorção intestinal e das características de transporte de medicamentos.

Ao contrário dos produtos químicos, os extratos vegetais (PE) são misturas cuja atividade biológica e constituintes ativos muitas vezes não são bem identificados. Além disso, as propriedades de transporte intestinal do PE, em oposição às propriedades dos seus constituintes, estão intimamente relacionadas com o uso clínico. Medições de fluxo para uma amostra de teste através de uma monocamada de células Caco-2 geralmente envolvem métodos químicos, como HPLC, LC/MS, etc. Embora esses métodos sejam ferramentas poderosas, eles são complexos, demorados, caros e, ocasionalmente, exigem equipamentos sofisticados. Mais importante ainda, nem uma única componente nem uma componente minoritária podem reflectir a PE como um todo. Assim, é necessário estabelecer uma nova abordagem independente da determinação dos constituintes para identificar e avaliar as características de transporte do PE.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), uma planta holoparasita, é uma medicina tradicional chinesa comum usada principalmente para tratar deficiência renal, fraqueza corporal e prisão de ventre, e esses usos foram oficialmente registrados na Farmacopeia Chinesa.Glicosídeos feniletanóides (PhGs), incluindo equinacosídeo (EC), acteosídeo (AC) e isoacteosídeo (IS), etc., são uma classe de compostos polifenólicos. São considerados um dos principais constituintes bioativos das espécies Cistanche. Estudos farmacológicos demonstraram que a bioatividade dos PhGs é diversa e inclui efeitos antioxidantes, antifadiga, hepatoprotetores, imunomoduladores, antiinflamatórios e neuroprotetores. No entanto, as características de transporte intestinal dos PhGs não foram investigadas. Neste estudo, exploramos a permeabilidade intestinal de um extrato rico em PhG (PRE) de CD como um sistema integrado e a permeabilidade de três principais PhGs (AC, IS e EC) em células Caco-2 diferenciadas. Nossos resultados indicaram que o PRE é transportado principalmente por difusão passiva pouco absorvida por um gradiente de concentração sem efluxo, o que fornece a base farmacocinética para a aplicação clínica de PhGs na DC.

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Materiais e métodos

Materiais

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%) foram adquiridos da Must Biotechnology Co. (Chengdu, China). O meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino (FBS) e aminoácidos não essenciais (NEAA) foram produzidos pela Gibco BRL (Grand Island, NY, EUA). Placas TranswellTM de 6-poços (inserir área de crescimento da membrana 4,67 cm2) foram obtidas da Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, EUA). O colágeno de cauda de rato foi obtido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Todos os reagentes e produtos químicos para a análise por HPLC eram de grau analítico.

Preparação de PRE a partir de CD

O material de CD seco ao ar foi pulverizado e extraído por percolação com etanol a 70%. A fração rica em PhG foi preparada como descrito anteriormente e extraída com álcool n-butílico saturado com água. O licor de extrato foi concentrado e seco sob pressão reduzida. A espectrofotometria de resina macroporosa-UV mediu um teor de PhG de 78,4%. A amostra final representou um rendimento de matéria-prima de 1,75% em peso seco. A amostra obtida foi armazenada a -20 graus até uso posterior.

Determinação de AC, IS e EC por HPLC

Um sistema Shimadzu HPLC equipado com software de solução LC foi utilizado para testar o conteúdo de AC, IS e EC em PRE. Uma coluna Intersil C18 de fase reversa (4,6 mm × 25 0 mm, 5 μm) foi utilizada e mantida em temperatura ambiente. As fases móveis foram acetonitrila e água contendo 0,1% de ácido fosfórico (v/v) com eluição gradiente (Tabela 1) a uma vazão de 1,0 ml/min. O detector do espectrofotômetro UV foi ajustado para 334 nm. Para determinar com precisão o fluxo de AC e IS, desenvolvemos um novo método de detecção de fluorescência por HPLC (HPLC-FLD). Após uma análise estrutural e varredura do comprimento de onda de fluorescência (dados não mostrados), obtivemos as condições ideais de detecção de fluorescência para AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) e IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm).

O método analítico de HPLC foi validado utilizando as seguintes características de desempenho: estabilidade, linearidade, sensibilidade, precisão (variabilidade intra e interdia) e exatidão. Os analitos no tampão de transporte foram armazenados a 25 graus no escuro por 24 horas e sua estabilidade foi medida. Os analitos foram altamente estáveis ​​na presença de vitamina C (0,4%) porque os valores do desvio padrão relativo (RSD) nas áreas dos picos foram <3,5%. A equação de regressão linear, coeficiente de correlação, faixa de linearidade, LOD e LOQ para AC, IS e EC são mostrados na Tabela 2. Os LODs (18–30 nM) e LOQs (60–100 nM) os valores ilustram que os métodos HPLC-FLD e HPLC-UV são altamente sensíveis. Os valores de RSD que expressam a precisão do método foram todos < 2% para variabilidade intra e interdia, indicando boa precisão. Para avaliação da recuperação, AC, IS e EC foram adicionados ao tampão de transporte para produzir três níveis de concentração (alto, médio e baixo). Os valores de recuperação do método para os analitos estão resumidos na Tabela 3. As recuperações médias variaram de 90,0% a 96,4%, indicando boa precisão. Concluindo, os métodos de HPLC estabelecidos são satisfatórios quanto à linearidade, sensibilidade, precisão e exatidão para a quantificação de AC, IS e EC no buffer de transporte.

Determinação de PRE por sistema de bioensaio

O bioensaio (capacidade antioxidante total) foi baseado no ensaio FRAP (redução férrica / poder antioxidante) que descrevemos anteriormente [16] e validado em termos de linearidade e precisão (variabilidade intra e interdia). A linearidade do método de bioensaio foi determinada com base nas curvas de calibração. A faixa de concentração de linearidade foi 0,0625 - 40 ug/ml (y=0,0258x+0,0968, R2=0,996). A precisão do método de bioensaio estabelecido foi determinada em termos da variabilidade intra e interdia para uma análise de PRE (10,0 ug/ml). A repetibilidade intradiária do método foi determinada com base em cinco determinações consecutivas no mesmo dia. A repetibilidade entre dias foi medida com base em cinco determinações consecutivas em três dias diferentes. Os valores de RSD para a precisão do método foram de 1,014% e 4,72% para variabilidade intra e interdia, respectivamente, indicando boa precisão. Assim, o método de bioensaio estabelecido é satisfatório quanto à linearidade, precisão e exatidão para a quantificação de PRE em tampão de transporte.

Cultura de células

Células Caco{{0}} foram cultivadas a 37 graus e 95% de umidade relativa em uma atmosfera contendo 5% de CO2 e um meio consistindo de DMEM, 10% de FBS, 1% de NEAA, 1% de L-glutamina, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 ug/ml). O meio foi trocado a cada dois dias durante o crescimento e diferenciação celular. As células foram cultivadas em frascos plásticos de 75-cm2 e colhidas a cada 3-5 dias com 0,05% de EDTA-tripsina. Para as experiências de transporte, as células foram semeadas a uma densidade de 1x105 células/cm2 em inserções Transwell revestidas com colagénio. Aproximadamente 21 dias após a semeadura, as monocamadas foram utilizadas para os experimentos de transporte. A sua integridade foi determinada medindo a resistência elétrica transepitelial (TEER) através das monocamadas com um EVOM equipado com ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., EUA). Os valores TEER da monocamada de células Caco-2 precisavam exceder 500 O∙cm2.

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Experimentos de transporte

A monocamada foi lavada com tampão de transporte (tampão P contendo HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM, glicose 10 mM, CaCl2 3 mM e NaCl 145 mM, pH 7,4) e depois pré-incubada por 20 min a 37 graus. Após a remoção do tampão de transporte, tampão de transporte fresco contendo amostras de teste foi adicionado à câmara apical (AP) (1,5 ml) em estudos direcionais AP para basolateral (BL) ou à câmara BL (2,5 ml) em estudos direcionais BL para AP. Para ensaios de AC, IS e EC utilizando HPLC, uma alíquota (300 ul) foi removida de cada câmara receptora em diferentes intervalos de tempo (30, 60, 90 e 120 min). A câmara receptora foi reabastecida com o mesmo volume de tampão de transporte fresco pré-aquecido (37 graus) após cada amostragem. As amostras coletadas foram armazenadas a -20 graus para uso posterior. Para determinação de PRE utilizando bioensaio, apenas as amostras aos 120 min foram retiradas. Devido à instabilidade de PRE, AC, IS e EC, 0,4% (p/v) de vitamina C foi adicionado para estabilizar as amostras para determinar os conteúdos de AC, IS e EC por HPLC, e as amostras para o bioensaio PRE foram testado imediatamente após ser amostrado. O valor do coeficiente de permeabilidade aparente (Papp ou 'Papp) de cada amostra foi calculado.

Análise de dados

Os valores de Papp nas direções AP BL ou BLAP de AC, IS e EC foram calculados com base na seguinte equação: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), onde Papp é o coeficiente de permeabilidade aparente (cm/s) determinado por HPLC. (4Q/4t) é a taxa de aparecimento do composto de teste (AC, IS ou EC) no lado do receptor (μmol/s); A é a área superficial da pastilha (cm2); C0 é a concentração inicial do composto de teste no lado do doador (μmol/ml). Especificamente, a unidade de massa "ug" foi usada em vez de "μmol" quando os valores de 'Papp foram calculados. Os dados são expressos como médias ± DP.

Resultados

Composição de AC, IS e EC no PRE do CD

Como AC, IS e EC são considerados os principais bioativosPhGs de espécies Cistanche, analisamos seu conteúdo em PRE via HPLC-UV. O cromatograma representativo é mostrado na Fig. 1. A identificação destes constituintes baseou-se na comparação dos tempos de retenção e do espectro UV com os dos padrões autênticos no comprimento de onda de 334 nm. Os conteúdos de AC, IS e EC no PRE foram 26,60%, 1,84% e 32,83%, respectivamente. Assim, estes três compostos respondem por 61,27% do PRE; além disso, os resultados acima indicam que o teor de PhG no PRE é de 78,4%. Portanto, AC, IS e EC representam aproximadamente 80% dos PhGs no PRE.

Capacidades antioxidantes totais de PRE, AC, IS e EC

Estudos doatividade antioxidante de PhGsde CD foram relatados, e AC, IS e EC representam aproximadamente 80% dos PhGs em PRE. Assim, as capacidades antioxidantes totais de PRE, AC, IS e EC foram avaliadas e expressas usando os valores de FRAP (× 10–6 mmol). Como mostrado na Figura 2, quando o valor de FRAP foi 8 × 10–6 mmol, as concentrações finais de PRE, AC, IS e EC foram 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml e 4,89 ug /ml, respectivamente, indicando que a capacidade antioxidante total destas quatro amostras foi classificada da seguinte forma: AC > EC > PRE > IS. A bioatividade do PRE é atribuída aos seus grupos de princípios ativos (AIG). Para aproximadamente 60% do PRE, AC e EC apresentaram atividade antioxidante total mais forte que PRE e IS. Como o IS (1,84%) constitui uma fração muito pequena do PRE, outros componentes, como o IS fracamente antioxidante, também são claramente ativos no PRE. Surpreendentemente, a atividade antioxidante total diferiu quase 7- vezes entre AC e seu isômero IS, indicando que não apenas o número de grupos hidroxila fenólicos, mas também a posição dos grupos hidroxila fenólicos na molécula afetou o efeito antioxidante. .

Validação das monocamadas Caco-2

Para validar o sistema de monocamada de células Caco-2, os valores de Papp de propranolol (um marcador bem transportado) e Lúcifer amarelo (um marcador mal transportado) do AP para o BL através das monocamadas Caco-2 foram determinado como 1,51 × 10–5 cm/s e 2,8 × 10–7 cm/s, respectivamente, e esses valores concordaram com aqueles publicados em relatórios anteriores. O ensaio de atividade da fosfatase alcalina também confirmou que as monocamadas de células Caco-2 eram qualitativamente comparáveis ​​ao epitélio do intestino delgado.

A permeabilidade de AC, IS e EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), enquanto os de medicamentos mal absorvidos foram baixos (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

A permeabilidade do PRE

Os resultados acima indicam que a capacidade antioxidante total do PRE é devida pelo menos a 61,27% do AIG do PRE. Assim, avaliamos o TR do PRE com base em sua curva concentração-efeito da capacidade antioxidante total e calculamos os valores de 'Papp para refletir as características de transporte do PRE. Os valores de 'Papp de PRE para AP!BL e BL!AP foram (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s e (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, respectivamente, indicando que este composto era pouco permeável. Além disso, o efluxo ou transporte ativo não foi evidente porque a proporção de 'Papp BL para AP / 'Papp AP para BL para PRE foi de 1,45. Além disso, o TR bidirecional do PRE aumentou linearmente entre aproximadamente 300 e 900 ug/ml (Fig. 5). A falta de preferência direcional dos resultados sugere que a difusão passiva é o principal mecanismo de transporte do PRE.

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Discussão

Comparado com medicamentos altamente purificados, o PE é geralmente uma mistura que consiste em centenas de constituintes com propriedades físico-químicas amplamente diferentes. Portanto, o PE exerce ação sinérgica sistemática, multialvo e multicanal devido ao seu complexo AIG [21], o que dificulta a análise das características de transporte do PE. Para avaliar as propriedades de transporte do PE de forma mais científica, alguns pesquisadores identificaram múltiplos componentes, em vez de um único componente, no PE [22–24]. No entanto, um número limitado de constituintes não consegue reflectir o PE como um todo. No entanto, é impossível determinar todos os componentes do PE. Além disso, se diversos componentes do PE apresentarem características de transporte completamente diferentes, as características holísticas de transporte do PE serão difíceis de identificar.

Na década de 1990, sistemas de bioensaio foram utilizados para avaliar o TR de agentes antimicrobianos [25]. Em 2005, Eguchi e seus colegas [26] avaliaram a atividade antioxidante do extrato de cenoura usando meio BL de células Caco-2 diferenciadas; esta abordagem é mais apropriada para refletir situações in vivo.

Com base em um relatório anterior sobre a atividade dos PhGs e em nossos resultados (Fig. 2), o TR do AIG no PRE pode ser avaliado determinando a capacidade antioxidante total do meio na câmara receptora. Após os experimentos de transporte, descobrimos que o TR do PRE era semelhante em ambas as direções, e esse transporte era insaturado e pouco absorvido ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s), e não indicam efluxo, sugerindo que a difusão passiva ao longo de um gradiente de concentração é o principal mecanismo de transporte do PRE (Fig. 5). Além disso, as características de transporte do PRE são consistentes com as do AC, IS e EC, os componentes eficazes que apresentam atividade antioxidante no PRE (Fig. 4 e Tabela 4). Este resultado era esperado e indicou que o presente sistema de bioensaio é apropriado e confiável para a avaliação das características de transporte de AIG em PRE em células Caco-2 diferenciadas.

Em contraste com o valor canônico de Papp, que é comumente usado para refletir o transporte de um único composto, o valor de 'Papp obtido do TR baseado na curva concentração-efeito pode não apenas refletir os componentes que penetram nas monocamadas com uma estrutura intacta, mas também também envolvem outros fatores relacionados à atividade alvo, como os metabólitos dos componentes, produtos quimicamente degradados e até mesmo algumas citocinas secretadas pelas células Caco-2 em resposta à estimulação que pode afetar a bioatividade alvo. Assim, o multifator mencionado acima, e não apenas os componentes intactos transportados, determina o 'valor Papp. Portanto, 'Papp pode se correlacionar mais fortemente com situações in vivo do que o valor canônico de Papp. Neste estudo, esclarecemos a natureza passivamente difundida e pouco absorvida do PRE com base no seu valor de 'Papp, e essa natureza pode estar relacionada à alta dosagem e ao longo período de tratamento clínico da DC. No entanto, estes resultados fornecerão uma orientação mais sistemática para os médicos na aplicação da DC quando apenas as características de transporte da maioria dos AIG na DC, e não apenas dos PhGs, tiverem sido identificadas.

No entanto, o item de bioatividade selecionado deve ser suficientemente sensível para ser detectado no meio da câmara receptora, o que representa um desafio para o estabelecimento de um sistema de bioensaio para avaliar as características de transporte do PE. Além disso, a bioatividade também deve depender do maior número possível de componentes. Em nosso estudo, o ensaio de capacidade antioxidante total foi mais apropriado do que vários outros métodos (Fig. S1). Mas mesmo assim, nosso ensaio só consegue detectar o TR do PRE aos 120 min.

Coletivamente, o presente estudo estabeleceu um novo sistema de bioensaio para avaliar a permeabilidade intestinal do PRE em células Caco-2 diferenciadas. Os resultados obtidos mostraram que uma difusão passiva pouco absorvida ao longo de um gradiente de concentração sem efluxo é o principal mecanismo de transporte do PRE (Fig. 5), que fornece a base farmacocinética para a aplicação clínica de PhGs na DC. O uso de um novo sistema de bioensaio para avaliar o TR e, assim, calcular os valores de 'Papp para avaliar a propriedade de transporte intestinal de AIG em PEs é viável. Esta abordagem também pode ser adequada para outros PE, dada a bioatividade apropriada.

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