Efeitos de diferentes partes extraídas de Cistanche Deserticola nos efeitos hipoglicêmicos de ratos pretos Db / Db Ⅱ

2 métodos experimentais

2.1 Preparação de produtos processados ​​Cistanche deserticola Cistanche deserticola:

Pegue os materiais medicinais Cistanche deserticola, lave as impurezas, cozinhe no vapor em uma panela à pressão normal por 2 horas, corte em 6 mm e seque a 70 graus. Cistanche deserticola: Pegue pedaços de decocção de Cistanche deserticola, adicione a quantidade adequada de vinho de arroz, misture bem, umedeça por 8 horas (vinho de arroz amarelo: água=1:1), vaporize sob alta pressão por 4 horas e seque em 70 graus. (Use 30 mL de vinho de arroz para cada 100 g de Cistanche deserticola).

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2.2 Enriquecimento de diferentes partes extraídas de Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

Tomar 30 g de pó de Cistanche deserticola/Tamarococcus deserticola, adicionar 10 vezes a quantidade de água, aquecer e refluxar para extração duas vezes, 2 horas de cada vez, combinar os extratos, concentrar, adicionar etanol até o teor alcoólico atingir 60%, precipitar em baixa temperatura por 12 horas e filtrar com sucção. , o precipitado é a parte polissacarídica bruta. Concentre o sobrenadante a uma concentração apropriada, aplique-o à resina de adsorção macroporosa D101 e elua-o com água e etanol de diferentes concentrações em sequência. Recolher o eluato de água e concentrar sob pressão reduzida até formar uma pasta espessa, que é a fração total de oligossacarídeos; lavar com etanol 40%. Deliquidar, concentrar e secar sob pressão reduzida, que é a fração glicosídica total da Cistanche deserticola.

2.3 Determinação do conteúdo de diferentes partes extraídas de Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.1 Determinação do conteúdo total de polissacarídeos de Cistanche deserticola/Cistanche deserticola.

Pese a amostra de glicose 20. 00 mg em um balão volumétrico de 50 mL para fazer 0. Para uma solução padrão de glicose de 4 mg·mL-1, pipete 3, 4, 5, 6 e 7mL respectivamente em um balão volumétrico de 50 mL, dilua até o volume com água e pipete 2,0 mL de cada solução de glicose com gradiente de concentração em um tubo de ensaio. Pegue outra quantidade igual de água destilada como controle branco, adicione 1 mL de fenol 5% em cada tubo, agite bem, adicione rapidamente 5 mL de ácido sulfúrico concentrado, deixe agir por 10 minutos, coloque em banho-maria a 40 graus por 15 minutos, retire-o, resfrie rapidamente até a temperatura ambiente e meça o valor de absorbância em 490 nm, tome a absorbância (A) como ordenada e a concentração de glicose (C) como abcissa, desenhe uma curva padrão e obtenha o equação de regressão Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Pesar com precisão 1,0 g do pó de polissacarídeo total de matérias-primas e produtos, colocá-los em balões volumétricos de 50 mL respectivamente, adicionar água para dissolver e ajustar o volume até a marca, colocar com precisão 2,0 mL em um tubo de ensaio e medir no mesmo maneira como o método de preparação de curva padrão. , é isso.

2.3.2 Determinação do teor de betaína em Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.2.1 Preparação da solução de referência:

Pesar com precisão 1,17 mg da solução de referência de betaína, colocar em um balão volumétrico de 5 mL, adicionar metanol 50% para dissolver e diluir até o volume, e está pronto.

2.3. 2． 2 Condições cromatográficas

A coluna cromatográfica é Ecosil {{0}} coluna cromatográfica AMINO (4,6 mm×250 mm, 5 μm), fase móvel: acetonitrila-água (99,5 ∶ 0,5) , temperatura da coluna: 30 graus, comprimento de onda de detecção: 194 nm, vazão: 0,6 mL·min-1, volume de injeção 10 μL, cromatograma mostrado na Figura 1. 2.3.2.3 Preparação da solução de teste com precisão pesar o pó da fração total de oligossacarídeos de produtos crus e acabados 1,0 g, respectivamente colocados em balão volumétrico de 5 mL, adicionar água destilada para dissolver e diluir até o volume, agitar bem, passar por 0,45 μL de membrana filtrante microporosa e está pronto.

2.3.2.4 Determinação do Conteúdo da Amostra

Absorver com precisão a solução de teste de oligossacarídeo total em Cistanche deserticola crua e preparada, medir de acordo com as condições em "2.3.2.2" e calcular o teor de betaína na amostra.

2.3.3 Determinação do conteúdo de equinacosídeo, verbascosídeo e heterocimicifugarina em Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.3.1 Preparação da solução de referência

Pesar precisamente 4,50 mg de equinacósido, 4,80 mg de verbascósido e 5,05 mg de comimicina heteróloga em frascos volumétricos de 5 mL, adicionar metanol a 50% para dissolver e diluir até à marca, e tomar cada controlo Colocar 200 μL da solução de amostra na injeção frasco, adicione 400 μL de metanol a 50% e misture bem para fazer uma solução de referência mista, agite bem e está pronto.

2.3.3.2 Condições cromatográficas

A coluna cromatográfica é Ecosil C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm), metanol é a fase móvel A, 0,1% de ácido fórmico é a fase móvel B, eluição gradiente, {{ 12}}~45 min, 30% A→ 70% A, a taxa de fluxo é 1,0mL·min-1, a temperatura da coluna é 30 graus, o comprimento de onda de detecção é 330 nm, o volume de injeção é 10μL e o cromatograma é mostrado na Figura 2.

2.3.3.3 Preparação da solução teste

Pesar precisamente 1,0 g do pó glicosídico total de matérias-primas e produtos, colocá-los em balões volumétricos de 100 mL, adicionar 50% de metanol para dissolver, ajustar o volume até a marca e agitar bem. Desenhe com precisão 5 mL de cada amostra em um balão volumétrico de 10 mL, adicione 50% de metanol para completar o volume, agite bem e passe por uma membrana de filtro microporosa de 0,45 μm para obter.

2.3.3.4 Determinação do Conteúdo da Amostra

Desenhe com precisão a amostra de glicosídeos totais de Cistanche deserticola e meça-a de acordo com as condições em "2.3.3.2". Calcule o conteúdo de equinacosídeo, verbascosídeo e cúmplice heterólogo na amostra.

2.4 Agrupamento de animais, modelagem e administração de medicamentos

A sala dos animais tem 12 horas de luz e 12 horas de escuridão, umidade relativa de 50% a 70% e temperatura ambiente de 18 a 22 graus. Camundongos pretos db/db e camundongos pretos db/m (grupo controle normal) foram alimentados normalmente com ração comum, e o experimento começou às 9 semanas de idade. Exceto para o grupo controle normal, os camundongos pretos db/db restantes foram selecionados aleatoriamente de acordo com os níveis de açúcar no sangue e peso corporal. Dividido em 8 grupos, nomeadamente grupo modelo, grupo de controle positivo, grupo de polissacarídeos totais Cistanche deserticola, grupo de oligossacarídeos totais Cistanche deserticola, grupo de glicosídeos totais Cistanche deserticola, grupo de polissacarídeos totais Tartschistanche deserticola, grupo de oligossacarídeos totais Tarthouse deserticola, grupo de glicosídeos totais Tartschistanche deserticola. Exceto para controle normal

Com exceção do grupo modelo e do grupo modelo, os ratos dos demais grupos receberam administração intragástrica na dose de 2 mL/100 g por 4 semanas consecutivas. A concentração do líquido era de 4,1 g·kg-1. O grupo controle normal e o grupo modelo foram tratados da mesma maneira. Dê uma certa quantidade de solução salina normal ao estômago.

2.5 Efeitos de diferentes partes extraídas de Cistanche deserticola nos níveis de glicose no sangue de camundongos pretos db/db

2.5.1 Teste oral de tolerância à glicose (TOTG)

Após 26 dias de administração, eles jejuaram por 12 horas e 60 minutos após a administração no dia seguinte, os ratos pretos de cada grupo receberam 2,0 g·kg-1 de glicose em 0, {{10}}.5, 1.0 e 2 respectivamente. .0 h de sangue da veia caudal foi coletado para medir o valor de glicose no sangue. Com o valor da glicemia como ordenada e o tempo como abcissa, foi feito um gráfico de variação da glicemia, e a área sob a linha da curva de glicemia de cada grupo experimental foi calculada de acordo com a fórmula (AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. Na fórmula: A, B, C e D são os valores de glicose no sangue em 0, 0,5, 1,0 e 2,0 h, respectivamente.

2.5.2 Cálculo do índice de resistência à insulina e índice de arteriosclerose

O índice de resistência à insulina foi calculado de acordo com o método da literatura [20]: HOMA-IR=Glicose × Insulina / 22. 5. HOMA - =20 × Insulina / (Glicose - 3.5) × 100%. IR é resistência à insulina e (%) é função celular. A unidade molar da glicose é mmoL·L-1

. A insulina é administrada em mU·L-1. Os números de glicose e insulina são medidos durante o jejum. O índice de arteriosclerose (índice aterogênico) foi calculado de acordo com o método descrito por Zheng et al. [21]. Método de cálculo: Índice aterogênico=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Efeitos de diferentes partes extraídas de Cistanche deserticola/Cistanche deserticola no INS sérico e HbA1c de camundongos pretos db/db

Pegue as amostras de soro congeladas e leve-as à temperatura ambiente antes de usá-las para testes com kits de imunoensaio ligado a enzima INS e HbA1c. Siga rigorosamente os métodos e etapas nas instruções do kit.

2.6 Efeitos de diferentes partes extraídas de Cistanche deserticola/Cistanche deserticola no nível de estresse oxidativo hepático de camundongos pretos db/db

Pegue as amostras de soro congeladas e leve-as à temperatura ambiente antes de usá-las para testes com kits de imunoensaio ligado a enzima MDA e SOD. Siga rigorosamente os métodos e etapas nas instruções do kit.

2.7 Efeitos de diferentes partes extraídas de Cistanche deserticola/Cistanche deserticola no metabolismo da gordura hepática de camundongos pretos db/db

Os níveis séricos de TG, CT, HDL-C e LDL-C de rato foram medidos usando kits relevantes. Para etapas de medição específicas, consulte as instruções do kit.

2.8 Efeitos de diferentes partes extraídas de Cistanche deserticola/Ratiana cânfora em UA, Cr e mALB em plasma e urina de camundongos pretos db/db

Pegue amostras congeladas de plasma e urina e leve-as à temperatura ambiente antes de usá-las para testar kits de imunoensaio ligado a enzima UA, Cr e mALB. Siga rigorosamente os métodos e etapas nas instruções do kit.

2.9 Observação de seções patológicas pancreáticas e renais por coloração HE

Os tecidos do pâncreas e dos rins embebidos em fixador de paraformaldeído a 10% por 24 horas foram removidos, lavados com água destilada e armazenados em etanol a 70%. Amostras de tecido foram removidas, desidratadas com etanol graduado, clarificadas, embebidas em parafina, seccionadas e depois coradas com hematoxilina e eosina (coloração H&E). Depois que a cola da seção secar, use um sistema de imagem digital de alta resolução para observar e tirar fotos das seções.

2.10 Determinação do colágeno tipo IV do tecido renal por imuno-histoquímica

Para expressão, as secções renais foram desparafinadas em água e depois submetidas à recuperação antigénica. Eles foram bloqueados com soro de cabra a 10% e incubados com o anticorpo primário a 4 graus durante a noite. Após a lavagem, o anticorpo secundário foi incubado. A solução atual era DAB para desenvolvimento de cores. Lavagem, desidratação e selagem foram realizadas sob microscópio óptico. Observe a expressão da proteína colágeno tipo IV no tecido renal.

2.11 Métodos estatísticos

Usando o software GraphPad Prism versão 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) para analisar os dados e os resultados

O resultado é média±SEM Indica que a diferença entre os dois grupos é unidirecional

ＡＮＯＶＡ( ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ′ teste de um par de coluna), método, P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.