Echinacoside protege contra disfunção mitocondrial induzida por 6 hidroxidopamina e respostas inflamatórias em células PC12 através da redução da produção ros

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Yue-Hua Wang,1,2 Zhao-Hong Xuan,3 Shuo Tian,1 e Guan-Hua Du1,2

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela perda progressiva de neurônios dopaminérgicos (DA) na substantia nigra. Disfunção mitocondrial e respostas inflamatórias estão envolvidas no mecanismo de dano celular em PD. 6-Hidroxydopamina (6-OHDA), um analógico da dopamina, danifica especificamente neurônios dopaminérgicos.Echinacoside(ECH) é um glicócuo feniltanóide isolado das hastes deCistanche Salsa, mostrando uma variedade de efeitos neuroprotetores em estudos anteriores. O presente estudo foi investigar seu efeito contra a neurotoxicidade induzida pelo 6-OHDA e possíveis mecanismos nas células PC12. Os resultados mostraram que a viabilidade celular 6-OHDA reduziu a viabilidade celular, diminuiu a atividade de redução da oxidação, diminuiu o potencial da membrana mitocondrial e induziu a apoptose mediada por mitocôndrias em comparação com células PC12 não tratadas. Contudoechinacosidetratamento atenuado significativamente essas alterações induzidas por 6-OHDA. Além dissoechinacosidetambém poderia aliviar significativamente as respostas inflamatórias induzidas por 6-OHDA. Outras pesquisas mostraram queechinacosidepoderia reduzir a produção de ROS induzida por 6-OHDA em células PC12. Esses resultados sugerem que o mecanismo subjacente deechinacosidecontra a neurotoxicidade induzida pelo 6-OHDA talvez envolvam atenuar a disfunção mitocondrial atenuante e respostas inflamatórias, reduzindo a produção de ROS.

1. Introdução

Doença de Parkinson (DP)é uma desordem neurodegenerativa caracterizada pela lenta degeneração progressiva dos neurônios de dopamina na substantia nigra pars compacta [1]. Embora as marcas neuropatológicas da DP sejam bem descritas, a etiologia permanece indefinida. Notavelmente, várias observações sugerem que a disfunção mitocondrial está envolvida na patogênese da DP e na degeneração dos neurônios dopaminérgicos [2, 3]. Mitocôndrias contêm muitas enzimas redox e ineficiências que ocorrem naturalmente de fosforilação oxidativa geram espécies reativas de oxigênio (ROS) [4]. Recentemente, evidências crescentes de estudos humanos e animais sugeriram que a neuroinflamação também é um importante contribuinte para a perda neuronal em DP [5].

6-Hidroxidopamina (6-OHDA) é específica para neurônios dopaminérgicos em modelos de roedores intrastriais e em algumas células [6-11]. A célula PC12 tornou-se um modelo celular popular para a pesquisa de DP porque esta linha celular possui muitas características de neurônios DAérgicos. Tem sido utilizado como modelo in vitro para o estudo da DP e para determinar o efeito de agentes protetores e terapêuticos. Echinacoside (Figura 1) é um fenilethanoide glicoside isolado e purificado das hastesCistanche Salsa[12], uma planta parasitária nativa do noroeste da China, que é usada como um try mecanismos subjacentes de echinacoside contra 6-OHDA- induceddamageinPC12cells.

2. Materiais e Métodos

2.1. Materiais. Echinacoside foi obtido do National Institutes for Food and Drug Control (Pequim, China). RPMI-1640 e soro bovino fetal foram obtidos de Gibco

(Grand Island, NY, EUA). 6-OHDA, MTT, 2,7-diclorodihifluoresceína diacetato, propidium iodida (PI) e resazurina foram comprados da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O kit de ensaio bioluminescente da ATP foi obtido da Promega (Madison, EUA). 5,5,6,6 -Tetracloroo-1,1,3,3 -tet-raethyl benzimidazolyl iodida de carbocyanina (JC-1) foi obtido do Instituto Beyotime de Biotecnologia (Haimen, Jiangsu, China). O kit Cytochrome C ELISA e o substrato fluorogênico Ac-DVD-AMC foram obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Os kits IL-1 e IL-6 ELISA foram obtidos da empresa limitada Boster Bio-engineer (Wuhan, China). O leitor de microplapes Spectramax M5 foi comprado da empresa molecular devices (Sunnyvale, CA, EUA).

2.2. Cultura e Tratamento Celular. As células PC12 foram cultivadas em RPMI-1640 suplementadas com 10% de soro de cavalo e 5% de soro bovino fetal. As condições foram mantidas a 37∘C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 [19]. As células foram emplacados em placas de 96 poços a uma densidade de 2 × 105 células/mL. Após 80% de confluência, as células foram pré-insubadas com diferentes concentrações de echinacoside em um meio RPMI-1640 sem soro por 1 h. Em seguida, 6-OHDA foi adicionado aos poços em uma concentração final de 100 M e incubado para outro Após o tratamento, alterações morfológicas foram observadas sob um microscópio. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio MTT [19]. Resumidamente, após o tratamento, o MTT na concentração final de 0,5 mg/mL foi adicionado a cada poço e incubado por 4h a 37∘C.

2.3.Alterações Morfológicas e Ensaio de Viabilidade das Células PC12. Após o tratamento, foram observadas alterações morfológicas sob um microscópio. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio MTT [19]. Resumidamente, após o tratamento, o MTT na concentração final de 0,5 mg/mL foi adicionado a cada poço e incubado por 4h a 37∘C. Em seguida, o supernascer foi removido e o produto formazan foi dissolvido em 100 L de sulfóxido de dimetil com agitação por 15 min em um agitador de placa microtiter e a absorvância foi lida a 570 nm usando um leitor de microplato Spectramax M5. Medicina Complementar e Alternativa Baseada em Evidências

2.4. Ensaio de nível ATP intracelular. O nível de ATP celular foi medido com um kit de ensaio de bioluminescente ATP de acordo com as instruções do fabricante. A luminescência foi monitorada em um leitor de microplaca no modo de luminescência após a adição de 100 L de luciferina e luciferase [20].

2.5. Medição da Atividade de Redução de Oxidação de Mitocôndrias por Resazurina. Após o tratamento, a resazurina no concen-tration final de 5 M foi adicionada aos poços e a intensidade da fluorescência foi examinada em uma excitação de 530 nm e uma emissão de 590 nm [21].

2.6. Medição do Potencial da Membrana Mitocondrial pelo JC-1. O potencial da membrana mitocondrial foi medido utilizando-se o kit de ensaio JC-1 de acordo com as instruções do fabricante. Após o tratamento, o meio de cultura foi removido e carregado com solução JC-1 por 15 min a 37∘C no escuro. A intensidade de fluorescência da razão vermelho/verde foi determinada em uma excitação de 490 nm e emissão de 530 nm (monômeros fluorescentes verdes) e 590 nm (agregados fluorescentes vermelhos), respectivamente [22].

2.7. Quantificação da Liberação Cytocromo C. Os níveis citocromo C citosômicos foram medidos utilizando-se um kit ELISA de acordo com as instruções do fabricante [23]. Resumidamente, após o tratamento, as células foram líficas e centrifugadas a 1000 g por 15 min, e então o sobrenante foi coletado como uma fração citoplasmática e usado para medições de liberação de citocromo C.

2.8. Determinação da Atividade Caspase-3. A atividade caspase-3 foi realizada de acordo com as referências com modificação [24]. Resumidamente, após o tratamento, o tampão de lise foi adicionado a cada poço e seguido por centrifugação a 12 000 g por 10 min. A atividade caspase-3 foi testada na medição dos supernacantes resultantes medindo o decote proteolítico do substrato fluorogênico Ac-DVD-AMC com um comprimento de onda de excitação de 380 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm.

2.9. Ensaio de Citometria de Fluxo em Células PC12. Após o tratamento, as células foram experimentadas, lavadas duas vezes com PBS, centrifadas a 1000 r/min por 5 min, e depois fixadas com 70% de etanol durante a noite a 4∘C. As células foram centrifugadas e lavadas duas vezes com PBS, resuspended em PBS (contendo 50 g/mL RNaseA), manchadas com PI na concentração final de 10 M por 30 min em temperatura ambiente no escuro, e lidas em um citômetro de fluxo a 488 nm excitação [10].

2.10. Medição do Nível IL-1 e IL-6 por ENSAIO ELISA. O meio de células PC12 cultivados foi coletado após o tratamento, e as concentrações IL-1 e IL-6 foram medidas por kits ELISA disponíveis comercialmente de acordo com o protocolo do fabricante.

2.11. Determinação do Nível de Espécies de Oxigênio Reativo Intracelular. Após a incubação com 6-OHDA, as células foram carregadas com 10M H2DCFH-DA por 30 min a 37∘C no escuro. A intensidade da fluorescência do DCF foi medida em uma excitação

Comprimento de onda de 495 nm e comprimento de onda de emissão de 530 nm em um leitor de microplaca [25].

2.12. Análise Estatística. Todos os dados são expressos como média ± SD. A análise estatística dos resultados foi realizada por análise unidirecional de variância (ANOVA), seguida de -teste. Significância estatística foi aceita em<>

3. Resultados

3.1. EfeitodeEchinacosideonMorfologia e Viabilidade Celular em Células PC12 Danificadas por 6-OHDA. Como mostrado na Figura 2(A), a viabilidade das células PC12 não teve diferença significativa na concentração de 0,1∼10 M de tratamento echinacoside para

24 h. Como mostrado na Figura 2(B), dentro de 24 horas de tratamento apenas com 6-OHDA, a maioria das células PC12 tinha sofrido alterações morfológicas, como sangramento de membrana e encolhimento celular. O cotreatment com echinacoside protegeu as células de danos 6-OHDA. O ensaio MTT mostrou que o tratamento de células PC12 com 6-OHDA sozinho resultou em uma redução de aproximadamente 25% na sobrevida celular dentro de 24 h, enquanto o cotreatment com 0,1 M, 1 M e 10 M echinacoside mostrou uma redução da citotoxicidade mediada por 6-OHDA (todas< 0.01,="" figure="">

3.2. Efeito de Echinacoside na Disfunção Mitocôndria Induzida por 6-OHDA em células PC12. Os níveis de ATP celular foram significativamente reduzidos após a incubação de 24 h com 100M 6-OHDA, enquanto o cotreatment com 1 Mand 10 M de echinacoside aliviou 6-OHDA-mediado ATP diminuir as alterações anabólicos nas células PC12. Os resultados mostraram que o cotreatment com 1 Mand 10 M de echinacoside poderia atenuar significativamente o comprometimento da atividade de redução de oxidação mitocondrias induzida por 6-OHDA (ambos< 0.05="" and="" figure="">

Como mostrado na Figura 3(c), o tratamento com 100 M de 6- OHDA por 24 h resultou em uma diminuição significativa do potencial da membrana mitocondrial em comparação com o grupo não tratado (< 0.01).="" however,="" the="" decrease="" of="" mitochondrial="" membrane="" potential="" induced="" by="" 6-ohda="" was="" significantly="" attenuated="" by="" cotreatment="" with="" 0.1="" m,="" 1="" m,="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" (all=""><>

3.3. Apoptose mediada anti-mitocôndria de Echinacoside em Células PC12 contra neurotoxicidade 6-OHDA. Os resultados mostraram que a exposição 6-OHDA resultou em um aumento de 167% no citocromo citosomico C em 167% em relação ao grupo não tratado (< 0.01).="" echinacoside="" at="" the="" dose="" of="" 0.1="" m,="" 1="" m,="" and="" 10m="" could="" significantly="" reduce="" the="" cytochrome="" c="" release="" into="" cytosol="" induced="" by="" 6-ohda="" (="">< 0.05,="">< 0.01,="" and="">< 0.01,resp.;="" figure="">

A atividade caspase-3 aumentou cerca de 3,3 vezes em comparação com o grupo não tratado após a exposição 6-OHDA (< 0.01).="" in="" contrast,="" cotreatment="" with="" 1="" m="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" showed="" a="" significant="" decrease="" in="" caspase-3="" activity="" compared="" with="" 6-ohda-treated="" cells,="" respectively="" (both="">< 0.05="" and="" figure="" 4(b)).pi="" is="" membrane="" permeability="" and="" is="" generally="" excluded="" from="" viable="" cells.="" so="" it="" is="" commonly="" used="" for="" identifying="" dead="" cells="" in="" a="" population.="" the="" results="" showed="" that="" the="" apoptosis="" rate="" was="" significantly="" increased="" following="" 24="" h="" incubations="" with="" 100="" m="" 6-ohda,="" whereas="" cotreatment="" with="" 1="" and="" 10="" m="" echinacoside="" significantly="" reduced="" 6-ohda-induced="" apoptosis="" (="">< 0.05,="">< 0.01,resp.,="" figure="">

3.4. Efeito Anti-Inflamatório de Echinacoside em Células PC12 Induzidas por 6-OHDA. Os resultados mostraram que as exposições 6-OHDA resultaram em aumento de doença-1 em comparação com o grupo não tratado (< 0.05;="" figure="" 4(a)).="" however,="" 10="" m="" of="" echinacoside="" could="" significantly="" reduce="" il-1="" release="" induced="" by="" 6-ohda="" (="">< 0.05;="" figure="">

O nível IL-6 também foi significativamente aumentado em comparação com o grupo não tratado (< 0.01).="" however,="" cotreatment="" with="" 0.1,="" 1,="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" all="" significantly="" decreased="" il-6="" release="" compared="" with="" 6-ohda-treated="" cells="" (both="">< 0.05="" and="" figure="">

3.5. Efeito do ECH na produção ROS Induzida por 6-OHDA em células PC12. As células tratadas com 6-OHDA apresentaram um aumento significativo (cerca de 1,4 vezes) de ROS intracelular em comparação com células não tratadas (< 0.01).="" this="" increase="" was="" significantly="" attenuated="" by="" coincubation="" with="" 0.1,="" 1,="" and="" 10="" m="" echinacoside="" (="">< 0.05,="">< 0.01,and="">< 0.01,resp.;="" figure="">

4. Discussão

Echinacoside é um dos principais constituintes de fenilethanoides glicosides extraídos de um famoso echinacoside tradicional relatado tem propriedades anti-apoptóticas e neuroprotetoras em doenças neurodegenerativas [18]. O estudo do In vivo relatou que o echinacoside teve efeitos neuroprotetores e melhora comportamental no modelo de camundongos de dano neuronal dopaminérgico induzido pelo MPTP, enquanto uma investigação posterior revelou que a echinacoside induziu a queda da caspase-3 e da ativação caspase-8 em apoptose induzida por MPP+de neurônios de grânulo cerebelar [16]. Outro estudo in vivo relatou os efeitos neuroprotetores do echinacoside nos neurônios dopaminérgicos estriais feridos por 6-OHDA [17]. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares que fundamentam essas ações não são totalmente compreendidos, especialmente por sua influência na função mitocondrial e nas respostas à inflamação. Então nosso estudo atual investigou os efeitos da echinacoside na função mitocondrial e respostas inflamatórias para elucidar seu mecanismo contra DP. Os resultados mostraram em primeiro lugar que a echinacoside aliviou significativamente a neurotoxicidade induzida pelo 6-OHDA nas células PC12 através da proteção da função mitocondrial e anti-inflamação.

A disfunção mitocondrial tem sido implicada na morte de neurônios nigrostriatal dopaminérgicos na doença de Parkin e seus modelos experimentais [26]. Mitocôndrias estão profundamente envolvidas na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) através dos portadores de elétrons da cadeia respiratória em doenças neurodegenerativas [27]. Uma grande variedade de ROS são produzidos no curso do metabolismo normal em sistemas biológicos, mas seu acúmulo além do

a quantidade necessária pode potencialmente danificar lipídios, proteínas e ácidos nucleicos.

6-OHDA, um analógico catecolamina, causa degeneração específica de neurônios de nigra substantia. A neurotoxicidade induzida pelo 6-OHDA é, em parte, devido à produção de ROS [28-32].

O OHDA leva à morte neuronal afetando a função mitocôndria, incluindo redução na produção de ATP, perturbação do metabolismo ROS e indução de apoptose [10, 33, 34]. No presente estudo, nossos resultados também demonstraram que a 6-OHDA danificou a função de redução oxidativa mitocondrial, diminuiu o potencial da membrana mitocondrial, induziu a apoptose mediada por mitocôndrias e aumentou a produção de ROS em células PC12.

Resazurina é um indicador fluorescente que é intermediário apenas entre reduções finais de oxigênio molecular e citocromo oxidase. Portanto, o potencial de redução oxidativa da resazurina permite que a cadeia respiratória funcione até a conclusão, o que fornecerá uma indicação mais precisa e sensível da função mitocondrial. JC-1 é uma sonda sensível ao potencial de membrana que se localiza na membrana mitocondrial interna onde forma monômeros (verdes) ou agregados (vermelho) com base no potencial da membrana mitocondrial. Assim, a resazurina e o JC-1 são valiosos instrumentos analíticos para examinar a função mitocondrial [35]. O presente estudo indicou que a diminuição da atividade de redução oxidativa mitocondrial e do potencial da membrana mitocondrial pode desempenhar papéis importantes na neurotoxicidade dopaminérgica induzida por 6-OHDA. Nosso resultado também mostrou atividade de redução oxidativa mitocondrial e potencial de membrana mitocondrial. Esses resultados fornecem que a melhora da disfunção mitocondrial pode ser uma melhor maneira de retardar a neurodegeneração progressiva dopaminérgica comumente associada à DP.

É geralmente aceito que a apoptose celular induzida por 6- OHDA é mediada por disfunção mitocondrial, caracterizada pela liberação citocromática C, e ativação caspase-3 [36]. Um estímulo apoptótico desencadeia a liberação do citocromo C das mitocôndrias em citosol, onde então ativa caspase-3 e outras caspases a jusante. No presente estudo, os resultados mostraram que as células PC12 expostas a 100 M de 6-OHDA melhoraram a liberação do citocromo C e a caspase inibiu dependentemente a liberação do citocromo C e as ativações de caspase-3. Esses resultados sugerem que o echinacoside poderia inibir a apoptose mediada por mitocôndrias reduzindo a liberação de citocromo C de mitocôndrias para citosol e ativação caspase-3.

Inflamação é uma característica neuropatológica do cérebro parkinsoniano e também em modelos experimentais da doença. Estratégias terapêuticas voltadas para reduzir a inflamação e inibir a produção desses fatores inflamatórios podem ser uma estratégia neuroprotetora promissora para o tratamento da doença de Parkinson e condições relacionadas [37]. Vários estudos também realizados no fluido cefalorraquidiano e durante a análise pós-morte em pacientes parkinsonianos revelaram aumento dos níveis de citocinas, como interleucina-1 (IL-1) e interleucina-6 (IL-6), sugerindo a ativação da resposta aproinflamatória[38, 39]. No presente estudo, os resultados mostraram que a exposição100 Mof6-OHDAinduced IL-1 e IL-6 liberam em células PC12. No entanto, o tratamento com echinacoside poderia inibir a liberação de IL-1 e IL-6 induzidas por 6-OHDA. Os resultados sugerem que a redução das respostas inflamatórias também está envolvida nos mecanismos de echinacoside contra a neurotoxicidade induzida pelo 6-OHDA.

Em conclusão, os resultados desta pesquisa mostraram que o echinacoside foi capaz de bloquear a neurotoxicidade induzida pelo 6-OHDA nas células PC12, e os mecanismos podem estar relacionados à proteção mitocondrial e anti-inflamação através da redução da produção de ROS. As informações fornecidas por este trabalho serão úteis para elucidar o mecanismo de echinacoside para anti-PD. Conclui-se que o echinacoside pode ser uma opção terapêutica promissora para a prevenção e tratamento da DP.

Conflito de Interesses

Os autores declararam não haver conflito de interesses

Confirmações

Este trabalho foi apoiado por Bolsas da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81473383) e do Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008; e 2013ZX09102106).