Efeitos neuroprotetores de quatro glicosídeos feniletanóides em H2O2-apoptose induzida em células PC12 através da via Nrf2/ARE

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Maiquan Li 1, Tao Xu 1, Fei Zhou 1, Mengmeng Wang 1, Huaxin Song 1, Xing Xiao e Baiyi Lu 1,*

1. Introdução

O estresse oxidativo, que é um desequilíbrio da homeostase antioxidante, induz a peroxidação lipídica, lesão de proteínas e DNA, envelhecimento celular e morte celular. Esse processo provavelmente contribui para vários distúrbios neurodegenerativos, como doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP) e isquemia/reperfusão [1]. O peróxido de hidrogênio (H2O2), que é uma das principais espécies reativas de oxigênio (ROS), é conhecido por causar peroxidação lipídica e danos ao DNA [2]. Além disso, H2O2 é uma fonte endógena de radicais livres de hidroxila que contribui para o nível de fundo de estresse oxidativo celular [3,4]. Portanto, estratégias terapêuticas para prevenir a apoptose induzida pelo estresse oxidativo podem ter potencial no tratamento de doenças neurodegenerativas.

O fator nuclear eritróide 2-relacionado ao fator 2 (Nrf2), é um fator de transcrição fortemente associado ao estresse oxidativo. A ativação de Nrf2 induz a transcrição de vários genes antioxidantes e de desintoxicação, incluindo heme oxigenase-1 (HO-1), NAD(P)H quinona oxidorredutase 1, anti-inflamatório [13] e imunomodulador [14 ] bioatividades. Osmanthusfragans é um ingrediente comum em vários alimentos asiáticos e tem sido consumido há muito tempo. Anteriormente, mostramos que os extratos de flores de O.fragrans melhoraram o aprendizado espacial e a memória, inibiram o dano oxidativo e exibiram atividades neuroprotetoras no envelhecimento induzido por d-galactose em um modelo de camundongo ICR [15]. Salidroside, acteoside e isoacteoside são as principais respostas de PhGs para as atividades antioxidantes de extratos de flores de O.fragrans [16].

Estudos sobre o efeito neuroprotetor dos PhGs obtiveram resultados desejáveis. Salidroside reduziu significativamente a apoptose celular de células PC12 que foram expostas em MPP plus [17,18]. Acteoside também aliviou a apoptose induzida por MPP plus e estresse oxidativo em células PC12 [19] e A p25-35-induzida por lesão de células SH-SY5Y [20]. O echinacoside foi investigado na apoptose induzida pelo fator de necrose tumoral-a (TNFa) em células SH-SY5Y [21], toxicidade dopaminérgica induzida por MPTP em camundongos [22], culturas primárias danificadas por glutamato de células corticais de rato [23] e { {19}}Dano induzido por OHDA em células PC12 [24]. Os resultados indicaram que os PhGs exibiram um efeito citoprotetor e são potenciais agentes para o tratamento de doenças neurodegenerativas. Estudos mostraram que as propriedades antioxidantes dos PhGs estão subjacentes a muitas outras bioatividades para esses compostos [25]. No entanto, poucos estudos investigaram o mecanismo molecular dos PhGs contra a toxicidade oxidativa.

Em nosso estudo, selecionamos quatro PhGs típicos: salidrosídeo (monossacarídeos feniletanoides), acteosídeo (dissacarídeos feniletanoides), isoacteosídeo (dissacarídeos feniletanoides) e equinacosídeo (trissacarídeos feniletanoides). Empregamos um modelo de morte neuronal usando células PC12 diferenciadas [26] para investigar o efeito protetor e o mecanismo molecular de PhGs no modelo de células PC12 induzidas por H2O2-. Demonstramos que os PhGs ativaram a via Nrf2/ARE ligando-se à proteína 1 associada a ECH semelhante a Kelch (Keap1). Este processo regulou positivamente as enzimas antioxidantes e aumentou a resistência das células PC12 ao estresse oxidativo.

Tratamento de doenças neurodegenerativas:PhGs de cistanche

2. Resultados

2.1. PhGs suprimiu H2O2-Citotoxicidade induzida em células PC12

Os efeitos citotóxicos de H2O2 e PhGs (0.1,1,5 e 10 卩g/mL) em células PC12 foram testados. Os resultados mostraram que H2O2 induziu a perda de viabilidade de células PC12 de maneiras dependentes da concentração e dependentes do tempo (Figura 1A). A exposição de células PC12 a 200 H2O2 por 2 h resultou em viabilidade celular de 57,4%. O pré-tratamento de células com PhGs em 0.1,1, 5 e 10 昭/mL não teve efeito sobre a viabilidade celular (Figura 1B) e protegeu marcadamente as células PC12 de danos induzidos por H2O2-, melhorando a viabilidade celular como 9.549-22.141 por cento , 12.092-25.289 por cento , 1.470-9.289 por cento e 3.411-11.441 por cento , respectivamente ( Figura 1C). No entanto, salidroside (0,1 ^g/mL), isoacteoside (0,1, 1, 5 e 10 ^g/mL), echinacoside (0,1,1 e 5 ^g/mL) pré-tratamento não mostraram diferença significativa na célula induzida por HzOz prejuízo. O pré-tratamento de células com PhGs também melhorou a característica morfológica induzida por H2O2 (Figura 1D).

Figura 1.Os PhGs suprimiram a citotoxicidade induzida por H2O2-em células PC12. A viabilidade celular foi detectada pelo ensaio MTT. Efeito citotóxico de H2O2 (A) e PhGs (B) em diferentes concentrações em células PC12. (C) PhGs atenuaram a diminuição induzida por H2O2-na viabilidade celular. As células PC12 foram incubadas com PhGs (0.1, e 10 mg/mL) por 24 h, e depois incubadas com 200 pM H2O2 por mais 2 h após a remoção dos PhGs. (D) Observação morfológica. As células após o tratamento foram observadas por um microscópio de contraste de fase (x100), CK: grupo normal, H2O2: grupo tratado com H2O2, HL: grupo tratado com baixa dosagem de salidroside, HH: grupo tratado com dosagem alta de salidroside, ML: grupo tratado com dosagem baixa de acteoside, MH: grupo tratado com alta dosagem de acteosídeo, IL: grupo tratado com dosagem baixa de isoacteosídeo, IH: grupo tratado com dosagem alta de isoacteosídeo, SL: grupo tratado com dosagem baixa de echinacoside, SH: grupo tratado com dosagem alta de echinacoside. ** p < 0,01="" versus="" grupo="" não="" tratado;="" #="" p="">< 0,05,="" versus="" grupo="" tratado="" com="" h2o2;="" ##="" p="">< 0,01,="" versus="" grupo="" tratado="" com="">

2.2. PhGs suprimiu H2O2-Acumulação intracelular induzida de ROS, peroxidação lipídica (MDA) e atividades aumentadas de superóxido dismutase (SOD) em células PC12

A exposição de células PC12 a 200 pM H2O2 por 2 h aumentou os níveis de ROS, o conteúdo de MDA e diminuiu a atividade de SOD (Figura 2). O pré-tratamento com PhGs atenuou o nível de ROS, salidroside e acteoside, e a alta dosagem de pré-tratamento com isoacteoside e echinacoside atenuou significativamente o nível de ROS (p < 0,01).="" o="" pré-tratamento="" com="" salidroside="" não="" mostrou="" efeito="" no="" conteúdo="" de="" mda,="" mas="" o="" pré-tratamento="" com="" acteoside="" atenuou="" significativamente="" o="" conteúdo="" de="" mda="" (p="">< 0,05).="" o="" pré-tratamento="" com="" isoacteoside="" e="" echinacoside="" atenuou="" significativamente="" o="" conteúdo="" de="" mda="" para="" um="">

Figura 2.PhGs bloquearam o acúmulo de ROS e MDA e aumentaram as atividades de SOD em células PC12. As células PC12 foram incubadas com PhGs (0.1 e 10 4g/mL) por 24 h e, em seguida, incubadas com 200 |^M H2O2 por outro 2 h após a remoção dos PhGs. (A) PhGs bloqueou o acúmulo de ROS e MDA. (B) PhGs bloqueou o acúmulo de MDA. (C) PhGs aumentou as atividades de SOD. CK: grupo normal, Modelo: grupo tratado com H2O2, Salidroside: grupo tratado com salidroside, Acteoside: grupo tratado com acteoside, Isoacteside: grupo tratado com isoacteoside, Echinacoside: grupo tratado com echinacoside. ** p < 0,01="" versus="" grupo="" não="" tratado;="" #="" p="">< 0,05,="" versus="" grupo="" tratado="" com="" h2o2,="" ##="" p="">< 0,01,="" versus="" grupo="" tratado="" com="">

2.3.PhGs H2O revertido2-Apoptose induzida em células PC12

O tratamento com H2O2 (200 |1M) por 2 h aumentou significativamente a apoptose em células PC12, com uma taxa total de apoptose de até 16,02 por cento (Figura 3). No entanto, o pré-tratamento com PhGs (0,1 e 10 卩g/mL) por 24 h diminuiu a taxa de apoptose de forma dependente da concentração (p < 0,01).="" salidroside,="" acteoside,="" isoacteoside="" e="" echinacoside="" diminuíram="" marcadamente="" a="" porcentagem="" de="" apoptose="" celular="" em="" 4.750-60,627="" por="" cento,="" 4.413-5,800="" por="" cento,="" 6.593-10,047="" por="" cento="" e="" 1.530-7,510="" por="" cento="" ,="">

Figura 3. PhGs reverteram a apoptose induzida por H2O2-em células PC12. As células PC12 foram incubadas com PhGs (0.1, e 10 卩g/mL) por 24 h, e então incubadas com 200 pM H2O2 por mais 2 h após a PhGs foram removidos. Em seguida, a apoptose foi medida por citometria de fluxo usando uma sonda fluorescente PI/FITC. CK: grupo normal, Modelo: grupo tratado com H2O2, Salidroside: grupo tratado com salidroside, Acteoside: grupo tratado com acteoside, Isoacteside: grupo tratado com isoacteoside, Echinacoside: grupo tratado com echinacoside. ** p < 0,01="" versus="" grupo="" não="" tratado;="" ##="" p="">< 0,01,="" versus="" grupo="" tratado="" com="">

2.4. PhGs reverteu H2O2-regulação negativa induzida da expressão proteica de HO-1, NQO1, GCLC e GCLM

HO{0}}, NQO1 e glutamato-cisteína ligase (GCL) são enzimas antioxidantes celulares importantes, e HO-1, NQO1 e subunidades catalíticas ou modificadoras de GCL (GCLC ou GCLM) são Nrf2-regulou genes a jusante [27]. A expressão proteica de HO-1, NQO1, GCLC e GCLM foi observada após o tratamento. Uma diferença óbvia foi encontrada entre a expressão proteica de HO-1 e NQO1 com ou sem H2O2 (Figura 6A-C) (p < 0.01).="" phgs="" (0.1="" e="" 10="" p^g/ml)="" reverteram="" a="" regulação="" negativa="" induzida="" por="" h2o2-da="" expressão="" proteica="" de="" ho-1="" (exceto="" salidroside="" em="" {{32}="" },1="" pg/ml),="" nqo1="" (exceto="" acteosídeo="" em="" 0,1="" pg/ml)="" (p="">< {{40}}.01).="" h2o2="" também="" regulou="" negativamente="" a="" expressão="" da="" proteína="" gclc="" e="" gclm="" (p="">< 0.05)="" (figura="" 6a,d,e).="" phgs="" (0.1="" e="" 10="" pg/ml)="" reverteram="" a="" regulação="" negativa="" de="" h2o2-induzida="" da="" expressão="" proteica="" de="" gclc="" (exceto="" echinacoside="" a="" 0,1="" pg/ml)="" (p="">< 0,01)="" e="" gclm="" (exceto="" salidroside="" a="" 0,1="" pg/ml)="" (p="">< 0,01).="" em="" seguida,="" os="" inibidores="" químicos="" de="" ho-1="" foram="" usados="" ​​para="" avaliar="" ainda="" mais="" os="" papéis="" das="" enzimas="" antioxidantes="" na="" regulação="" da="" proteção="" de="" phgs="" contra="" a="" citotoxicidade="" induzida="" por="" h2o2-.="" phgs="" (0,1="" e="" 10="" pg/ml)="" preveniram="" a="" citotoxicidade="" induzida="" por="" h2o2-,="" mas="" tal="" efeito="" protetor="" foi="" revertido="" pelo="" inibidor="" de="" ho-1="" znpp="" (p="">< 0,01)="" às="" 20="" pm="" (figura="" 6f,="" p="">< 0,01)="">

2.5. Expressão Keap1 e Análise de Ancoragem Molecular

Sob condições fisiológicas, Keap1 atua como uma proteína repressora de Nrf2 ligando-se ao domínio Neh2 de Nrf2 e direcionando Nrf2 a uma ubiquitina ligase E3 baseada em Cul3- para ubiquitinação e subsequente degradação pelo proteassoma 26S [28]. A capacidade de ligação ao Keap1 de PhGs foi avaliada por análise de docking molecular para investigar o mecanismo sob seu efeito antioxidante.

Efeito antioxidante: CistanchePhGs

3. Discussão

Nós investigamos a neuroproteção de PhGs na citotoxicidade induzida por H2O2 em células PC12. Os resultados mostram que o pré-tratamento com PhGs suprimiu significativamente a citotoxicidade induzida por HzOz, atenuou o nível de ROS intracelular, melhorou o nível de enzimas antioxidantes intracelulares e, finalmente, reverteu a citotoxicidade induzida por H2O2-em células PC12. Além disso, os PhGs aumentaram a ativação transcricional de Nrf2, revertendo a regulação negativa induzida por HzOz da expressão proteica de HO-1, NQO1, GCLC e GCLM. Além disso, os PhGs mostraram potencial interação com o sítio de ligação Nrf2 na proteína Keap1.

Na lesão celular PC12 induzida por H2O2-, a peroxidação lipídica, que se refere à degradação oxidativa de lipídios, aumentou a permeabilidade das membranas, levando ao dano celular [29]. A formação de MDA é amplamente utilizada como índice de peroxidação lipídica [30]. O H2O2 aumentou a produção de ROS e exauriu as enzimas de defesa antioxidante, como SOD, catalase e GPx. Este processo leva ao estresse oxidativo [31], que desempenha um papel fundamental na causa e progressão da maioria dos distúrbios neurodegenerativos. Consistente com estudos anteriores, observamos um nível aumentado de ROS, enzimas antioxidantes intracelulares reduzidas e apoptose aumentada de células PC12 após tratamento com H2O2. O pré-tratamento com PhGs atenuou significativamente o aumento induzido por HzOz em ROS intracelulares, melhorou as enzimas antioxidantes intracelulares e, finalmente, reverteu a citotoxicidade induzida por HzOz em células PC12.

Kuang et ai. [32] relataram que o echinacoside mostrou um efeito neuroprotetor significativo na citotoxicidade induzida por H2O2-em células PC12 através da via apoptótica mitocondrial. Neste estudo, descobrimos que echinacoside, salidroside, acteoside e isoacteoside mostraram efeitos neuroprotetores ao aumentar a atividade antioxidante das células PC12 porque aumentaram a ativação transcricional de Nrf2 e regularam positivamente a expressão de proteínas a jusante de HO-1, NQO1, GCLC e GCLM. Numerosos estudos demonstraram claramente que a ativação de genes alvo Nrf2, em particular HO-1, em astrócitos e neurônios protegem fortemente contra inflamação, dano oxidativo e morte celular. O sistema HO{10}} tem sido relatado como muito ativo no sistema nervoso central, e sua modulação aparentemente desempenha um papel crucial na patogênese de distúrbios neurodegenerativos [33]. Estudos recentes também esclareceram o papel do Nrf2 na progressão e risco da DP [9] e Keap1 como um alvo eficiente para a reativação do Nrf2 na DA [34]. Os resultados suportam novas evidências para o Nrf2 como alvo terapêutico em doenças neurodegenerativas.

A análise de docking molecular mostrou que os PhGs podem se ligar ao Keap1, com as seguintes capacidades de ligação: echinacoside > isoacteoside > acteoside > salidroside. Consistente com esses resultados, o pré-tratamento com PhGs levou à translocação nuclear de Nrf2, com a seguinte expressão de Nrf2 no ​​núcleo: echinacoside > isoacteoside * acteoside > salidroside. Assumimos que o número de glicosídeos afetou o possível modo de ligação de PhGs e Keap1, e o modo de ligação causou ainda a liberação de Nrf2 de Keap1. Este processo resultou na ativação de Nrf2 e dos genes a jusante e, finalmente, protege as células PC12 do estresse oxidativo induzido por H2O2 -.

Efeitos neuroprotetores do cistanchePhGs

4. Materiais e Métodos

4.1. Compostos Químicos e Reagentes

Salidroside (CAS No. {{0}}), acteoside (CAS No. 61276-17-3), isoacteoside (CAS No. 61303-13-7) e echinacoside (CAS No. {{3}) }) foram adquiridos da YYuanye Biotechnology Company (Xangai, China). Os PhGs foram dissolvidos em PBS para produzir uma solução estoque de 10 mg/mL, que foi armazenada a -20 grau. O H2O2 foi adquirido da Aladdin® (Xangai, China). O meio RPMI-1640 e o soro fetal bovino foram adquiridos da Hyclone (Logan, UT, EUA), e 0,5 por cento de tripsina EDTA, penicilina e estreptomicina foram adquiridos da Keyi (Hangzhou, China). MDA, kits de diagnóstico SOD, MTT e DCFH-DA foram adquiridos do Beyotime Institute of Biotechnology (Nanjing, Jiangsu, China). O kit de coloração dupla Anexina V-FITC/PI foi adquirido da Solarbio Life Sciences (Pequim, China). Anticorpos para Nrf2, Histona H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM e p-actina, IgG anti-peróxido de rábano (HRP) e anti-coelho-HRP-IgG foram adquiridos da Abcam (Londres, Reino Unido). Os inibidores de HO-1 e ZnPP foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). RNAiso Plus, Kit de reagentes PrimeScript™RT com gDNA Eraser e SYBR® Premix Ex Taq™ II foram adquiridos da Takara (Shiga, Japão). O Reagente de Transfecção Lipofectamine® RNAiMAX foi adquirido da Thermo Fisher Scientific (Waltham, Reino Unido). As sequências de siRNA de Nrf2 foram as seguintes: direta, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; e reverso, UUAAGACACUGUAAUUCGG. Enquanto isso, as sequências de controle de siRNA foram as seguintes: direta, UUCUCCGAACGUGUCACGU; e reverso, ACGUGACACGUUCGGAGAA.

4.2. Cultura de células

A linha de feocromocitoma adrenal de camundongo (células PC12) foi obtida do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular, SIBS, (CAS, Xangai, China). As células foram mantidas em RPMI-1640 (Hyclone) contendo 10 por cento de soro fetal bovino (Hyclone), 100 U/mL de penicilina e 0,1 mg/mL de estreptomicina a 37 graus com 5 por cento de CO2. O meio foi trocado a cada dois dias.

4.3. Ensaio de Viabilidade Celular

As células PC12 foram semeadas em 96-placas de poço a 2 x 104 células/poço. Após a fixação, as células foram pré-incubadas com ou sem inibidor por 20 min, incubadas com ou sem PhGs por 24 h, e então incubadas com H2O2 por mais 2 h após a remoção dos PhGs. Após a incubação, as células foram tratadas com 5 mg/mL de MTT por 4 h a 37 graus e os meios foram cuidadosamente removidos. Os cristais de formazan que se formaram pelas células sobreviventes foram dissolvidos em 150 rL de DMSO para gerar uma cor azul [35], e a absorbância foi medida a 570 nm em um leitor de placas. Os controles utilizaram a mesma concentração de meio com DMSO sozinho. A viabilidade celular foi normalizada como a porcentagem de controle.

As concentrações de PhGs (0.1,1,5 e 10 Rg/mL) foram escolhidas dependendo da análise de citotoxicidade dos PhGs e do efeito citoprotetor relatado do echinacoside [32]. De acordo com o relatório, não houve efeito de citotoxicidade mostrado abaixo de 10 Rg/mL, e foi relatado que o equinacosídeo mostrou efeito citoprotetor no modelo de células lesadas por HzOz.

4.4. Ensaio de Apoptose

A apoptose foi detectada com um kit de coloração dupla Anexina V-FITC/PI (Solarbio). As células PC12 foram semeadas em 6-placas de poço a 2 x 105 células/poço. Após a fixação, as células foram tratadas com PhGs (0,1 e 10 Rg/mL) por 24 h e incubadas com H2O2 por mais 2 h após a remoção dos PhGs. Após a incubação, as células foram lavadas em PBS frio, centrifugadas duas vezes a 1500 rpm por 10 min e ressuspensas em 500 rL de tampão de ligação. Anexina V marcada com FITC (5 rL) e iodeto de propídio.

Abreviaturas

Subunidade catalítica de glutamato-cisteína ligase de GCLC

Subunidade modificadora catalítica de glutamato-cisteína ligase GCLM

peróxido de hidrogênio H2O2

HO-1 heme oxigenase 1

Keap1 Kelch ECH proteína 1 de associação

NQO1 NAD(P)H quinona oxidorredutase 1

Nrf2 fator nuclear eritróide 2-fator 2 relacionado

PhGs salidroside, acteoside, isoacteoside e echinacoside

Espécies reativas de oxigênio ROS

ZnPP zinco protoporfirina

Extrato de Cistanche deserticola: PHG de cistanche

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