Expressão Diferencial de Enzimas Metabolizantes de Esfingolipídeos em Ratos Espontaneamente Hipertensos: Um Possível Substrato para Suscetibilidade a Danos Cerebrais e Renais
Feb 24, 2022
Abstrato: Alterações no metabolismo dos esfingolipídeos, uma classe de moléculas biologicamente ativas nas membranas celulares com efeito direto na homeostase vascular, são cada vez mais reconhecidas como importantes determinantes em diferentes distúrbios vasculares. No entanto, não está claro se os esfingolipídios estão implicados na patogênese da doença cerebrovascular e hipertensiva.dano renal. Neste estudo, avaliamos a existência de possíveis anormalidades relacionadas ao metabolismo dos esfingolipídeos no cérebro eRimde duas cepas de ratos espontaneamente hipertensos bem validados, os modelos com tendência a acidente vascular cerebral (SHRSP) e resistente a acidente vascular cerebral (SHRSR), em comparação com a cepa de rato normotenso Wistar Kyoto (WKY). Nossos resultados mostraram uma alteração global no metabolismo dos esfingolipídeos tanto no cérebro quantorenal tecidos de ambas as estirpes hipertensas em comparação com o rato normotenso. No entanto, poucos defeitos, como a redução da expressão de enzimas envolvidas no metabolismo/catabolismo da esfingosina-1-fosfato e nas vias biossintéticas de novo, foram detectados exclusivamente no SHRSP. Embora mais estudos sejam necessários para entender completamente o significado desses achados, eles sugerem que defeitos em moléculas lipídicas específicas e/ou suas vias metabólicas relacionadas podem provavelmente contribuir para a patogênese da lesão de órgãos-alvo hipertensivos e podem eventualmente servir como futuros alvos terapêuticos para reduzir as consequências vasculares da hipertensão.
Palavras-chave:esfingolípidos; derrame; cérebro; rim; SHR; WKY
IntroduçãoA hipertensão representa um importante problema de saúde que causa danos a órgãos específicos e consequências clínicas dramáticas, levando a um aumento da taxa de morte e incapacidade nas sociedades ocidentais [1-3]. Para reduzir a carga das complicações hipertensivas, é necessária uma compreensão mais abrangente dos mecanismos etiopatogenéticos subjacentes. A disponibilidade de modelos animais que possam mimetizar de perto a patologia humana e, ao mesmo tempo, simplificar a complexidade inerente ao estudo de populações humanas, pode ser extremamente útil neste concurso. Atualmente, o rato espontaneamente hipertenso propenso a acidente vascular cerebral (SHRSP), que apresenta uma grande predisposição a doenças cerebrais edano renal, particularmente quando alimentado com uma dieta rica em sal/baixo teor de potássio, representa um modelo ideal. A hipertensão e os fatores dietéticos se comportam como fatores de risco predisponentes para ratos e humanos [4,5]. O SHRSP mostra uma maior frequência de acidente vascular cerebral quando alimentado com uma dieta de estilo japonês (JD) do que seu controle estritamente relacionado, o resistente a acidente vascular cerebral (SHRSR), apesar de níveis semelhantes de pressão arterial [6]. De importância,dano renal sempre precede eventos de AVC [6]. Embora os mecanismos moleculares subjacentes não sejam completamente compreendidos, evidências indicam que a disfunção vascular resultante e as conseqüentes lesões estruturais favorecemdano renale desenvolvimento de AVC.
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Ao longo dos últimos anos, alguns dos aspectos mecanicistas e determinantes das doenças cerebrovasculares edano renalocorrência foi identificada no modelo SHRSP [7-12]. No entanto, ainda há muito a ser descoberto. Esfingolipídeos, incluindo Ceramidas (Cer), esfingosina e sua forma fosforilada Esfingosina-1-fosfato (S1P), representam os principais constituintes lipídicos de membranas biológicas e modulam várias funções importantes para populações de células neuronais e não neuronais [13]. Não menos importante, no entanto, é o papel fundamental que desempenham na formação e função vascular [13-15], bem como na regulação da integridade da barreira hematoencefálica (BHE) através da modulação de proteínas de junção estreita [16]. A este respeito, as evidências indicam que a síntese de novo de esfingolipídeos é crucial na preservação das funções das células endoteliais [17,18], provavelmente contribuindo para a integridade vascular e homeostase. O metabolismo defeituoso dos esfingolipídeos foi descrito como subjacente a diferentes condições cardiovasculares [19,20]. No entanto, nenhuma evidência direta de um papel causador dos esfingolipídios na patogênese da lesão hipertensiva de órgãos-alvo ainda foi fornecida. Apesar da falta de detalhes mecanísticos, a via de S1P, um lipídio bioativo, demonstrou ser neuroprotetora durante a isquemia [21,22], e a estimulação de seus receptores leva a efeitos benéficos em um modelo animal de acidente vascular cerebral [23]. Assim, é concebível que exista uma forte interação entre acidente vascular cerebral e esfingolipídios. Neste estudo, investigamos o cérebro erenalexpressão de várias moléculas envolvidas nas vias dos esfingolipídeos em ambas as cepas SHRSP e SHRSR, em relação à cepa normotensa WKY. Nossos resultados destacam, pela primeira vez, um metabolismo aberrante de esfingolipídios no cérebro ou no rim de ambos os modelos animais hipertensos. É importante ressaltar que alguns defeitos foram detectados exclusivamente na cepa SHSRP. Essa evidência sugere que alterações em moléculas lipídicas específicas e/ou suas vias específicas podem contribuir potencialmente para a patogênese da hipertensão e da lesão de órgãos-alvo hipertensivos.
Resultados
Níveis de enzimas metabolizadoras de S1P são perturbados em SHRSPPara revelar se qualquer distúrbio potencial no metabolismo dos esfingolipídeos foi detectável nas cepas SHRSP e SHRSR, primeiro investigamos a expressão de moléculas implicadas nas vias de síntese e degradação de S1P (esquematizadas na Figura 1). Para isso, avaliamos os níveis de SPHK1 e 2, bem como de SGPL1 no cérebro erenaltecidos de ambos os ratos espontaneamente hipertensos em comparação com a cepa WKY. Conforme relatado na Figura 2, os ratos SHRSP foram caracterizados por uma redução significativa de SPHK2, bem como de SGPL1 no cérebro, quando comparados a WKY e SHRSR. Nenhuma diferença norenala expressão de todas as enzimas foi detectada entre as três linhagens de ratos.
Níveis de receptores S1P são aberrantes em ratos espontaneamente hipertensosEvidências indicam que a modulação dos receptores S1P pode ser benéfica em modelos isquêmicos [23]. Aqui, a fim de estabelecer se alguma alteração em sua expressão poderia ser eventualmente associada aos fenótipos da doença, avaliamos os níveis de proteína dos receptores mais abundantes, S1PR1-3 [24], nas três linhagens de ratos. A análise de imunotransferência revelou uma variação na expressão de todos os três receptores de forma dependente do tecido. Curiosamente, S1PR1 foi o único receptor cuja expressão aumentou tanto no cérebro quanto nos rins de SHRSR (Figura 3A,3B). Por outro lado, a análise dos tecidos do SHRSP não mostrou variação na expressão de todos os receptores, exceto para S1PR3 cujos níveis aumentaram no cérebro, de forma semelhante aos detectados no SHRSR (Figura 3E)
A expressão de ceramida sintases é defeituosa em vários tecidos de modelos SHRSP e SHRSREvidências anteriores indicam que os níveis de ceramida estão aumentados em modelos pré-clínicos de acidente vascular cerebral, bem como em pacientes humanos [25-27]. Aqui, a fim de avaliar se o metabolismo da ceramida pode ser afetado em ratos espontaneamente hipertensos, eventualmente resultando em níveis aumentados de ceramida, investigamos a expressão das ceramidas sintases, que são relatadas como as mais abundantes no cérebro (CerS1 e CerS2) E norins(CerS2 e CerS4) [28]. Conforme relatado na Figura 4, a análise de qPCR revelou um desarranjo generalizado na expressão das sintases, com algumas diferenças entre as duas cepas espontaneamente hipertensas. SHRSP mostrou níveis aumentados de mRNA CerS1 no cérebro quando comparado a WKY ou SHRSR (Figura 4A) e níveis reduzidos de CerS6 norins, semelhante ao observado no SHRSR (Figura 4D). Por outro lado, SHRSR foram caracterizados por uma expressão reduzida de mRNA CerS2 no cérebro e nos rins (Figura 4B,4C).
A expressão de SPTLC1 é reduzida em tecidos SHRSPEstudos recentes apontaram um potencial envolvimento da biossíntese de novo de esfingolipídeos na hipertensão e doenças vasculares [29,30]. Para investigar qualquer possível associação entre as vias esfingolipídicas de novo e acidente vascular cerebral, avaliamos os perfis de expressão proteica de SPTLC1 e 2, duas subunidades de SPT, as enzimas limitantes da taxa na biossíntese de novo de esfingolipídeos [13], tanto no cérebro quanto no cérebro.renaltecidos. Conforme relatado na Figura 5A,B, os ratos SHRSP foram caracterizados por uma redução significativa de SPTLC1 no cérebro erins.Curiosamente, SPTCL2 também foi reduzido no cérebro de SHRSP em comparação com SHRSR (Figura 5C).
A expressão da 3-ceto-dihidroesfingosina redutase é reduzida em ambos os ratos espontaneamente hipertensosA alteração na biossíntese de novo de esfingolipídeos foi ainda confirmada pela análise das enzimas 3-ceto diidroesfingosina redutase (KDSR) e ceramida dessaturase (DES), normalmente envolvidas na síntese de novo de esfingolipídeos [13]. A análise de qPCR mostrou uma redução significativa dos níveis de expressão de mRNA de KDSR norinsde SHRSP e SHRSR (Figura 6B). Não foram observadas mais alterações.
Figura 2. A expressão de enzimas metabolizadoras de S1P é defeituosa em tecidos cerebrais de SHRSP. Imunotransferências recortadas representativas e análise densitométrica de SPHK1 (esfingosina quinase 1) (A,B), SPHK2 (esfingosina quinase 2) (C,D) e SGPL1 (S1P-Liase) (E,F) em tecidos cerebrais e renais de WKY, SHRSP e SHRSR. Em cada immunoblotting, todas as amostras foram processadas no mesmo gel. As amostras não adjacentes são separadas por uma linha preta. Os dados são representados como média ± SD, n {{10}}/7 para cada grupo de ratos. * p < 0.05;="" **="" p="">< 0,01;="" ***="" p="">< 0,001="" (anova="" one-way,="" pós-teste="" de="" tukey).="" a="" data="" bruta="" para="" gerar="" a="" figura="" é="" relatada="" na="" tabela="" de="" material="" suplementar="">
Discussão
Apesar dos tremendos esforços de pesquisa por cientistas básicos e clínicos, complicações hipertensivas, como acidente vascular cerebral erenaldoenças ainda representam as principais causas de morte em todo o mundo [1-3]. Assim, o conhecimento de vias patogênicas alternativas e novos alvos de drogas são necessários para preservar a saúde cerebrovascular e renal. Explorar o metabolismo dos esfingolipídeos, uma classe de moléculas biologicamente ativas nas membranas celulares que desempenham um papel fundamental na homeostase vascular, pode abrir caminho para um novo horizonte de compreensão. Embora evidências emergentes indiquem que alterações no metabolismo de esfingolipídios, como S1P e ceramidas, podem ter um papel em distúrbios vasculares e hipertensão [31], ainda não está claro se estão implicados na patogênese de danos em órgãos hipertensivos. Neste estudo, tentamos obter alguns insights sobre o metabolismo de esfingolipídeos nas linhagens de ratos SHRSP e SHRSR, dois modelos pré-clínicos espontaneamente hipertensos com uma suscetibilidade diferente arenale desenvolvimento de danos cerebrovasculares. Em particular, realizamos o estudo em ratos de 8-semanas de idade, em uma idade em que se tornam hipertensos, mas ainda estão livres de danos nos órgãos-alvo. Por meio dessa abordagem, buscamos identificar qualquer assinatura "esfingobiológica" potencialmente envolvida na evolução diferente da doença hipertensiva nos dois modelos de ratos. Uma cepa de rato normotenso serviu como controle apropriado. Nossos resultados mostraram pela primeira vez que ambos os modelos de ratos hipertensos foram caracterizados por um desarranjo global do metabolismo dos esfingolipídeos, mas poucas alterações foram específicas para a cepa SHRSP ou SHRSR. Em particular, a expressão de SPHK2 e SGPL1 foi significativamente reduzida apenas no cérebro de SHRSP. A redução dos níveis de SPHK2 pode ter efeitos extremamente deletérios no cérebro, onde é particularmente abundante nas células endoteliais microvasculares e exerce um papel protetor contra a isquemia induzida pelo pré-condicionamento hipóxico [32]. Por outro lado, a redução de SGPL1 pode ser potencialmente tóxica para as funções das células neuronais [33].
À luz disso, é concebível que um desequilíbrio das enzimas metabolizadoras de S1P, com uma consequente biodisponibilidade defeituosa de S1P, possa resultar em dano vascular aumentado. O possível envolvimento de S1P na regulação dos mecanismos moleculares potencialmente associados ao acidente vascular cerebral veio da evidência de que os níveis de S1PR1, que foi recentemente identificado como um gene candidato posicional para sensibilidade ao sal em SHRSP [22], aumentaram nos tecidos de SHRSR . Esses resultados sugerem um possível duplo papel da S1P na determinação do dano vascular e o consequente evento de acidente vascular cerebral. De fato, a redução da biodisponibilidade de S1P e/ou a regulação defeituosa de suas vias relacionadas poderia aumentar a suscetibilidade ao AVC no SHRSP. Por outro lado, o aumento da expressão de S1PR1, cuja ativação foi relatada como benéfica em modelos experimentais de isquemia cerebral [34-36], poderia eventualmente representar um fator protetor em SHRSR. Nossos achados revelaram outra diferença interessante entre as duas linhagens de ratos espontaneamente hipertensos. A expressão aumentada de CerS1, detectada apenas no SHRSP, pode ser sugestiva de uma biodisponibilidade elevada de ceramida cerebral que pode revelar-se tóxica e potencialmente associada a uma maior suscetibilidade ao acidente vascular cerebral. Isso é corroborado por vários estudos que relatam a associação entre o aumento do teor de ceramida, doença isquêmica de pequenos vasos e hiperintensidades da substância branca [37,38].
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Outra observação importante derivada de nosso estudo é a redução significativa de SPTLC1 e 2 em SHRSP em comparação com SHRSR, no qual não foram detectadas variações. Embora ambas as cepas hipertensivas compartilhem alguns defeitos na expressão de outros genes envolvidos na síntese de novo de esfingolipídeos, a redução de SPTLCs sugere claramente um papel fundamental dessa via metabólica na patogênese da doença cerebrovascular. Nesse contexto, evidências recentes indicam que a síntese endotelial de novo de esfingolipídios regula a pressão arterial e a homeostase endotelial [30], destacando o papel crítico dos esfingolipídios sintetizados de novo em doenças vasculares. Os dados atuais podem indicar que a síntese de novo de esfingolipídeos pode ser perturbada no SHRSP. Nosso estudo é o primeiro a abordar aspectos específicos do metabolismo dos esfingolipídeos em relação ao acidente vascular cerebral. Embora não tenhamos realizado nenhuma análise quantitativa de esfingolipídios em tecidos de ratos, nossos achados sugeriram uma possível alteração na biodisponibilidade de diferentes esfingolipídios como S1P e ceramida em SHRSP. Como a S1P estimula a proliferação celular e as vias de sobrevivência, enquanto as ceramidas geralmente exercem efeitos antiproliferativos e apoptóticos [39], o desequilíbrio entre elas pode afetar a homeostase cerebral em SHRSP e potencialmente contribuir para a patogênese do acidente vascular cerebral. Considerando a natureza correlativa de nosso estudo, mais investigações são necessárias para entender completamente o potencial papel central das alterações dos esfingolipídeos na patogênese da lesão de órgãos hipertensivos, a fim de desenvolver estratégias terapêuticas mais eficazes "baseadas em esfingolipídeos". Considerando que diversos medicamentos, cujos alvos moleculares pertencem às vias dos esfingolipídeos, já estão disponíveis para o tratamento de outras doenças [40], acreditamos que nossos achados possam oferecer subsídios para explorar seu potencial terapêutico em cérebro e hipertensosrenaldistúrbios vasculares.
Materiais e métodos
Modelos de animaisTodos os experimentos foram realizados usando cepas de ratos machos de dois meses de idade propensos a acidente vascular cerebral espontaneamente hipertensos (SHRSP), resistentes a acidente vascular cerebral espontaneamente hipertensos (SHRSR) e comparando-os com uma cepa de ratos normotensos pareados por idade e sexo, WistarKyoto (WKY) . SHRSP e SHRSR são os modelos animais mais comumente usados em estudos pré-clínicos de hipertensão e de acidente vascular cerebral associado [5,6]. Eles foram mantidos no biotério do IRCCS Neuromed, mantidos em temperatura ambiente constante e ciclos de 12 h dia/noite, e foram alimentados com ração regular para ratos e água ad libitum. Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo IRCCS Neuromed Animal Care Review Board e pelo "Istituto Superiore di Sanità" (número de licença ISS: 1086/2020) e foram conduzidos de acordo com a Diretiva da UE 2010/63/EU para experimentos com animais .
ImunotransferênciasOs ratos foram sacrificados por decapitação e tecidos (cérebro erins) foram congelados em N2 líquido e pulverizados em almofariz com pilão. O tecido pulverizado foi homogeneizado em tampão de lise contendo 20 mM de Tris, pH 7,4, 1 por cento de Nonidet P-40, 1 mM de EDTA, 20 mM de NaF, 2 mM de Na3VO4 e mistura de inibidor de protease 1:1000 (Sigma-Aldrich) e sonicado com pulsos de 2*10 s. Para immunoblotting, 20 µg de lisado de proteína total foram immunoblotted com os seguintes anticorpos: anti-SPHK1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EUA), anti-SPHK2 (1:1000) (Abcam, Cambridge, UK ), anti-SGPL1 (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA), anti-S1PR1 (1:1000) (Imunological Sciences), anti-S1PR2 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology) , anti-S1PR3 (1:1000) (Imunological Sciences), anti SPTLC1 (1:1000) (Abcam) e anti-SPTLC2 (1:1000) (Abcam). Para normalização de proteínas, foi utilizado anti-actina (1:2000) (Immnunological Sciences, Roma, Itália). As bandas de proteína foram detectadas por ECL Prime (GE Healthcare) e quantificadas com o software Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).
Extração de RNA e qPCR.
O RNA total foi extraído usando o kit Rneasy (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 1000 ng de RNA total foram sintetizados usando transcriptase reversa Super Script III (Invitrogen) e o cDNA resultante foi amplificado usando Power SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) seguindo as instruções do fabricante. A análise quantitativa de qPCR foi realizada usando primers específicos: Kdsr FW: 50-TAAAGCAGGCACAGGAGAAG-30; Kdsr RV: 50-GCCTGAGAGGACACAAACA -30; Des FW: 50-AGAGGAGTTCGAATGGGTCTA-30; Des RV: 50- GATAGCCAGAGTCATGGAATGG-30; CerS1 FW: 50- CCTGGAAGCTTCTGTTCTACTT-30; CerS1 RV: 50- CATGTACACGGTGGCATAGA-30; CerS2 FW: 50- CATGGCTGTCACTGTGGATAA-30; CerS2 RV: 50- GAGAAGCAGAGGAGAATGATGG-30; CerS6 FW: 50- CAGGAGTGGACAAAGCAAGA-30; CerS6 RV: 50- TGGTTTGGCTATGAATCTCTCG-30; Gapdh FW: 50- AACGACCCTTCATTGACCTC-30; Gapdh RV: 50- CCTTGACTGTGCCGTTGAACT-30.
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