O conjugado dendrímero-tesaglitazar induz uma mudança fenotípica da microglia e melhora a fagocitose -amilóide† Parte 3

D-Tesa aumentou a expressão de enzimas responsáveis ​​pela remoção de proteínas patogênicas

A enzima degradadora de insulina (Ide) e a metaloprotease de matriz 9 (MMP9) são enzimas secretadas pela micróglia que degradam a -amilóide e a -sinucleína extracelular.71,72 O tratamento com D-Tesa aumentou significativamente a expressão de Ide 3. 1- vezes (p < 0,001) com uma tendência de aumento da expressão de MMP9 (aumento de 1,8- vezes, p=0,057) em comparação com controles tratados apenas com LPS (Fig. 6A e B).

Nos últimos anos, cada vez mais estudos têm mostrado que existe uma estreita ligação entre as enzimas que degradam a insulina e a memória. Esta descoberta nos fornece pistas valiosas para explorar ainda mais o mecanismo de formação e manutenção da memória.

A enzima degradadora da insulina é uma enzima importante, cuja principal função é decompor a insulina para manter o equilíbrio do açúcar no sangue. No entanto, estudos recentes mostraram que a enzima degradadora da insulina não só desempenha um papel metabólico, mas também afeta diretamente o crescimento e a reparação dos neurônios no cérebro e desempenha um papel importante na manutenção da memória.

Muitos estudos demonstraram que quanto maior o nível da enzima que degrada a insulina, melhor será a memória. Isto ocorre porque as enzimas que degradam a insulina podem promover o crescimento e a reparação dos neurônios, melhorando assim a capacidade de aprendizagem e memória do cérebro. Além disso, as enzimas que degradam a insulina também podem promover a conexão entre os neurônios, aumentando assim a associação e a retenção da memória.

O importante papel das enzimas degradadoras da insulina na memória tem sido amplamente utilizado no campo da medicina clínica. Os pesquisadores descobriram que, ao inalar enzimas que degradam a insulina, não apenas a memória pode ser melhorada, mas também a capacidade cognitiva e os sintomas depressivos.

Em suma, a ligação entre as enzimas degradadoras da insulina e a memória é um campo muito importante, que nos fornece pistas valiosas para estudar o mecanismo biológico da memória. Pesquisas futuras explorarão ainda mais a função e o papel das enzimas que degradam a insulina, nos ajudarão a compreender melhor o mecanismo de formação e armazenamento da memória e fornecerão uma base melhor para melhorar a capacidade de aprendizagem e memória do cérebro humano. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e o Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque o Cistanche também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento, que são muito importantes para a memória e o aprendizado. Além disso, Cistanche também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro obtenha nutrição e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

Clique em conhecer maneiras de melhorar sua memória

Free Tesa aumentou significativamente a expressão de Ide 2- vezes (p=0 0,011) e aumentou não significativamente MMP 92- vezes (p=0 0,35) (Fig. 6A e B). A microglia M2 em doenças neurodegenerativas pode remover -amilóide, -sinucleína e outras proteínas patogênicas por meio de degradação enzimática ou fagocitose, e D-Tesa regula positivamente as proteínas envolvidas nesses processos (ou seja, Ide e MMP9).71–73

A expressão da Ide é regulada negativamente na patologia da DA e DP e é conhecida por ser regulada positivamente pelos agonistas do PPAR, o que é consistente com os nossos resultados.

71,72 Funcionalmente, foi demonstrado que apenas um aumento de 2- vezes nos níveis de Ide diminui o acúmulo de -amilóide e a morte neuronal in vivo.74,75 Portanto, o aumento de 3- vezes nos níveis de Ide observado por D-Tesa, e 2-o aumento de Ide pelo freeTesa pode ser terapeuticamente eficaz in vivo.

D-Tesa aumenta a fagocitose de -amilóide

O CD36 é um receptor eliminador microglial que facilita a fagocitose e a degradação do -amilóide.73 Sua regulação negativa na DA resulta na diminuição da remoção do -amilóide, mas é regulada positivamente pela ativação do PPAR.

Tanto o D-Tesa quanto o Tesa livre aumentaram significativamente os níveis de expressão de CD36 quando comparados às células expostas apenas ao LPS (p < 0.0001 vs. p < 0,005 para D-Tesa e Tesa livre , respectivamente), mas o D-Tesa foi muito mais eficaz que o Tesa livre (6-aumento de vezes vs. aumento de 2,{11}}vezes para D-Tesa e Tesa livre, respectivamente, p < 0,0005) (Fig. 6C ).

Nossos resultados são consistentes com estudos anteriores com pioglitazona (outro agonista de PPAR) que mostraram que o aumento da fagocitose microglial de -amilóide ocorre através de um mecanismo dependente de PPAR e CD36-.73

Para investigar se a regulação positiva de CD36 do tratamento com D-Tesa se correlacionava com o aumento da capacidade fagocítica dessas células, realizamos um ensaio de fagocitose funcional de -amilóide. 73

Resumidamente, depois de tratar as células como fizemos nos ensaios in vitro anteriores, aplicamos -amilóide 1-42 marcado com fluorescência nas células durante duas horas, lavamos as células e depois realizamos citometria de fluxo para investigar a extensão da captação celular de -amilóide. D-Tesa aumentou tanto a porcentagem de células que fagocitaram o -amilóide quanto a quantidade média de -amilóide internalizado por célula (Fig. 7A e B).

Em contraste, o Tesa livre não produziu melhorias na fagocitose da -amilóide. Os efeitos superiores do D-Tesa em comparação com o Tesa são provavelmente atribuíveis à melhor internalização celular possibilitada pela conjugação do dendrímero.

Isso é consistente com trabalhos anteriores que demonstraram que mais de 95% das células BV2 tratadas com G4-PAMAM-OH marcado com fluorescência internalizaram o dendrímero em trinta minutos e continuaram a internalizar o dendrímero por pelo menos 24 horas.76

Da mesma forma, a conjugação da minociclina de molécula pequena com G4-PAMAM-OH marcado com fluorescência demonstrou que 99% das células BV2 internalizaram o conjugado dendrímero-droga marcado com fluorescência dentro de 3 horas.26 Eles também mostraram que o conjugado reduziu os níveis de óxido nítrico superiormente. ao medicamento livre após tratamento de células BV2 com LPS, consistente com nossos resultados.

As células tratadas com D-Tesafagocitaram 1,9-vezes mais -amilóide do que as células de controle tratadas com LPS (p < 0.001), o que é comparável ao aumento de 2,5-vezes de fagocitose de -amilóide por células microgliais primárias de ratos tratadas com pioglitazona relatada por Yamanaka et al.73 A extensão ligeiramente maior de fagocitose de -amilóide pelo estudo anterior pode ser porque eles não trataram suas células com LPS como fizemos, ou porque a microglia primária expressa PPAR em um nível mais elevado do que as células BV2 utilizadas neste estudo.77

Como tal, uma dose de D-Tesa inferior à estimada a partir das experiências in vitro no nosso estudo pode provavelmente ser eficaz em estudos in vivo e em humanos, uma vez que se sabe que as células BV2 expressam PPAR em níveis mais baixos do que a microglia primária.77

A Microglia tem sido implicada em muitas doenças neurodegenerativas, e a BBB tem impedido que muitos medicamentos que podem modificar o fenótipo da microglia de um fenótipo M1 pró-inflamatório e neurotóxico para um fenótipo M2 neuroprotetor e antiinflamatório atingissem níveis terapêuticos no cérebro.5,6, 14,15

Por exemplo, dois agonistas do PPAR, pioglitazona e rosiglitazona, foram investigados através de ensaios clínicos de fase III para a doença de Alzheimer devido à sua capacidade de alterar o fenótipo da microglia, mas falharam provavelmente devido ao transporte deficiente através da BBB.13,14 Assim, há interesse clínico em alterar o fenótipo da microglia em doenças neurodegenerativas.

Tal abordagem requer a entrega do medicamento à microglia em níveis suficientes para conduzir uma resposta. Para esse fim, foi demonstrado que os dendrímeros G4-OH-PAMAM fornecem medicamentos à microglia em muitos modelos animais após injeção sistêmica e, como resultado, estão atualmente sendo avaliados em ensaios clínicos para o tratamento de ccTLD (NCT03500627) e casos graves de COVID -19 inflamação associada (NCT04458298).18–28

Para combinar os efeitos benéficos da alteração do fenótipo microglial com a capacidade de fornecer drogas à microglia, conjugamos tesaglitazar (um PPAR / agonista duplo) a um dendrímero G4-OH-PAMAM (Fig. 1–3). Demonstramos que o D-Tesa é capaz de alterar o fenótipo da microglia M1 em direção a um fenótipo M2 (Fig. 4 e 5), resultando em uma diminuição na secreção de espécies reativas de oxigênio prejudiciais.

Além disso, demonstramos que a microglia tratada com D-Tesa aumenta sua expressão de enzimas que degradam proteínas patológicas como -sinucleína e -amilóide, bem como regulam positivamente a fagocitose de -amilóide em um ensaio funcional (Fig. 6 e 7).

Embora não apresentemos dados que demonstrem a capacidade do D-Tesa de contornar a BHE e se acumular na microglia, mostramos anteriormente que conjugados de drogas G4-OH-PAMAM com carga de droga, tamanho e potencial zeta semelhantes são capazes de passar pela BBB prejudicada e acumulação na microglia após administração intravenosa.26,36,52

Esses resultados apoiam o desenvolvimento do D-Tesa para o tratamento de múltiplas doenças neurológicas. Embora neste artigo nos concentremos nas doenças de Alzheimer e Parkinson, o D-Tesa tem potencial para tradução clínica em vários distúrbios neurológicos. Devido ao papel semelhante da microglia na patologia de múltiplas doenças neurodegenerativas, o agonista do PPAR, pioglitazona, também foi investigado ou está atualmente sendo investigado em ensaios clínicos de fase II para doença de Parkinson,78 ELA,79 adrenomieloneuropatia (NCT03864523), esclerose múltipla (NCT03109288) e hematoma. resolução em hemorragia intracerebral (NCT00827892).

Se estes ensaios clínicos também falharem devido à má distribuição de pioglitazona através da BBB, a D-Tesa poderá superar este obstáculo de entrega e tratar pacientes com estas doenças.

Outros grupos utilizaram nanopartículas para melhorar a entrega de agonistas de PPAR aos macrófagos, mas não tentaram entregar esses agonistas à microglia. Osinski et al. demonstraram que os lipossomas carregados com Tesa foram principalmente absorvidos por macrófagos na gordura branca visceral em um modelo masculino de obesidade com deficiência de leptina.80

Eles demonstraram adicionalmente que os lipossomas carregados com Tesa não alteraram a expressão do marcador M1 Mcp-1, mas aumentaram a expressão do marcador M2 Arg1, enquanto o tratamento com Tesa livre diminuiu o número total de macrófagos M1 e a expressão de Mcp{{6 }}, e não aumentou a expressão de Arg1.

Nakashiro et al. usou nanopartículas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) para fornecer pioglitazona (um agonista do PPAR) a macrófagos no contexto da aterosclerose.81

In vivo, demonstraram que a PLGA-pioglitazona reduziu os níveis de células imunitárias no sangue. Em macrófagos primários derivados da medula óssea tratados com LPS e interferon-, eles descobriram que PLGA-pioglitazona aumentou IL-4 e IL-10 (marcadores M2) e não diminuiu os níveis de IL-6 ou TNF.

Suas descobertas são semelhantes às nossas; Os marcadores M2 aumentaram com o tratamento com agonista PPAR de nanopartículas, enquanto os níveis de IL-6e TNF- não diminuíram. Di Mascolo et al. usou nanopartículas de álcool polivinílico PLGA para fornecer rosiglitazona (outro agonista do PPAR).82

In vitro, eles demonstraram que seus complexos nanopartículas-medicamentos diminuíram a expressão de iNOS, TNF- e IL-1 em macrófagos derivados da medula óssea. Eles pré-trataram suas células com a droga de nanopartículas antes de estimular com LPS, enquanto nós pré-tratamos as células com LPS antes de tratar com D-Tesa, o que pode ser a razão pela qual não observamos uma diminuição em TNF- e IL-1, embora também tenhamos observado uma diminuição na expressão de iNOS.

Conclusão

Actualmente, não existe terapia que altere a patologia para muitas doenças neurodegenerativas e, à medida que a população continua a envelhecer, a prevalência e o custo do tratamento destas doenças continuarão a aumentar, realçando a necessidade urgente de desenvolver uma solução. Recentemente, a microglia M1 pró-inflamatória é crítica na patologia de múltiplas doenças neurodegenerativas.

Posteriormente, ser capaz de administrar um medicamento através da barreira hematoencefálica que pode induzir uma mudança do fenótipo 'M1 para M2' na microglia tem potencial terapêutico para múltiplas doenças, especialmente as doenças de Alzheimer e Parkinson.

D-Tesa foi projetado para fornecer uma droga indutora de 'M1 a M2' à microglia após administração sistêmica para reduzir a secreção microglial de substâncias neurotóxicas, ao mesmo tempo que induz um estado antiinflamatório que aumenta a degradação e a fagocitose de proteínas patogênicas no cérebro. Sintetizamos com sucesso o D-Tesa usando uma abordagem química de clique altamente eficiente.

A droga é ligada ao dendrímero através de uma ligação éster que é clivável intracelularmente em condições lisossomais, com aproximadamente 60% de Tesa sendo liberado nas primeiras 48 horas em condições lisossomais.

D-Tesa demonstrou ser superior ao Tesa in vitro na indução de uma mudança do fenótipo M1 para M2a/M2b/M2c, que resultou na redução da secreção de óxido nítrico, aumento da expressão de enzimas de degradação de -sinucleína e -amilóide e aumento da fagocitose de -amilóide.

Assim, o D-Tesa combina as propriedades benéficas de entrega do dendrímero, com as propriedades de comutação M1 para M2 do Tesa. Devido ao papel comum da microglia e ao benefício terapêutico comum de induzir uma mudança do fenótipo M1 para M2, o D-Tesa tem potencial para tratar muitos distúrbios neurológicos quando administrado no estágio certo da progressão da doença.

Contribuições do autor

LD, AS, KL, RS, SK e RMK conceituaram os experimentos. LD, AS e RS realizaram a síntese e caracterização do conjugado dendrímero-droga. LD, KL e JJ realizaram os experimentos celulares. LD e K. L. realizou as estatísticas. LD e AS escreveram o manuscrito e todos os autores editaram o manuscrito.

Conflitos de interesse

RMK e SK são co-inventores do uso do dendrímero terminado em hidroxila para entrega direcionada à microglia em doenças neurológicas, bem como patentes relacionadas à tecnologia de dendrímero descrita neste artigo.

Eles são cofundadores da Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. e RiniSight Inc., empresas que lideram o desenvolvimento clínico da plataforma. SK e RMK são membros do conselho da AshvatthaTherapeutics Inc. RS é atualmente funcionário da AshvatthaTherapeutics e possui ações da empresa; o trabalhoR. S. realizado para este trabalho foi feito antes de ele se juntar ao Ashvattha. O conflito de interesses é administrado pela Universidade JohnsHopkins.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Elizabeth Smith Khoury pelas discussões úteis sobre os experimentos in vitro. Este projeto foi financiado pelo Patz Distinguished Professorship Endowment da Johns Hopkins e NICHD (número de concessão HD076901) (RMK). Agradecemos ao Wilmer Core Grant for Vision Research, Microscope, and Core Module (número de concessão EY001865) pelo acesso ao citômetro de fluxo Sony.

Agradecemos à Servier Medical Arts pelo uso de sua coleção de imagens (http://smart.servier.com/) licenciada sob uma Creative Common Attribution 3.0 Licença Genérica, que foi modificada para tornar o resumo gráfico.

Referências

1 CL Gooch, E. Pracht e AR Borenstein, O fardo da doença neurológica nos Estados Unidos: Um relatório resumido e um apelo à ação, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf e K. Zhong, pipeline de desenvolvimento de medicamentos para a doença de Alzheimer: poucos candidatos, falhas frequentes, Alzheimer Res. Ter., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng e J.-S. Kang, História e progresso de hipóteses e ensaios clínicos para a doença de Alzheimer, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto e S. Pritzkow, Enovelamento incorreto de proteínas, agregação e cepas conformacionais em doenças neurodegenerativas, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry e C. Holmes, priming microglial em doenças neurodegenerativas, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang e W. Le, Papéis Diferenciais de M1 e M2Microglia em Doenças Neurodegenerativas, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181–1194.

7 MW Salter e B. Stevens, Microglia emergem como atores centrais nas doenças cerebrais, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann, et al., The TREM{1}}APOE Pathway Drives theTransscriptional Phenotype of Dysfuncional Microglia inNeurodegenerative Diseases, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao, et al., Os efeitos semelhantes aos antidepressivos da pioglitazona em um modelo de camundongo com estresse crônico leve estão associados à alteração mediada por PPAR dos fenótipos de ativação microglial, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, et al., Polarização de Microglia para o fenótipo M2 em um receptor ativado por proliferador de peroxissoma de maneira dependente de gama atenua lesão axonal induzida por lesão cerebral traumática em ratos, J. Neurotrauma, 2018, 35, 2330–2340.

11 W. Cai, et al., Receptor ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR): Um guardião mestre na lesão e reparo do SNC, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58,12 B. Brakedal, et al., Uso de glitazona associado à redução do risco da doença de Parkinson, Mov. Desordem., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com