O conjugado dendrímero-tesaglitazar induz uma mudança fenotípica da microglia e melhora a fagocitose -amilóide† Parte 2

Ensaios biológicos in vitro

Cultura celular. A linha celular microglial murina BV2 foi obtida do Children's Hospital of Michigan Cell Culture Facility.

Nos últimos anos, os cientistas descobriram que a cultura celular está intimamente relacionada à memória humana. Estudos têm demonstrado que através do estudo da cultura celular, os mecanismos moleculares no processo de memória e aprendizagem podem ser descobertos, melhorando assim a capacidade cognitiva e a memória humana.

A cultura celular refere-se ao processo de colocação de células biológicas em um meio de cultura contendo nutrientes essenciais para crescer e se reproduzir em condições in vitro. As células são as unidades básicas da vida, e a cultura celular fornece aos cientistas uma plataforma para estudar o comportamento celular e as atividades vitais. Através do estudo das células, os cientistas descobriram muitas informações sobre o crescimento dos neurônios e as conexões sinápticas. Essas descobertas podem não apenas ajudar os humanos a entender melhor como o cérebro funciona, mas também ajudar a desenvolver novos tratamentos e medicamentos.

Pesquisas nos últimos anos mostraram que a cultura celular também está intimamente relacionada à memória humana. Os cientistas descobriram que a formação e manutenção da memória humana requerem muita regulação molecular e entrega de sinais. Estes mecanismos de entrega e regulação de sinais têm muitas semelhanças com os mecanismos da cultura celular. Ao estudar os mecanismos de entrega e regulação de sinais na cultura celular, os cientistas podem compreender melhor a memória humana e os mecanismos de aprendizagem.

Além disso, alguns estudos também mostraram que a cultura celular pode melhorar a memória humana e a capacidade de aprendizagem de certas maneiras. Por exemplo, usando um método chamado "estimulação elétrica", a atividade das células e a conexão entre os neurônios podem ser estimuladas, melhorando assim a capacidade cognitiva humana e os efeitos de aprendizagem. Embora este método ainda esteja em fase de pesquisa laboratorial, espera-se que se torne um novo método de treinamento cognitivo no futuro.

Em resumo, existe uma estreita ligação entre a cultura celular e a memória humana. Através do estudo das células, podemos compreender melhor o mecanismo cognitivo humano e o mecanismo de memória e também ajudar a desenvolver novos métodos de tratamento e métodos de treinamento cognitivo. Esperemos ansiosamente pela contribuição da tecnologia de cultura celular para a humanidade no futuro! Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche tem efeitos antioxidantes, antiinflamatórios e antienvelhecimento, que podem ajudar a reduzir a oxidação e as reações inflamatórias no cérebro, protegendo assim a saúde do sistema nervoso. Além disso, Cistanche também pode promover o crescimento e a reparação das células nervosas, melhorando assim a conectividade e a função das redes neurais. Esses efeitos podem ajudar a melhorar a memória, a capacidade de aprendizagem e a velocidade de pensamento, e também podem prevenir a ocorrência de disfunções cognitivas e doenças neurodegenerativas.

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As células BV2 foram cultivadas em meio EaglesMedium Modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (HI FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37 graus e 5% de CO2.

Assim que as células atingiram a confluência no frasco de cultura, as células foram passadas para um novo frasco utilizando 00,05% de ácido tripsina-etilenodiamina tetra-acético (EDTA). Para as experiências, as células BV2 foram semeadas em DMEM com 5% de HIFBS e 1% de P/S. 24-48 horas depois, as células foram estimuladas com 100 ng.ml-1 (300 EU ml-1) de LPS por 3 horas para permitir que as células entrassem em um fenótipo pró-inflamatório (M1) para simular o ambiente neuroinflamatório presente em muitas doenças neurológicas.

As células foram então co-tratadas com LPS e Tesa livre ou D-Tesa em concentrações variadas durante 48 dias e depois o sobrenadante e as células foram recolhidos para processamento. Células nunca tratadas com LPS (Sem LPS) e células tratadas somente com LPS em todos os momentos (somente LPS) serviram como grupos de controle. As soluções estoque livres de Tesa e D-Tesa foram esterilizadas utilizando filtros de poli(éter sulfonas) 0,2 µm.

D-Tesa era solúvel no meio celular. Tesa foi solubilizado utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) em concentração final inferior a 0,1% (v/v). Citotoxicidade, ensaio de óxido nítrico e TNF-ELISA. Para o ensaio de citotoxicidade, as células foram tratadas conforme descrito acima em uma placa de poços e, em seguida, a citotoxicidade de Tesa e D-Tesa livres foi avaliada pelo ensaio MTT seguindo as instruções do fabricante.

Para o ensaio de óxido nítrico, as células foram tratadas conforme descrito acima em 12-placas de poços e, em seguida, os sobrenadantes das células tratadas foram coletados e imediatamente os níveis de óxido nítrico foram quantificados seguindo o protocolo do fabricante para o reagente de Griess.

Para o TNF-ELISA, as células foram tratadas conforme descrito acima em 12- placas de poços e, em seguida, os sobrenadantes das células tratadas foram coletados e armazenados a -80 graus até estarem prontos para processamento adicional.

Em seguida, as amostras foram descongeladas em gelo e o TNF-ELISA foi executado seguindo o protocolo do fabricante. Para esses estudos, tanto o D-Tesa quanto o Tesa livre foram sonicados e agitados em vórtex até que ambos estivessem completamente solúveis. Para solubilizar Tesa livre, ele foi primeiro solubilizado em DMSO antes de ser diluído, onde a concentração final de DMSO foi inferior a 0,1% (v/v) para todas as amostras livres de Tesa.

Como o D-Tesa era solúvel em meios de cultura celular, o DMSO não foi adicionado a essas amostras. Para todos os estudos in vitro, uma quantidade equivalente de medicamento livre ou conjugado foi aplicada às células dos grupos Tesa livre e D-Tesa.

PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). As células foram tratadas conforme descrito acima em placas de 12-poços e, após a coleta do sobrenadante, as células foram coletadas no Reagente Invitrogen™ TRIzol™ (da Fisher Scientific) e o RNA foi extraído seguindo o protocolo do fabricante. A concentração e a pureza do RNA resultante foram analisadas utilizando Nanodrop.

Quantidades equivalentes de RNA de cada amostra foram convertidas em cDNA seguindo o protocolo do fabricante para o kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (da Applied Biosystems da Thermo Fisher Scientific).

O cDNA resultante foi utilizado para análise qRT-PCR utilizando o reagente verde FAST-SYBR e seguindo o protocolo do fabricante. Os valores de Ct foram calculados pela máquina e os dados foram analisados ​​utilizando o método 2−ΔΔCt.

Para cada marcador diferente, o valor ΔΔCt foi calculado subtraindo o ΔCt para o grupo Sem LPS do ΔCt para cada amostra. O valor ΔCt foi o valor Ct para o gene de interesse menos o Ct para GAPDH para cada amostra dada.

Uma vez calculado o 2-ΔΔCt para todos os grupos, todos eles foram normalizados para o grupo Sem LPS, dando assim ao grupo Sem LPS um nível de expressão relativa de 1.0 para todos os marcadores. -PCR são mostrados na tabela abaixo. Todas as sequências são escritas de 5′→3′.

Além disso, primers comercialmente disponíveis foram adquiridos da BIORAD para iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670),TGF- 1 (qmmuCID0017320), IL-10 (qmmuCID0015452),SOCS1 (qmmucid0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1(qmmucid0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD86(qmmucid0006086), STAT6 (qmmucid000 6404) e PPAR (qmmucid0018821). Ensaio de fagocitose.

O impacto de Tesa e D-Tesa livres na fagocitose de -amilóide foi determinado usando um método relatado anteriormente.47 Resumidamente, a farinha HiLyte™ 488- marcada com -amilóide 1–42 (da Anaspec Inc.) foi dissolvida em DMSO (concentração final de DMSO abaixo de 0,5% (v/v)) e diluído para 5 µg ml-1 em PBS.

Depois de tratar as células com Tesa e D-Tesa com o esquema de tratamento descrito acima, a solução de -amilóide foi aplicada às células durante 2 horas. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com solução salina balanceada de Hank com cátions divalentes (cálcio e magnésio), removidas dos poços com tripsina e ressuspensas em tampão FACS (da Invitrogen).

As amostras foram armazenadas em gelo e imediatamente executadas em uma máquina de citometria de fluxo Sony Cell Sorter SH800, e os dados foram analisados ​​com o software associado.

A porta foi definida usando células não tratadas com amilóide fluorescente, e os resultados mostrados são a porcentagem de células de cada grupo que exibiram fluorescência acima da fluorescência de fundo.

A intensidade fluorescente média (MFA) do -amilóide marcado com 488-HiLyte™ também foi relatada para cada grupo. Este ensaio foi realizado em duplicata. Estatísticas. Todos os dados mostrados são o resultado de três experimentos separados, cada um realizado em triplicado, salvo indicação em contrário. GraphPad Prism 5 e Microsoft Excel foram usados ​​para realizar estatísticas.

Foram realizados testes t de Student pareados e bicaudais, com correção de Bonferroni. O teste de Grubbs foi utilizado para determinar outliers. GraphPad Prism 5 para Windows foi usado para plotar os dados (San Diego, CA). Os dados mostrados são a média + SEM.

Resultados e discussão

Síntese e caracterização de D-Tesa

Para permitir a entrega intracelular direcionada às células microgliais ativadas no cérebro, Tesa foi conjugado covalentemente na superfície de G4-PAMAM-OH com ligações éster cliváveis ​​entre a droga e o ligante dendrímero (Fig. 1).

Na primeira etapa, Tesa (1) reagiu com azida de tetrametilenoglicol (TEG-azida) (2) para produzir Tesa-TEG-azida (3), que possui uma ligação éster entre o fármaco e o ligante (Fig. 1A).

A HPLC do composto (3) apresentou um tempo de retenção de 13,4 minutos com pureza superior a 99% (Fig. S1B†). O espectro de massa de (3) mostrou um pico de 610,13 [M + 1]+ correspondente ao peso molecular de Tesa-TEG-azida, confirmando ainda mais a formação do produto (Fig. S2†). Separadamente, o dendrímero G4-PAMAM-OH (4) foi reagido com ácido 5-hexinóico usando uma reação de esterificação para produzir D-YNE (5) (Fig. 1B).

Por último, Tesa-TEG-azida (3) e D-YNE (5) reagiram pela reação de clique de cicloadição de cobre-catalisada-alcino (CuAAC) altamente eficiente para produzir D-Tesa (6) (Fig. 1B).48 O 1H RMN confirmou a síntese bem-sucedida de todos os intermediários e do produto final; D-Tesa (6) continha os picos característicos de prótons dendrímeros e ligantes de drogas, demonstrando a síntese bem-sucedida de D-Tesa (Fig. 2A).

A RMN do conjugado final de D-Tesa revelou que uma média de dez moléculas de Tesa estavam ligadas a cada dendrímero. A HPLC confirmou a conjugação covalente bem sucedida, uma vez que o D-Tesa exibiu uma mudança tanto do D-YNE como do TesaTEG-azida (Fig. 2B e S1 †).

Tesa tem baixa solubilidade aquosa, estimada em 0 0,0035 mg mL-1,49. A conjugação de Tesa com dendrímero hidroxila melhorou sua solubilidade em água em várias ordens de magnitude a partir desta estimativa. D-Tesa teve solubilidade em água a 22 mg mL-1, e como Tesa compreende ∼19% da massa de D-Tesa, 4,2 mg mL-1 equivalente de Tesa foram solubilizados (Fig. 3A).

A maior solubilidade proporcionada pelo dendrímero aumenta a facilidade de formulação e elimina a necessidade de excipientes potencialmente tóxicos.50 Esses benefícios são todos adicionais à capacidade superior do dendrímero de fornecer medicamentos livres através da BBB para a microglia in vivo e potencialmente reduzir o dose necessária para alcançar o efeito terapêutico.18–28 Por último, D-Tesa tinha um tamanho médio de 7,75 ± 0,29 nm (Fig. S3†) e um potencial zeta de 2,86 ± 0,38 mV (Medição N=5 e N=3, respectivamente).

Liberação de drogas

Projetamos D-Tesa para liberar Tesa intracelularmente dentro do ambiente de baixo pH e alta concentração de esterase em endossomos/lisossomos de microglia ativada. Relatamos anteriormente que os dendrímeros PAMAM entram principalmente nas células por meio de endocitose em fase fluida, e as vesículas que contêm os conjugados se transformam em lisossomos.51

Incubamos D-Tesa a 37 graus em tampão citrato de sódio (pH 5,5) na presença de esterases para imitar as condições dos lisossomos, como realizado anteriormente.52–54 Também investigamos a liberação sob condições que imitam as condições plasmáticas (solução salina tamponada com fosfato [PBS ] tampão, pH 7,4).

Sob condições plasmáticas, apenas cerca de 1,5% de Tesa é liberado após 48 horas e menos de 20% de Tesa é liberado no dia 25, sugerindo a estabilidade plasmática do conjugado (Fig. 3B).

Sob condições lisossômicas, cerca de 60% do Tesa é liberado do D-Tesa nas primeiras 48 horas e, em 19 dias, quase 100% do Tesa é liberado. Estes resultados demonstram que o D-Tesa proporciona uma libertação sustentada e desencadeada do fármaco livre durante as primeiras duas semanas incubadas sob condições lisossómicas fisiologicamente relevantes.

Além disso, a liberação mínima de Tesa nas condições plasmáticas simuladas (grupo pH 7,4) durante as primeiras 48 horas é significativa, uma vez que este é o tempo típico de circulação de G4-PAMAM-OH antes da depuração renal, então Tesa mínimo provavelmente será liberado do conjugados antes de atingirem a microglia.24

D-Tesa diminuiu a expressão de marcadores M1 e aumentou marcadores M2

Para avaliar a capacidade do D-Tesa de induzir uma mudança no fenótipo M1 para M2, avaliamos a capacidade do D-Tesa de alterar a expressão dos marcadores M1 e M2 in vitro usando uma linha celular microglial murina (BV2).

As células BV2 foram criadas pela imortalização de células microgliais murinas e demonstraram ser uma alternativa adequada às células primárias da microglia para estudar a resposta inflamatória microglial.55,56 Em nossos experimentos, para imitar o ambiente neuroinflamatório presente em múltiplas doenças neurológicas, pré-tratamos a microglia com 100 ng ml−1 (300 unidades de endotoxina (UE) por ml) de LPS por 3 horas.

Em seguida, co-tratamos as células com LPS e Tesa ou D-Tesa livre por 48 horas e, em seguida, coletamos as amostras. Tratamos as células em concentrações de 1,5, 15 e 150 µM de Tesa ou D-Tesa livre, numa base de medicamento equivalente.

O ensaio MTT demonstrou que o Tesaor D-Tesa livre nestas concentrações não causou citotoxicidade (Fig. S4†). Um estudo inicial de determinação da dose foi realizado com Tesa e D-Tesa para determinar a dose mais eficaz de Tesa e D-Tesa.

O tratamento com 1,5 e 15 µM de Tesa e D-Tesadid livres não alterou a secreção de óxido nítrico ou TNF-, conforme determinado pelo Reagente de Griess e TNF-ELISA, respectivamente (Fig. S5†). Com base nesses resultados, não analisamos essas concentrações mais baixas em nossos ensaios qRT-PCR.

Em muitas doenças neurodegenerativas, uma importante função neurotóxica da micróglia M1 pró-inflamatória é a secreção de espécies reativas de oxigênio (por exemplo, óxido nítrico) que matam diretamente os neurônios.57,58 Posteriormente, foi postulado que uma estratégia terapêutica potencial seria diminuir a secreção dessas moléculas.

Avaliamos a capacidade do D-Tesa de atingir esse efeito. Após a estimulação com LPS, D-Tesa diminuiu os níveis de mRNA de óxido nítrico secretado e de óxido nítrico sintase induzível (iNOS) em 3,7- vezes (p < 0 0,0001) e 2- vezes (p {{ 7}}.011), respectivamente, em comparação com células tratadas apenas com LPS (somente LPS) (Fig. 4A e B).

Por outro lado, Tesa livre diminuiu o óxido nítrico secretado mais moderadamente (1,4- vezes, p=0,004) e não levou a uma diminuição significativa na expressão de mRNA de iNOS (Fig. 4A e B ).

O D-Tesa foi muito mais eficaz do que o Tesain livre na supressão da secreção de óxido nítrico. Em seguida, dependendo se a microglia estiver em um fenótipo M1 ou M2, a microglia regula positivamente a iNOS ou a Arginase 1 (Arg1) para metabolizar a L-arginina para produzir óxido nítrico para sua resposta de eliminação de patógenos M1, orornitina e ureia para a resposta de cicatrização de feridas M2, respectivamente. 59

Consistente com sua regulação negativa de iNOS, D-Tesa aumentou os níveis de mRNA de Arg1 2- vezes (p=0 0,011) em comparação com o controle somente LPS, enquanto Tesa livre não aumentou a expressão significativamente (p=0 .40) (Fig. 4C).

O D-Tesa e, em menor extensão, o Tesa livre, mudaram a microglia da liberação de óxido nítrico citotóxico para o metabolismo da L-arginina para a cicatrização de feridas, o que tem implicações na redução e potencialmente na reversão da neurotoxicidade causada pela microglia na neurodegeneração.5–7,10

A regulação negativa dos níveis de iNOS e óxido nítrico secretado com o tratamento com D-Tesa é resultado de trabalhos anteriores que demonstraram que o ligante natural do PPAR (15-desoxi-Δ12,14-prostaglandina J2) diminuiu a expressão e secreção de iNOS e óxido nítrico em pacientes tratados com LPS microglia primária.60

IL-10, IL-4 e TGF- 1 são todas citocinas secretadas pela microglia M2 ativada alternativamente que pode induzir um ambiente neuroprotetor e antiinflamatório no cérebro.58,61,62Rumo a Para isso, D-Tesa aumentou a expressão de IL-105.5-dobra (p=0.011) e IL-4 8.2-dobra (p { {15}}.013) em comparação com o controle somente LPS (Fig. 4D e E).

O Tesa gratuito não aumentou significativamente os níveis de IL-10 ou IL-4, embora as médias tenham sido de 1,7- vezes (p=0,066) e 2,{{7} } vezes (p=0.11) maior, respectivamente, para microglia tratada com Tesa em comparação com controles somente LPS (Fig. 4D e E). Além disso, o D-Tesa aumentou a expressão de TGF - 1 2. 3- vezes (p=0 0,015) e o Tesa livre não alterou significativamente a expressão (Fig. 4F).

Assim, D-Tesa induz a secreção de citocinas antiinflamatórias após o tratamento da microglia com LPS, o que pode mitigar o ambiente neurotóxico e pró-inflamatório presente em doenças neurodegenerativas.5–7,10

Expressão induzida por D-Tesa de marcadores do subtipo M2-

CD206, Ccl1 e TLR8 são marcadores específicos para os subtipos de microglia M2a, M2b e M2c, respectivamente.58 D-Tesa regula positivamente a expressão CD206 4.{{10 }}dobrar (p < 0,001), Ccl1 3.5-dobrar (p < 0,005) e TLR8 5-dobrar (p < 0,01), enquanto Tesa livre não aumentou significativamente a expressão de qualquer um desses três marcadores (Fig. 5A-C).

Estes dados mostram que a microglia tratada com D-Tesa demonstra uma regulação positiva significativa dos marcadores de todos os três subtipos M2, o que concorda com o entendimento de que o fenótipo da microglia é plástico e não binário.63–65

A nomenclatura M1/M2 simplifica demais a complexidade que a microglia pode existir em um espectro de estados de ativação; ao longo deste continuum, três fenótipos M2 distintos (M2a, M2b e M2c) foram caracterizados, e D-Tesa induz a expressão de marcadores consistentes com cada um desses estados.58,61,63,66,67 A microglia M2a está envolvida no aumento da fagocitose de patógenos proteínas regulando positivamente os receptores de eliminação, reparação de tecidos e ações anti-inflamatórias.

A microglia M2b é como a microglia M1 porque expressa IL-1, TNF- e IL-6; no entanto, M2b são distintos da microglia M1 porque expressam IL-10 em níveis elevados e regulam negativamente a expressão de iNOS. Os macrófagos e a micróglia M2b estimulam as células T Th2, o que é indicativo de um dos papéis do M2b na indução de uma resposta anti-inflamatória.

A microglia M2c está envolvida na cicatrização de feridas, remodelação de tecidos, sequestro de ferro e ativação de STAT3 que reduz a sinalização pró-inflamatória.58,61,63,66 A atividade PPAR de Tesa estimula um loop feedforward que resulta no aumento da expressão de PPAR e sua proteína de sinalização a montante (STAT6), que são ambos marcadores M2a.58D-Tesa aumentou a expressão de PPAR 2.3-dobra (p=0.0036)e STAT6 3.4- dobrar (p <0,001), enquanto Tesa livre aumentouSTAT6 1.8-dobra (p=0.011) sem um aumento significativo na expressão PPAR (aumento de 1,58-vezes, p=0.17) (Fig. 5D e E).

O aumento da expressão de STAT6 e PPAR resulta na produção de genes antiinflamatórios e na inibição de sinais pró-inflamatórios pela inibição da atividade do NF-κB. Como a microglia M2a pode ser induzida pelo tratamento da microglia com IL-4, que sinaliza através de STAT6 e PPAR, a regulação positiva dessas duas proteínas de sinalização a jusante pode resultar na polarização feedforward de M2a.68

Em nossos ensaios, a ativação de LPS aumentou os níveis de IL-6, TNF- e IL-1, e o tratamento com D-Tesa regulou ainda mais a expressão dessas citocinas (Fig. S6A-D†), o que é provavelmente devido ao D-Tesa induzindo o fenótipo M2b (Fig. 5B).

O Tesa Livre aumentou a expressão de IL -6 e não alterou significativamente a expressão de TNF e IL -1 (Fig. S6A-D†). Embora essas citocinas sejam secretadas pela microglia M1, a microglia M2b também expressa essas citocinas.58,61 CD86 é um marcador da microglia M1 e M2b e é aumentado com o tratamento com D-Tesa (Fig. S6E†).

Além disso, o supressor de sinalização de citocinas (SOCS) é uma família de proteínas intracelulares que regulam a polarização fenotípica da microglia suprimindo múltiplas vias de sinalização ativadas por citocinas.69 SOCS1 é um membro desta família e demonstrou inibir LPS/TLR4 mediada a sinalização de NF-κB e JAK2, reduzindo assim a quantidade de TNF-, IL-1 e IL-6 liberada pela microglia M1 através da via LPS/TLR4.

D-Tesa regula positivamente a expressão de SOCS1 em comparação com o controle somente LPS (Fig. S6F†), sugerindo que o aumento de IL-6, TNF- e IL-1 exibido por D-Tesa pode ser devido à indução do Fenótipo M2b e não através do aprimoramento do fenótipo indutor de LPS/TLR4, M1-.

Além disso, os LPS sinalizam através do TLR4 e para evitar a ativação celular excessiva, a microglia possui um mecanismo de feedback negativo pelo qual a ativação do TLR4 leva à diminuição da expressão do TLR4.70

O tratamento com Tesa e D-Tesa gratuitos aumentou os níveis de TLR4 3,6-vezes (p < 0.001) e 3,7-vezes (p < 0,001), respectivamente (Fig. 5F), sugerindo que Tesa e D-Tesa alteraram a típica via de sinalização de feedback negativo LPS / TRL4.

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