O efeito protetor do echinacoside na nefropatia diabética

Contato: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Efeitos protetores do equinacosídeo na função renal, tecido renal e lesão de células mesangiais em ratos com nefropatia diabética

HE Qin, LIU Fan, WANG Hongli, LI Jianping, DUAN Jun

Abstrato:

Objetivo Explorar o efeito protetor deechinacoside(ECH) sobre disfunção renal, histopatologia e lesão de células mesangiais emdiabéticonefropatia(DN) ratos e seu mecanismo. Métodos Sessenta ratos SD foram divididos aleatoriamente em grupo controle, grupo modelo, ECH (echinacoside) grupo (ECH de altas, médias e baixas doses (echinacoside),100,50, 20 mg·kg'·d') e grupo losartana potássica (losartana potássica, 16 mg·kg'·d'), 10 ratos em cada grupo. O grupo modelo, ECH (echinacoside) e o grupo losartana potássica foram alimentados com uma dieta rica em gordura e açúcar, e estreptozotocina injetada intraperitonealmente (40 mg·kg"') para estabelecer modelos de ratos DN. Após 2 semanas de tratamento, peso corporal, ingestão de água 24h , e o volume de urina de ratos foram registrados. O conteúdo de glicemia de jejum, creatinina sérica, nitrogênio ureico, microproteína urinária, ácido hialurônico (HA), inibidor de metaloproteinase tecidual-1(TIMP-1) e laminina (LN) foram determinados. A coloração HE e a coloração TUNEL foram realizadas para observar alterações patológicas no tecido renal. A RT-PCR foi realizada para detectar a expressão de linfoma de células B (Bcl-2), Bcl2-associado Proteína X(Bax), Caspase-3 mRNA. Wester Blot foi realizado para determinar os níveis de expressão da molécula de adesão celular vascular-1(VCAM-1), fator de crescimento transformador (TGF- ), - Actina do músculo liso (-SMA). Resultados Comparado com o grupo controle, o peso corporal do grupo modelo foi significativamente diminuído (P< 0.05),="" water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly="" increased=""><0.05). bax,="" caspase-3="" mrna,="" and="" expression="" of="" vcam-1,="" tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05),="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="">< 0.05).="" compared="" with="" the="" model="" group,="" bodyweight="" of="" rats="" was="" significantly="" increased="" in="" the="" medium-dose="" ech="">echinacoside), grupo ECH de alta dose (echinacoside) e grupo losartana potássica (P<0.05), water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly=""><0.05).bax,caspase-3 mrna,="" expression="" of="" vcam-1,tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05);="" and="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly=""><0.05).he and="" tunel="" staining="" showed="" that="" pathological="" changes="" in="" renal="" tissue="" were="" significantly="" decreased.="" conclusion="" medium="" and="" high="" doses="" of="" ech="">echinacoside) pode proteger o dano do tecido renal e melhorar a função renal em ratos DN inibindo a expressão proteica de TGF- e VCAM-1 e inibindo a fibrose intersticial renal e a apoptose das células renais.

Palavras-chave:Cistanches de ervas;Echinacoside; diabéticonefropatia; fibrose intersticial renal; apoptose; ratos

Cistanche echinacoside tratar nefropatia diabética

Introdução

Diabético nefropatia(nefropatia diabética, DN) é umadiabéticocomplicação microvascular, que pode não só causar danos nos rins, mas também afetar outros órgãos. A característica clínica patológica da fibrose tubulointersticial renal é a complicada patogênese dadiabéticonefropatia. Estudos anteriores [P2-5 acreditam que a doença se deve principalmente à hiperglicemia emdiabéticopacientes, o que causa alterações hemodinâmicas renais e metabolismo anormal. As manifestações clínicas são principalmente proteinúria e diminuição da taxa de filtração glomerular. Atualmente,diabéticonefropatiaOs pacientes ainda carecem de métodos de tratamento clínico eficazes, e encontrar novos medicamentos eficazes é a chave para o tratamento da doença.diabéticonefropatia.

echinacoside(ECH) é um dos extratos de Cistanche Tubulosa. Tem o efeito de revigorar o rim e fortalecer o yang." Estudos farmacológicos modernos mostraram que o echinacoside tem antioxidante, anti-apoptótico, anti-inflamatório e melhora o fluxo sanguíneo A microcirculação e outros efeitos farmacológicos também podem regular o metabolismo da glicose do corpo e melhorar a glicose Nos últimos anos, estudos mostraram que o echinacoside pode inibir a via de sinalização do fator de crescimento de transformação (Transforming growth factor, TGF- ) e inibirdiabéticonefropatia. A fibrose intersticial dos rins de ratos protege o tecido renal de ratos. No entanto, existem poucos relatos na literatura sobre o tratamento dediabéticonefropatiacomechinacoside, e seu mecanismo específico de proteçãodiabéticonefropatiaem ratos não é clara. Portanto, este estudo explorou ainda mais o efeito daechinacosidesobre fibrose renal e apoptose de células renais emdiabéticonefropatiaratos e seu possível mecanismo destina-se a fornecer uma base teórica para a aplicação clínica deechinacoside.

Benefício do cistanche: trata a doença renal e melhora a função renal

1 Material e métodos

1.1 Animais:

60 ratos SD, machos, grau SPF, 8 semanas de idade, peso corporal 240~280 g, fornecidos por Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd., número de licença animal: SCXK (Pequim) 2015-0001, qualidade animal é qualificado Número do certificado: 11400700106210, criado no laboratório do centro de animais do hospital, mantendo a temperatura ambiente constante em 25 graus, simulando o dia e a noite, alterando as condições de iluminação uma vez a cada 12 horas, e os animais ficam livres para comer e beber .

1.2 Medicamentos e reagentes:

Echinacoside, Instituto de Controle de Alimentos e Medicamentos da China, número do lote: 111670-201706; Potássio de Losartan, Hangzhou Merck Pharmaceutical Co., Ltd., Padrão Nacional de Medicina: H20030654; Estreptozotocina, American Sigma Company, número do lote: 040103; Kit de detecção de conteúdo de proteína na urina, Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd., número do lote: 20170612; Kit de detecção TUNEL, Amicage Technology Co., Ltd., número do lote: 20180406; Kit de extração de RNA, kit de transcrição reversa, Shanghai Hengfei Bio-Technology Co., Ltd., número do lote: 20180705, 20180904; Ácido hialurônico sérico (HA), inibidor de metaloproteinase tecidual-1 (TIMP-1) e kits de detecção de laminina (laminina, LN), Shanghai Yuanmu Biotechnology Co., Ltd., os números de lote são 20180612, 20180624, 20180706.

1.3 Aparelho

analisador bioquímico automático tipo 7600, empresa japonesa HITACHI; medidor portátil de glicose no sangue, Beijing Yicheng Bioelectronics Technology Co., Ltd.; B X60 microscópio óptico, empresa Japão OLYMPUS; SN-695Analisador de radioimunoensaio B, empresa Shanghai Rihuan Instrument Shenbei Co., Ltd.

1.4 Agrupamento, replicação de modelo e método de administração

Após uma semana de pré-alimentação, 60 ratos foram divididos aleatoriamente em grupo controle, grupo modelo, grupoechinacosidegrupos de alta, média e baixa dose e o grupo Losartana potássica, com 10 ratos em cada grupo. O grupo modelo,echinacosidee o grupo losartana potássica foram tratados com dieta rica em gordura e açúcar combinada com estreptozotocina em baixa dose para induzirdiabéticonefropatiaem ratos. Antes da replicação do modelo, os ratos jejuaram com água por 12 h. Os ratos do grupo controle foram alimentados com ração comum e os demais grupos foram alimentados com ração com alto teor de gordura e açúcar. Após 4 semanas de alimentação contínua, os ratos do grupo controle receberam uma única injeção intraperitoneal de igual volume de tampão citrato, e os grupos restantes receberam uma única injeção intraperitoneal de estreptozotocina Bacteriocina (40 mg·kg') para replicar o modelo de rato dediabéticonefropatia. 72 horas após os ratos terem sido injetados com estreptozotocina, a glicemia foi maior ou igual a 16,7mmol·L, e a taxa de excreção de proteína na urina de 24 horas após 3 semanas foi maior que a do grupo controle. A proteína quantitativa da urina de 24 horas foi superior a 50 por cento antes da replicação do modelo, indicando que o modelo foi replicado com sucesso. Quatro semanas após a injeção de estreptozotocina, os grupos de dose baixa, média e alta deechinacosidereceberam 20 mg·kg', 50 mg·kg e 100 mg·kg'echinacoside(de acordo com 5mL·kg em ratos). kg"' de peso corporal é dissolvido em 37 graus de solução salina normal), ratos do grupo Losartana potássica são administrados por via intragástrica com Losartana potássica 16mg·kg', e o grupo modelo e o grupo controle são administrados por via intragástrica com volumes iguais de solução salina normal, uma vez ao dia A gavagem foi continuada por 2 semanas.

1.5 Coleta de espécimes

Após a última administração, os ratos jejuaram sem comida e água. As 24 horas de ingestão de água dos ratos foram registradas e as 24 horas de urina foram coletadas. No início da manhã do segundo dia, os ratos foram pesados. Após a coleta de urina, injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital sódico a 2% 2mL·kg~ para anestesia, separação do sangue da aorta abdominal de rato, centrifugação (3 500 r·min²', 15 min), retirar o soro e colocar no geladeira- Armazenar temporariamente a 20 graus; separe o tecido do rim de rato e divida em duas partes, uma parte é fixada em 4% de paraformaldeído, a outra parte é preparada como 10% de homogeneizado e colocada em geladeira de grau -80 para uso posterior.

1.6 Determinação do metabolismo de glicose e lipídios em ratos

O soro de cada grupo de ratos foi coletado, a glicemia de jejum foi medida com um medidor de glicemia e os níveis de triglicerídeos, colesterol e lipoproteínas de baixa densidade foram detectados por um analisador bioquímico automático.

1.7 24 h proteína na urina, função renal e indicadores relacionados à fibrose renal

A 24-hora de urina dos ratos em cada grupo foi coletada, e o 24-conteúdo de microproteínas da urina da hora foi determinado por radioimunoensaio. A operação foi realizada em estrita conformidade com as instruções. O soro de cada grupo de ratos foi coletado, e o analisador bioquímico automático foi usado para detectar os níveis de creatinina no sangue e nitrogênio ureico, que estão relacionados com a função renal, o nível de soro TIMP-1 foi detectado por ELISA, e os níveis de HA e LN foram detectados por radioimunoensaio. A operação foi realizada em estrita conformidade com as instruções.

1.8 Coloração HE para observar as alterações patológicas do tecido renal e coloração TNUEL para observar a apoptose das células do tecido renal

Os tecidos renais fixados de cada grupo foram retirados, rotineiramente incluídos em parafina e seccionados. Uma seção é usada para coloração HE para observar as alterações morfológicas dos túbulos renais, glomérulos e interstício renal sob um microscópio de luz; a outra seção é usada para coloração TUNEL, operando de acordo com as instruções do kit e observando o número e a positividade das células do tecido renal ao microscópio O número de células é calculado como a razão entre o número de células positivas e o número de tecido renal células, que é a taxa de apoptose.

1.9 Método RT-PCR para detectar a expressão de genes relacionados à apoptose em tecidos renais

Pegue o homogenato de tecido renal de rato, extraia o RNA total pelo método Trizol, determine a concentração por espectrofotômetro ultravioleta e sintetize o cDNA com o kit de transcrição reversa.

1.10 Método Western Blot para determinar a expressão do tecido renal VCAM-1, proteína TGF- e -SMA.

Tome cerca de 50 mg de homogenato de tecido renal de rato, dissolva-o com lisado celular contendo inibidores de protease e extraia a proteína total com lisado celular, usando o método BCA para quantificação de proteínas. A amostra de proteína total extraída por 50 μmol·L" foi transferida para uma membrana de nitrocelulose por eletroforese em gel de poliacrilamida e selada com 5 por cento de leite desnatado, e o anticorpo primário (1∶1000) e proteína -actina foram adicionados, respectivamente. Anticorpo (1: 300), incubar durante a noite a 4 graus. Finalmente, adicione o anticorpo secundário e incubar por 2h a 37 graus, monitorado por eletroquimioluminescência. Use o software de análise de imagem Photoshop para analisar o valor de cinza das bandas de proteína.

1.11 Métodos de processamento estatístico

O software SPSS 17.0 foi usado para analisar os dados obtidos, e os dados de medição que satisfazem a distribuição normal são expressos como média ± desvio padrão ((x±s), e a análise de variância de fator único é usada para comparar as diferenças entre os grupos. A comparação entre os grupos usa SNK- Com teste q, P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

2 Resultados

2.1 Os efeitos do echinacoside na massa corporal, água potável e produção de urina de ratos com nefropatia diabética são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1 Efeitos da ECH no peso corporal, ingestão de água e volume de urina em ratos DN（x ± s,n=10）

Em comparação com o grupo de controle, o peso corporal dos ratos do grupo modelo foi significativamente reduzido, e a 24-hora de água potável e a produção de urina aumentaram significativamente. A diferença foi estatisticamente significativa (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" doses="" of="">echinacosideO peso corporal dos ratos do grupo Losartana potássica aumentou significativamente, e as 24-horas de consumo e a produção de urina diminuíram significativamente, e a diferença foi estatisticamente significativa (P<>

2.2 Os efeitos do echinacoside no metabolismo da glicose e lipídios em ratos com nefropatia diabética são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2 Efeitos da ECH no metabolismo da glicose e lipídios em ratos DN

Observação:Comparado com o grupo controle,' P<0.05; compared="" with="" the="" model="" group,=""><>

Comparado com o grupo controle, a glicemia de jejum dos ratos do grupo modelo foi significativamente aumentada, e a diferença foi estatisticamente significativa (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" increased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05) ). Em comparação com o grupo modelo, a glicemia de jejum de ratos nos grupos de dose média e alta deechinacosidee o grupo losartana potássica foi significativamente reduzido, e a diferença foi estatisticamente significante (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" decreased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05).

2.3 Os efeitos do echinacoside na proteína da urina de 24-hora e na função renal de ratos com nefropatia diabética são mostrados na Tabela 3.

Comparado com o grupo controle, os níveis de microalbumina na urina, nitrogênio ureico e creatinina do grupo modelo foram significativamente aumentados, e as diferenças foram estatisticamente significativas (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" dose="">echinacosidegrupos Os níveis de microalbumina urinária, nitrogênio ureico e creatinina de ratos no grupo e losartana potássica foram significativamente reduzidos, e as diferenças foram estatisticamente significativas (P<>

Tabela 3 Efeitos do echinacoside na proteína da urina de 24h e na função renal de ratos com nefropatia diabética (x±s, n=10)

2.4 Os efeitos do echinacoside na fibrose renal em ratos com nefropatia diabética são mostrados na Tabela 4.

Em comparação com o grupo controle, os níveis séricos de HA, TIMP-1 e LN no grupo modelo aumentaram significativamente e as diferenças foram estatisticamente significativas (P<0.05); the="" levels="" of="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" of="" rats="" in="" the="" sartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" reduced,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

Tabela 4 Efeitos da ECH na fibrose renal em ratos DN

2.5 Coloração HE para observar as alterações patológicas do tecido renal em ratos com nefropatia diabética (ver Figura 1).

A coloração HE de ratos no grupo controle mostrou que a estrutura das células do tecido renal estava intacta e não foram observadas alterações patológicas óbvias. A coloração HE de ratos no grupo modelo e a coloração de baixa doseechinacosideO grupo mostrou: glomérulo inchado e aumentado de tamanho, células epiteliais tubulares renais incharam ou caíram, interstício renal foi acompanhado por infiltração de células inflamatórias e alguma hiperplasia mesangial e proliferação intersticial também foram visíveis. Fibrose qualitativa.Echinacosidegrupos de dose média e alta e grupos de losartana potássica. A coloração mostrou que as alterações patológicas do tecido renal foram significativamente reduzidas, acompanhadas por uma pequena quantidade de infiltração de células inflamatórias, e o grau de hiperplasia mesangial e fibrose intersticial também foi mais leve que o do grupo modelo.

Figura 1 Alterações patológicas dos tecidos renais de ratos em cada grupo

2.6 O efeito do echinacoside na apoptose do tecido renal em ratos com nefropatia diabética é mostrado na Figura 2.

A coloração de TUNEL mostrou que, em comparação com o grupo controle, a taxa de apoptose de ratos no grupo modelo foi significativamente aumentada, e a diferença foi estatisticamente significativa (P＜0.05); comparado com o grupo modelo, as doses médias e altas deechinacosidee Corsa A taxa de apoptose dos ratos do grupo potássio foi significativamente reduzida, e a diferença foi estatisticamente significativa (P<>

Figura 2 Apoptose de células do tecido renal em ratos DN

2.7 O efeito do echinacoside na expressão de genes relacionados à apoptose em tecidos renais de ratos com nefropatia diabética é mostrado na Tabela 6.

Os resultados de RT-PCR mostraram que, em comparação com o grupo controle, a expressão de Bax e Caspase-3 mRNA no grupo modelo foi significativamente regulada para cima, e a expressão de Bcl-2 mRNA foi significativamente regulada para baixo , e a diferença foi estatisticamente significativa (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group="" in="" comparison,="" the="" expression="" of="" bax="" and="" caspase-3="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="" in="" the="" middle="" and="" high-dose="">echinacosidegrupos e o grupo Losartan potássio, e a expressão de Bcl-2 mRNA foi significativamente regulada positivamente, e as diferenças foram estatisticamente significativas (P<>

Tabela 6 Efeitos da ECH na expressão do gene relacionado à apoptose no tecido renal de ratos DN

2.8 Os efeitos deechinacosidena expressão de proteínas VCAM-1, TGF- e -SMA emdiabéticonefropatiaos ratos são mostrados na Figura 3 e na Tabela 7. Em comparação com o grupo controle, a expressão da proteína VCAM-1, TGF- e -SMA no grupo modelo foi significativamente regulada positivamente, e a diferença foi estatisticamente significativa (P ＜0.05); As expressões das proteínas VCAM-1, TGF- e -SMA em ratos no grupo de dose e no grupo de losartana potássica foram significativamente reguladas negativamente, e as diferenças foram estatisticamente significativas (P<>

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