Análise da composição e atividades imunológicas dos oligossacarídeos isolados de Cistanche Deserticola

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Abstrato.Um oligossacarídeo (CDOS) foi obtido a partir deCistanche deserticolapor extração alcalina (pH{{0}}), precipitação com etanol e fracionado em duas frações purificadas (ou seja, CDOS-1 e CDOS-2) por Sephadex G-100 e cromatografia de filtração em coluna Sephadex G-25. A composição de monossacarídeos do CDOS foi testada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Verificou-se que o CDOS-1 era composto apenas de sacarose e o CDOS-2 era composto principalmente de sacarose, ramnose e manitol, com uma razão molar de 1:0,73:3,61. Testes imunológicos indicaram que o CDOS apresentou efeito significativo no índice esplênico de camundongos, aumentando a atividade fagocitária dos macrófagos e estimulando a proliferação celular produtora de anticorpos. Espera-se que o CDOS seja desenvolvido em alimentos funcionais ou medicamentos.

Palavras-chave:Cistanchedeserticola, oligossacarídeo, purificação, composição, atividades imunológicas.

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1. Introdução

Cistanchedeserticola YCMa. (Família Orobanchaceae) é uma pequena planta parasita nativa do noroeste da China. A planta seca inteira (sem flores) é conhecida como tônica e é chamada de "Rou Congrong". função derevigorantearime complementando a essência, hidratando o intestino e relaxando os intestinos [1]-[3]. O estudo farmacológico moderno mostrou que poderia estimular a síntese de DNA e retardar o processo de senilidade, aumentar o antioxidante [4] , prevenir e tratar doenças cardiovasculares [3]. Além disso, também pode causar efeitos analgésicos eanti-inflamatórioefeitos [5], melhoram a aprendizagem e a memória induzindo fatores de crescimento do nervo [6]. Alguns estudos indicaram que extratos de C. deserticola podem ativar a função fagocítica de macrófagos intra-abdominais em camundongos [7]-[9] emelhorar ocorpo's imunidade[10]. De acordo com os estudos anteriores, esta planta contém vários constituintes ativos que incluem glicosídeos feniletanoides, iridóides, lignanas, sacarídeos, alcalóides, etc. [11] Como o C.deserticolafeniletanoideglicosídeose polissacarídeos são reconhecidos como os principais componentes ativos, numerosos estudos focaram em suas estruturas e bioatividades durante as últimas décadas [12]-[17]. Quanto aos valiosos oligossacarídeos emC. deserticola, os relatórios são bastante limitados. Os oligossacarídeos, um sacarídeo de cadeia curta contendo homo ou hetero-açúcares, são bem conhecidos por seus efeitos benéficos na vida humana e têm sido amplamente utilizados por um longo tempo [18]. Os oligossacarídeos funcionais, que possuem uma função fisiológica como baixa carogenicidade e fator de crescimento de bifidobactérias [19], melhoram a saúde de humanos e animais. Eles têm sido utilizados como um ingrediente alimentar. Recentemente, novas funções de oligossacarídeos, que têm a capacidade de modular o sistema imunológico em humanos, animais e peixes, foram relatadas [20]. Neste artigo, relatamos a primeira parte dos resultados do programa de pesquisa, o fracionamento dos oligossacarídeos totais obtidos do extrato alcalino de C. deserticola por uma combinação de ultrafiltração e cromatografia de permeação em gel, e a análise da composição dos mesmos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Além disso, também apresentamos as atividades imunológicas dos oligossacarídeos de C. deserticola. Até onde sabemos, existem poucos relatos publicados sobre os estudos da atividade imunoestimuladora deC. deserticolaoligossacarídeos.

2. Experimental

2.1. Materiais

A C. deserticola foi cultivada e coletada na Alxa League (Mongólia Interior, China). Camundongos Kunming (GradeII, seis semanas de idade) foram adquiridos do Centro Experimental de Farmacologia da Universidade da Mongólia Interior. Sephadex G-100,Sephadex G-25, ácido trifluoroacético (TFA), 1-fenil-3-metil-5- pirazolona(PMP), D-glicose, D- galactose, D-frutose, D-xilose, D-manose, ácido D-galacturônico, ácido D-glucurônico, sacarose, ramnose, manitol, fucose, ramnose, foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, EUA). O RPMI médio-1640 foi adquirido da Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, EUA). Todos os outros produtos químicos eram de grau analítico.

2.2. Extração de oligossacarídeos

Os corpos secos de C. deserticola foram cortados em pedaços menores e posteriormente moídos em pó por um moinho foram extraídos com etanol anidro (3 x 5000 ml) a 70 graus por 3 h sob pressão atmosférica. Um condensador de refluxo foi fixado para remover os lipídios. O resíduo restante foi então extraído com álcali (pH=10) a 60 graus por 3 vezes (2h de cada vez). Após centrifugação (2000 g por 15 min, a 20 graus), o sobrenadante foi concentrado a um décimo do volume em um evaporador rotativo sob pressão reduzida a 50 graus e filtrado. Em seguida, o filtrado foi desproteinizado usando o reagente Sevag [21] e descolorido com carvão ativado.

2.3. Isolamento e purificação de oligossacarídeos

Os oligossacarídeos brutos liofilizados foram dissolvidos em água destilada, centrifugados e, em seguida, o sobrenadante foi purificado por uma coluna Sephadex G-100 (1×50 cm), equilibrada com água ultrapura. Após o carregamento com a amostra, a coluna foi eluída com água ultrapura a uma taxa de fluxo de 5 ml/min. Diferentes frações foram coletadas usando tubos de ensaio. O conteúdo total de carboidratos de cada tubo foi medido a 490nm pelo método fenol-H2SO4 [22]. A solução eluída em água foi separada em duas frações CDOS-1 e CDOs-2. Duas frações foram respectivamente purificadas adicionalmente em uma coluna Sephadex G-25 (2,7×85 cm) usando água ultrapura (a uma taxa de fluxo de 1 ml/min). Após coletar a fração purificada, ela foi liofilizada.

2.4. Análise da composição de monossacarídeos

A composição de monossacarídeos dos CDOs foi obtida por análise de HPLC. Os CDOs (2 mg) foram hidrolisados ​​primeiro com metanol anidro contendo HCl 2 M a 8{18}} graus por 16 h sob atmosfera de nitrogênio e depois com TFA 2 M a 120 graus por 1 h. Após a remoção do TFA por evaporação, os hidrolisados ​​foram subsequentemente derivados com PMP de acordo com o método relatado [23] e analisados ​​por HPLC. A separação por HPLC foi realizada no sistema EF-2002 HPLC (empresa KNAUER, Alemanha). Os derivados de PMP foram cromatografados usando volume Sugar-PAK (6,5×300mm, glass of water company, America), e a absorbância foi medida em 245 nm. O volume de injeção foi de 20µL, e a fase móvel, composta por PBS (solvente A) e acetonitrila (solvente B), foi utilizada para eluição isocrática na razão de volume de 82 por cento (A) a 18 por cento (B). O tempo total de execução de HPLC foi de 40 min e a taxa de fluxo foi de 0,5 mL/min.

2.5. Atividades imunobiológicas

2.5.1. Função fagocítica do monócito-macrófago

Sessenta camundongos Kunming (Grade II, seis semanas de idade) foram adquiridos do Centro Experimental de Farmacologia da Universidade da Mongólia Interior e foram aclimatados por 1 semana antes do uso. Todos os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos, consistindo de um grupo de controle de solução salina, grupo de alta dosagem de CDOs, grupo de dosagem moderada e grupo de dosagem baixa de CDOs. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 0,5mL de solução de oligossacarídeos uma vez por dia durante 5 dias. O grupo de dosagem de CDOs alta, moderada ou baixa recebeu 10{{10}}, 50 ou 25 mg/kg/BW CDOs, respectivamente; e 0,5ml de soro fisiológico foi injetado no grupo controle. No sétimo dia foi realizado um experimento de depuração de partículas de carbono, de acordo com Hou [24], e foram medidos o índice do baço e o índice do timo. Resumidamente, 0,05 mL/10 g/pc de nanquim foi injetado em cada camundongo através da veia caudal, então 20μL de sangue foi obtido da veia orbital posterior 3 e 7 minutos após a injeção. As amostras de sangue foram colocadas em tubos com 2mL de Na2CO3 a 0,1 por cento e os valores de DO foram medidos a 600 nm. O índice de depuração (K), o índice fagocítico ( ) e o índice de órgãos imunes foram calculados da seguinte forma(1), t2 e t1 significam 7 minutos e 3 minutos, respectivamente.

2.5.2. A proliferação de células produtoras de anticorpos

Grupos de camundongos Kunming (cinco por grupo) foram imunizados por injeção intraperitoneal de 2 x 107 SRBC em 1,0 ml de PBS adicionado com 50 ug de materiais de teste (nenhum no controle). Uma semana depois, esplenócitos (106 células por 2 ml por poço) de camundongos Kunming foram cultivados com ou sem materiais de teste por 72 h em meio RPMI 1640 a 10 por cento sob 5 por cento de CO2 no ar, em triplicata para cada cultura. O número de PFC contra SRBC por 106 esplenócitos foi determinado [25], [26].

2.6. Análise estatística

Os dados foram expressos como valores médios ± DP. A diferença entre os grupos testados e controle foi analisada pelo teste t de Student. P <0.05 foi="" considerado="">

3 Resultados e discussão

3.1. Isolamento e purificação de oligossacarídeos

CDOs foram isolados do extrato alcalino dos corpos secos de C. deserticola por um rendimento de 3,07 por cento. Duas frações de CDOS-1 e CDOS-2 foram isoladas de água destilada eluída pela coluna Sephadex G-100, respectivamente (Fig.1). As frações purificadas de CDOS-1 e CDOS-2 apresentaram um único pico na coluna Sephadex G-25, indicando que nenhum outro oligossacarídeo estava presente na amostra. Os resultados das composições de monossacarídeos mostraram que o CDOS-1 era composto apenas de sacarose (Fig.2) e o CDOS-2 era composto principalmente de sacarose, ramnose e manitol (Fig.3), com uma razão molar de 1:0,73:3,61.

3.2. Atividades imunobiológicas de CDOs

Muitas evidências in vivo e in vitro demonstraram que os oligossacarídeos naturais exibem função imunomoduladora, estimulando tanto células quanto humorais.imune respostas[27], [28]. Neste artigo, 100 mg/kg/BW CDOs aumentaram o índice do baço do camundongo, mas não houve diferenças significativas no índice do timo entre os grupos tratados e os grupos de controle (Tabela 1). Os macrófagos são um componente importante das defesas do hospedeiro contra a infecção viral, inibindo a replicação intracelular dos vírus e matando as células infectadas pelo vírus. Quando ativados, uma variedade de intermediários de oxigênio ou nitrogênio e citocinas são liberados dos macrófagos e participam de várias funções biológicas importantes, como atividades anti-inflamatórias e antitumorais [30]-[32]. Portanto, a atividade fagocitária dos macrófagos é um importante indicador das funções imunológicas do organismo. Neste estudo, as doses moderadas e altas de CDOs aumentaram a atividade de fagocitose dos macrófagos (Tabela 1). A proliferação de células produtoras de anticorpos induzida por CDOs foi estudada pelo exame do aumento de PFC hemolítico nos baços de camundongos Kunming que foram imunizados com SRBC mais a amostra de teste. Os resultados indicaram que doses moderadas e altas de CDOs aumentam significativamente a proliferação de células produtoras de anticorpos (Tabela 2). Altas doses de CDOs causaram um aumento altamente significativo na contagem de PFC (P <>

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