Estudo de Perfis Químicos e Metabólitos de Cistanche Deserticola Cru e Processado em Ratos por UPLC-Q-TOF-MSE

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Abstrato

Fundo: O processamento de matéria médica chinesa é uma técnica farmacêutica distinta e única na Medicina Tradicional Chinesa (MTC) usada para reduzir os efeitos colaterais e aumentar ou mesmo alterar a eficácia terapêutica das ervas cruas. Alterações nos componentes essenciais induzidas por um procedimento de processamento otimizado são os principais responsáveis ​​pelo aumento da eficácia das plantas medicinais. O efeito revigorante rim-yang do vinho de arroz cozido no vaporCistanche deserticola(C.deserticola) foi mais forte do que C.deserticola cru (CD).

Métodos: Foi realizada uma análise comparativa utilizando o UPLC-Q-TOF-MS' com a plataforma informática da UNIFl para determinar a influência do processamento. Estudos in vitro foram realizados para a caracterização dos constituintes, bem comometabólitosna Vivo. Os componentes químicos foram determinados em CD e seus produtos processados. As análises estatísticas multivariadas foram realizadas para avaliar as variações entre elas, enquanto OPLS-DA foi utilizado para comparação CO pareada.

Resultados: Os resultados deste estudo revelaram variações consideráveis ​​nos glicosídeos feniletanoides (PhGs) eiridóidesapós o processamento. Um total de 97 compostos foram detectados nos extratos de CD e seu produto processado. PhGs com o grupo 4-O-cafeoil na parte 8-O- -D-glucopiranosil, como acteosídeo, cistanosídeo C, campneosídeo Il, osmanthuside diminuíram após serem processados, enquanto PhGs com 6' Grupo -O-cafeoil na parte 8-O- -D-glucopiranosil, como isoacetosídeo, isocistanosídeo C, isocampneosídeo l, isomartinosídeo aumentado, principalmente no grupo CD-NP. A intensidade de echinacoside e cistanoside B cuja estrutura possui a porção 6'-O- -D-glucopiranosil também aumentou. No estudo in vivo, 10 componentes protótipos e 44 metabólitos foram detectados em plasma, fezes e urina de ratos. Os resultados obtidos revelaram que o processamento leva a uma variação considerável nos constituintes químicos do CD e afetou a disposição dos compostos in vivo, e os processos metabólicos de fase Ⅱ são as principais cascatas de cada composto, e a maioria dos metabólitos estão associados ao echinacoside ou acteosídeo.

Conclusões: Esta é a primeira pesquisa de comparação global de CD bruto e processado. Essas descobertas aumentam nossa compreensão do impacto do processamento de CD e fornecem dados importantes para futuras investigações de eficácia.

Palavras-chave: Cistanche deserticola, Processamento, UPLC-Q-TOF-MS5, Perfis químicos, Metabólitos in vivo

Introdução

O processamento da Matéria Médica Chinesa (CMM) tem demonstrado aplicabilidade signifcativa na prática clínica da Medicina Tradicional Chinesa (MTC), sendo considerado um tratamento viável há vários séculos. Esta é uma tecnologia farmacêutica única que foi derivada da teoria da MTC. Após o processamento, foram identificadas diferenças significativas na aparência, constituintes químicos, características e significado medicinal de todos os tipos de MTCs, levando à suposição de que o processamento poderia melhorar a eficácia ou reduzir os efeitos tóxicos da MTC.

Por centenas de anos,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong em chinês, CD) é comumente usado na prática clínica da MTC para complementar as funções do rim. Também ajuda na hidratação do intestino que leva ao relaxamento intestinal [1].Cistanchefoi gravado pela primeira vez em ShenNongBencaoJing. É comumente encontrado em habitats áridos e semiáridos em toda a Eurásia e norte da África, incluindo Irã, China, Índia e Mongólia [2]. O processamento de CD tem sido realizado por vaporização com vinho de arroz sob pressão normal, que é um método de preparação documentado na farmacopeia chinesa (Jiucongrong em chinês, doravante denominado "CD-NP"). E a vaporização de CD com vinho de arroz sob alta pressão é um método de preparação mais eficaz (doravante denominado "CD-HP") [3, 4]. Vários estudos revelaram que os efeitos farmacológicos da DC são diferentes de seus produtos processados ​​[5]. A DC pode tonificar o yang do rim e relaxar o intestino, enquanto depois de ser cozido no vapor pelo vinho de arroz, o efeito de reabastecer o yang do rim seria fortalecido. Em nosso estudo anterior, descobriu-se que o CD-NP poderia aumentar a tonificação do rim e apoiar o yang, e aliviar o efeito de umedecer os intestinos e defecar [6-8]. Na prática clínica, os produtos processados ​​são a forma mais utilizada.

Até o momento, vários estudos analisaram os componentes químicos da DC, seguidos pelo isolamento e identificação de mais de 100 compostos [9-11], como glicosídeos de feniletanol (PhGs),iridóides, lignanas e oligossacarídeos como seus principais constituintes químicos. Também foi relatado que existem muitas atividades farmacológicas de PhGs, incluindo imunomoduladora, neuroprotetora, hepatoprotetora, anti-inflamatória, antioxidante, etc.[12–14]. Os iridóides possuem atividades anti-inflamatórias [15, 16]. Também foi revelado por estudos anteriores que alguns componentes químicos apresentaram variações durante o processamento [17-20]. Com base nesses relatos, pode-se supor que no pós-processamento, as variações na composição química levam a diversos efeitos farmacológicos, que precisam ser mais explorados.

No presente estudo, um método sensível e eficaz, ou seja, cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada com TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) foi realizado para análise comparativa, e estudos in vitro foram realizados para analisar qualitativamente os extratos de CD, CD-NP e CD-HP para elucidar seus perfis químicos. Geralmente, os produtos químicos exógenos com alta exposição em órgãos-alvo foram considerados como componentes eficazes. Portanto, em ratos, a DC e seus produtos processados ​​foram administrados por via oral respectivamente, seguido de sua caracterização. O estudo existente revela um estudo comparativo (tanto in vitro quanto in vivo) de CD bruto e processado pela primeira vez. Os resultados obtidos ampliariam nossa compreensão sobre o efeito do processamento de CD, o que pode ser útil para estudos futuros.

Materiais e métodos

Materiais

Os compostos padrão de ajugol (180120) e 2'-acetil-acetósido (M0601AS) foram fornecidos por Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, China). Cistanosídeo F(MUST-17022620), echinacoside (D1105AS), cistano-side A(M0906AS) e isoacteoside(M0106AS)foram fornecidos pela empresa Must(Sichuan China);acteoside (O0618AS), salidroside(J0526AS), catalpol (S0728AS), geniposido(A0407AS) e ácido geniposidico (MB6001-S)foram adquiridos de Dalian Meilun Bio.Co.,Ltd(Dalian, China).8-ácido oxilogânico de epides (B31123) foi obtido da Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, China. O metanol e o acetonitrilo eram de grau MS e foram obtidos da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha. O ácido metanóico (CH, O) de grau HPLC foi fornecido pela Merck KGaA (Darmstadt, Alemanha). A água utilizada no estudo existente foi processada através do sistema Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, Ma, EUA). O vinho de arroz foi fornecido pela Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).

Cistanch deserticola foi coletado de Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. As amostras foram identificadas pelo Prof. Yanjun Zhai (escola de farmácia, Liaoning University of TCM). Os espécimes foram submetidos à Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning.

Animais

Ratos machos Sprague–Dawley (grau SPF) com 180–220 g de peso corporal total foram fornecidos pela Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource Center of Liaoning Province, número de licença: SCXK-2015–0001). Esses ratos foram alojados em uma sala de reprodução com temperatura e umidade bem mantidas, ou seja, 20 a 26 graus, 50 a 70 por cento por uma semana. Os ratos foram alimentados com comida de laboratório habitual e água antes da experimentação. Os animais jejuaram durante a noite, porém, a água ad libitum foi fornecida antes da experimentação. Os ratos foram executados com 10% de anestésico de hidrato de cloral. O Comitê Institucional de Ética Animal do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Liaoning aprovou todos os protocolos experimentais (2019.3.25, 2019015).

Preparação de extrato de CD, CD‑NP e CD‑HP

CD-NP, CD-HP foram processados ​​a partir do mesmo lote de Cistanch deserticola. Para preparar CD-NP, pedaços secos de CD (5 mm de espessura, 100 g) foram umedecidos com vinho de arroz (30 mL) e foram cozidos no vapor a 100 graus por 16 h, seguido de secagem a 55 graus em estufa de secagem. Enquanto o CD-HP foi preparado através da infiltração de pedaços secos de CD (5 mm de espessura, 100 g) com vinho de arroz (30 mL), seguido de vapor a 1,25 pressão atmosférica por 4 h. e depois secou em um forno de secagem a 55 graus.

Em um frasco de medição de 100 ml, um grama do pó foi peneirado na peneira #4, seguido pela adição de 50 por cento de metanol (50 ml) e então bem coberto e misturado. Esta mistura foi pesada, seguida de meia hora. maceração. Após a maceração, a mistura foi ultrassônica (potência 250 W, frequência 35 kHz) por 40 min, seguida de resfriamento e pesagem novamente. A perda de peso foi reabastecida com metanol a 50 por cento, devidamente misturado e deixado em repouso, seguido de filtração do sobrenadante e depois usando o filtrado obtido como solução de teste.

Análise MSE de componentes ativos

Preparação de substâncias padrão: tubuloside-A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2'-acetilacteoside (2,34 mg), acteside (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cistanoside-F (2,14 mg), salidroside (3,39 mg), geni poside (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), catalpol (2,39 mg), ácido geniposidico (2,56 mg) e 8-epidoxilogânico ácido (2,34 mg) foram adicionados em um frasco volumétrico de 10 mL, adicionado metanol em volume constante à escala, confgurado em uma solução de referência de concentração correspondente. Cada um dos 100 μL foi configurado em uma solução de referência mista.

Condição de análise MS: O valor de massa foi corrigido antes do experimento, e o modo de íon negativo foi usado. A faixa de massa foi de 50–1200 Da, e a amostra foi injetada através de uma bomba de injeção de fluxo. A velocidade do cone foi de 100 L/h, a taxa de fluxo de solvente foi ajustada em 800 L/h. As tensões capilar e do cone foram fixadas em 2500 e 40 V, de acordo. A temperatura da fonte de íons e do gás dissolvente foi de 100 graus e 400 graus, respectivamente, e a frequência de aquisição do sinal foi de 0,5 S−1.

Análise UPLC-Q-TOF-MS do extrato de CD (15–16 min), 65% a 55% A (16–18 min). A taxa de fluxo foi de 0,3 mL min−1, enquanto a temperatura da sala e da coluna do amostrador automático foi de 30 graus e 8 graus separadamente. O volume de injeção foi de 1,0 μL.

A avaliação espectrométrica de massa foi realizada via Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, EUA), compreendendo uma fonte ESI. A vazão do gás nitrogênio foi fixada em 800 L·h-1 com uma temperatura de 400 graus, a temperatura da fonte foi fixada em 100 graus e o gás do cone foi fixado em 50 L h-1. A voltagem do cone e capilar foi ajustada em 40 e 2000 V, de acordo. A energia de colisão da rampa foi usada na faixa de 20 a 30 V. Os dados centroides de todas as amostras foram obtidos de 50 a 1200 Da, com um tempo de varredura 5-de 0,5 s em um tempo de análise de 10 min . LockSpray TM foi empregado para a validação da precisão de massa. O íon Te [M–H]− de leucina encefalina (200 pg·μL−1 taxa de fluxo de infusão 10 μL min−1) a m/z 554,2615 foi usado como massa de bloqueio. O software MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, EUA) foi empregado para o cálculo preciso da massa, da composição dos íons precursores e dos íons fragmentados.

Análise de dados na plataforma Masslynx

Além disso, uma biblioteca interna contendo o nome do composto, sua estrutura e a fórmula molecular (em mol.) foi montada com base na literatura. Todos os compostos foram anotados em um modelo especial, feito em Excel. Além disso, os arquivos mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, EUA) e os arquivos Excel de todas as estruturas compostas individuais também foram salvos no PC local. A planilha Excel estabelecida com dados importantes foi importada diretamente para a biblioteca científica da UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Reino Unido foi empregado para a avaliação das características estruturais, particularmente para os fragmentos característicos e fragmentação MS. Uma área de pico mínima de 500 foi definida para a detecção de pico 2D. Durante a revelação de picos 3D, uma intensidade de pico de baixa energia de mais de 300 contagens e uma intensidade de pico de energia elevada de mais de 80 contagens foram escolhidas. O erro de massa foi de até ± 10 ppm para compostos conhecidos, e a tolerância do tempo de retenção foi definida na faixa de ± 0,1 min. Selecionamos os adutos negativos contendo -H, mais HCOOH. O processamento dos dados brutos obtidos do MS foi realizado por meio do software UNIFI simplificado para identificar rapidamente os componentes químicos que atenderam aos padrões com o banco de dados autoconstruído e a Biblioteca de Medicina Tradicional interna.

Em seguida, para verificar a estrutura química de cada composto alvo, os isômeros foram distinguidos por seus padrões característicos de fragmentação MS que foram revelados nos estudos relatados, e pela comparação dos tempos de retenção dos padrões de referência.

Análise metabolômica baseada em análise estatística multivariada

Antes de processar os dados brutos, foram definidos os parâmetros, como massa variando de 150 a 1200 Da, intervalo de tempo de retenção (0 a 20 min), intensidade de limiar ( 2000 contagens), tolerância de massa, ou seja, 5 MDA, enquanto a massa e a janela de tempo de retenção foram de 0,20 min e 0,05 Da, respectivamente. Na lista subsequente do banco de dados, o identificador de íons foi o RT-m/ pares em relação aos seus tempos de eluição. Os mesmos valores para RT e m/z em vários lotes de amostras foram considerados como o mesmo composto.

A análise estatística multivariada foi realizada para avaliar biomarcadores eficazes que contribuíram consideravelmente para as variações entre os diferentes grupos. Durante a análise, a análise de componentes principais (PCA) foi empregada para indicar as diferenças máximas e reconhecimento de padrões para obter uma visão geral e classificação. O OPLS-DA é uma ferramenta de modelagem que fornece visualização do carregamento do componente preditivo OPLS-DA para auxiliar na avaliação do modelo. A importância variável para a projeção (VIP) foi usada para avaliar a avaliação de vários componentes, e ometabólitoswith VIP values>1.0 e valor P<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Os ratos de experimentos com animais foram categorizados aleatoriamente em quatro grupos (n=6 para cada grupo), seguidos pela administração oral de vários extratos: (1) Grupo controle em branco: os ratos receberam solução salina normal (2 mL/100 g) ; (2) grupo CD: os ratos receberam extrato de CD (2 mL/100 g); (3) grupo CD-NP: os ratos receberam extrato de CD-NP (2 mL/100 g); (4) Grupo CD-HP: os ratos receberam extrato de CD-HP (2 mL/100 g). A categorização adicional de todos os grupos foi realizada em três subgrupos para plasma, urina e fezes, de acordo. Duas horas depois, cada rato foi administrado oralmente com a mesma e igual quantidade de extratos.

Após a administração, a coleta de amostras de sangue foi realizada em 1.0 h, 2.0 h, e 4.0 h em tubos de polietileno heparinizado de 1,5 mL (de veias orbitais) , seguido de centrifugação (a 4500 rpm) de todas as amostras por 15 min.

Para as amostras de urina e fezes, os ratos foram mantidos em gaiolas de metabolismo e, em seguida, a coleta das amostras de urina e fezes foi realizada por 24 h após a administração. A centrifugação das amostras de urina foi realizada a 4500 rpm por 15 min, enquanto as amostras de fezes foram secas à sombra, moídas em pó, em seguida foram retirados 0,2 g e adicionados em 0,5 mL de soro fisiológico solução, ultra-som por 5 min e centrifugado a 12,000 rpm por 15 min. Todas as bioamostras foram mantidas a -80 graus até a análise.

Preparação de amostras biológicas. A adição de amostras de plasma, urina e fezes foi realizada com 3 volumes de metanol, seguido de vortex por 3 min. Em seguida, foi realizada a centrifugação (a 12,000 rpm) das misturas por 10 min, seguida pela transferência do sobrenadante para o tubo EP e, em seguida, seca por nitrogênio a 37 graus. Além disso, foi realizada a adição de 200 μL de solução de HCN–H2O (50 por cento). Dez, o vórtice foi usado para misturar (1 min), seguido de centrifugação (a 12,000 rpm) por 5 min. O sobrenadante (5 μL) das amostras tratadas foi injetado no sistema UPLC-Q-TOF-MSE.

Condição cromatográfica líquida e espectrométrica de massa A análise parametabólitostambém foi realizada pelo instrumento Waters UPLC através de uma interface ESI. As separações foram realizadas usando uma coluna Acquity UPLC HSS T3 (100 mm×2,1 mm, 1,8 µm), a fase móvel era 0,1 por cento de ácido fórmico (A): Acetonitrila (B), o condição de eluição de gradiente foi 0-3 min (99,8 por cento → 98 por cento A).3-5 min(98 por cento → 95 por cento A),5-8 min(95 por cento → 90 por cento A), { {18}} min (90 por cento →85 por cento A),12-17 min(85 por cento →70 por cento A), 17-22 min (70 por cento →60 por cento A), 22-23 min (60 por cento → 58 por cento A), 23-25 min (58 por cento A),25-32 min(58 por cento → 45 por cento A), e 32-37 min (45 por cento →35 por cento A) ),0,4 mL min-1 foi a taxa de fluxo. A temperatura da coluna e da sala de amostras foi fixada em 40 graus e 8 graus, respectivamente. As condições de espectrometria de massa mencionadas acima foram usadas.

Estratégia para análise sistemática de metabólitos em bioamostras O software UNIFI (1.8.2) foi empregado para o processamento dos dados. A função Binary Compare foi utilizada para a identificação de metabólitos efetivos. Os metabólitos avaliados não existiam na amostra de controle equivalente ou existiam em baixas intensidades de íons. O limiar de intensidade relativa foi fixado em 3 ou 5, e os metabólitos que preencheram os critérios sublinhados puderam ser avaliados. Metabólitos comuns e previsíveis foram então determinados por EIC. Para a busca de metabólitos bifásicos, foi aplicada a função NLF. Por exemplo, no software UNIFI, os parâmetros podem ser definidos em 176.0321 para pesquisar possíveis conjugados de ácido glucurônico. Após o processamento, uma perda neutra pode ser definida no método ou identificada. O MassFragment foi usado para determinar ou caracterizar as estruturas dos metabólitos detectados, a função de interpretação espectral do UNIFI é a principal função usada para analisar a fragmentação secundária dos componentes originais. Esta função pode ser usada para verificação rápida do caminho de fragmentação se for razoável.

Resultados

Regra de fragmentação em massa de glicosídeos feniletanoides e iridóides

Os glicosídeos feniletanoides são os principais constituintes químicos da DC. As soluções padrão de isoacteoside,

cistanoside F, tubuloside A, echinacoside, acteoside e 2'-acetil-acteoside foram tomados, seguidos por fornecer um nível diferente de energias de colisão (Tabela 1), e então os mapas MS2 correspondentes foram obtidos (Fig. 1).

A análise espectrométrica de massa revelou que os glicosídeos feniletanoides têm padrões de fragmentação de espectro de massa semelhantes, as vias de clivagem no modo de íons negativos incluem principalmente (1) Clivagem da ligação éster: perda do grupo cafeoil neutro (C, H, O162.03) e acetil neutro grupo (C, H, O,42.00);(2) Clivagem glicosídica: perda de resíduos neutros de ramnose (C.HIO, 146,05) e resíduo neutro de glicose (CgHO,162,05). A partir de espectrometria de massa de alta resolução, cafeoil (162,03) e resíduo de glicose (162,05) puderam ser distinguidos.

Iridóides ajugol, catalpol, ácido geniposidic, geniposide, e 8-epid ácido oxilogânico soluções padrão foram tomadas, seguido pelo fornecimento de diferentes energias de colisão, e mapas de MS correspondentes foram obtidos (Fig. 2).

Os glicosídeos iridóides têm padrões de fragmentação de espectro de massa semelhantes, as vias de clivagem no modo de íons negativos incluem principalmente (1)Clivagem glicosídica: Perda de resíduo de glicose neutro (CHoO,162,05); (2)Perda de CO neutro, (43,99) e H , O(18,01).

Identificação dos compostos em extratos de CD, CD-NP e CD-HP

Análise UPLC-QTOF-MSE

A otimização das condições cromatográficas foi realizada. Em seguida, os compostos de CistancheHerba foram avaliados nos modos de íons negativos e positivos com CEs altos e baixos. Os resultados obtidos revelaram que a compatibilidade do modo negativo foi maior em relação ao modo positivo para esses compostos. A Figura 3 mostrou o cromatograma do íon de pico básico MS (BPI) traçado com picos numerados. A intensidade de cada íon detectado na análise de UPLC-Q-TOF-MS foi normalizada em relação à contagem de íons inteira para a geração de uma matriz de dados que compreende o valor de m/z, a área de pico normalizada e o tempo de retenção.

A avaliação de componentes de CD e seus produtos processados ​​na plataforma UNIFl

Um total de 97 compostos foram identificados com modo -SEM (n=6) a partir de CD e seu produto processado (Tabela 2), incluindo glicosídeos feniletanoides (PhGs), iridóides, lignanas e oligossacarídeos. Os componentes 95,91 e 94 foram detectados em CD, CD-NP e CD-HP de acordo. Entre eles, 64 eram feniletanóides, 13 eram iridóides e 20 outros tipos de compostos foram determinados. Houve semelhança na composição química do CD e seu produto processado, porém, a quantidade dos componentes foi diferente entre o CD e seu produto processado.

Variações nos componentes químicos dos produtos processados ​​O software Simca-P 13.0 foi empregado para análise da matriz de dados multivariada. Antes da PCA, todas as variáveis ​​eram centradas na média e escala de Pareto, seguida da identificação de potenciais variáveis ​​discriminantes. Em um gráfico de pontuação PCA, cada ponto mostrou uma amostra individual. As amostras que apresentaram similaridade em seus componentes químicos foram espalhadas adjacentes umas às outras, enquanto aquelas que apresentaram variações em seus componentes foram divididas. Como visto na PCA(Fig.4), o grupo CD-HP foi separado dos grupos CD e CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 e P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

A partir da Fig.8, encontramos a intensidade de acteoside(54), cistanoside C(74), campneoside I(43), osmanthuside (75) e 2'-actylacteoside(80) tendo o grupo 4'-O-caffeoyl em a parte 8-O- -D-glucopiranosil (ver Fig. 9) diminuiu após ser processada por vinho de arroz, enquanto a intensidade de isoacetoside (60), é castanoside (71), iso-campneoside I (69), isomartinosídeo (86) tendo o grupo 6'-O-cafeoil (ver Fig. 9) aumentado, especialmente para o grupo CD-NP. Embora o tubulósido B (72) tenha um grupo 6'-O-cafeoílo, o mesmo que o isoacteósido, a intensidade diminuiu devido ao seu grupo 2'-acetilo. A intensidade de echinacoside(38) e cistanoside B com grupos 6'-O- -D-glucopiranosil aumentou, mas a intensidade de tubuloside A (55) diminuiu também devido ao seu grupo 2'-acetil.

Nossa equipe de pesquisa também estudou a estabilidade térmica do acteoside e isoacteoside e descobriu que o acteoside era instável em água, metanol e solução de vinho de arroz amarelo, e poderia ser convertido em isoacteoside parcialmente sob condições de aquecimento. Mas a termoestabilidade do isoacteoside foi melhor, especialmente na solução de vinho de arroz amarelo. A Figura 10 mostrou as possíveis alterações de PhGs em CD durante o processamento:

Identificação dos metabólitos em ratos A partir de dados de espectrometria de massa de alta resolução, o peso molecular preciso e a composição elementar de metabólitos e compostos de protomoléculas foram analisados ​​e comparados. Como os mesmos tipos de compostos na MTC mostraram semelhança nas modificações metabólicas, as correlações dos constituintes fitoquímicos in vitro podem se estender aos seus metabólitos in vivo. Entretanto, com base nas vias convencionais de biotransformação, foi inferida uma razoável mudança de peso molecular. Finalmente, os metabólitos foram identificados analisando os espectros de massa MSE da via de fragmentação de metabólitos e proto-compostos no espectro de massa [21, 22]. Comparado com a amostra em branco, seus componentes foram identificados in vivo com base nas informações fornecidas pelo cromatograma-espectro de massa, a possibilidade de uma reação metabólica, as características da estrutura do composto e a regra de fragmentação do seu espectro de massa. Consulte a Tabela 3.

Identificação de metabólitos relacionados a glicosídeos de feniletanol

A plataforma UNIFI foi utilizada para o processamento. A Figura 11 mostra a cromatografia TIC de urina, fezes e plasma para DC e seus produtos processados. Comparado com amostras em branco, um total de 54 metabólitos foram identificados em ratos, incluindo 10 componentes protótipos e 44 metabólitos, dos quais 24, 49 e 6 estavam nas fezes, urina e plasma, respectivamente.

Com base na massa precisa, cascata de fragmentação e perdas neutras previsíveis por biotransformação, um total de 35 metabólitos associados a glicosídeos feniletanoides foram avaliados provisoriamente. Os metabólitos relacionados de glicosídeos feniletanoides têm padrões de fragmentação de espectro de massa semelhantes, como o típico fragmento decafeoil m/z 461,1605, depois hidrolisado por ligações glicosídicas e éster in vivo e metabolizado em hidroxitirosol (HT)(m/ z153,0504, C.HO.4,73 min) e ácido cafeico(CA)(m/z179,0389, CH, O0,77 min), ver Fig.12A.

M11 indicado [MH] ~ em m/ 153,0504 com a fórmula ie,C.HO, e identificado como HT. M16 apresentou [MH]- em m/z 329,0851, que foi 176 Da superior ao da HT, revelando que pode ser um metabólito glucuronidado da HT. A [MH]- de M26 foi a m/z 343,1037,14 Da superior à de HT-glucuronido. Portanto, M26 foi identificado como glucuronídeo HT-metilado. M17 foi identificado como HT-sulfato com base em seu [MH]-at m/z 233,0112,80 Da sobre o HT, que poderia ser mais metilado, então produziu M22, que apresentou o m/z 247,0278, indicando que era HT- metabólito sulfatado metilado. M7 (m/167,0335) e M5(m/z 167,0762) foram considerados como produtos de oxidação e HT metilado, respectivamente (Fig. 12B).

M1 indicou [MH]- em m/z 179,0389, fórmula molecular elucidada foi CH-O e identificada como ácido cafeico (CA). que pode ser um metabólito glucuronidado de CA. M27 tinha m/z 258.994, que era 80 Da maior que CA, então nós o elucidamos como sulfato de CA, e poderia produzir M35(m/z 273.0064). Como M4 fornece a [MH]7 a m/z 193,0524,14 Da superior a CA, foi identificado como metabólito metilado de CA. M39 era metabólito de desidroxilação de CA, com m/z 163,04, e poderia ser sulfatado em M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO,9,06 min) foi o produto de redução de CA, que é 3,4-ácido diidroxi-benzenopropiônico, que pode ser metilado em M19 (m /z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 pode ser desidratado em M43, que é 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min) e M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) e M29 (m/z 245,0125, C9H10O6S, 8,52 min) foram os produtos glucuronidados e sulfatados (Fig. 12C).

Para os metabólitos associados aos glicosídeos feniletanoides, as principais cascatas metabólicas foram reações metabólicas de fase II, ou seja, glicuronidação, metilação e sulfatação. As cascatas metabólicas propostas de feniletanoides estão representadas na Fig. 13.

Identificação de metabólitos relacionados a iridóides

Ao analisar a composição elementar dos metabólitos, fragmentação de MSE e literatura associada, um total de 19 metabólitos associados a iridóides foram avaliados provisoriamente. Os glicosídeos iridóides foram hidrolisados ​​por ligações glicosídicas para formar suas agliconas correspondentes. O m/z 185,117 foi para M8, 162 Da menor que ajugol, que foi obtido pela perda de resíduo de glicose.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) foi o produto desglicosilado de catalpol. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) foi inferior a 30 Da do metabólito desglicosilado catalpol, e foi identificado como remoção de uma molécula do metabólito CH,O. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), foi uma perda adicional do metabólito H,O.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) foi um metabólito desglicosilado de geniposido, e M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) foi a desglicosilação do ácido 8-epidoxilogânico. Reações metabólicas para iridóides podem ser reveladas como metabolismo de fase I da desglicosilação (Fig. 12D).

Comparação do perfil metabólico no plasma, urina e fezes entre DC e seus produtos processados

2 protótipos no plasma, 7 na urina e 3 nas fezes foram comparados. Foram 7 protótipos absorvidos em CD, 7 protótipos absorvidos em CD-NP e 8 protótipos em CD-HP. M21 foi detectado apenas no grupo de fezes de CD-NP, e M38 e M51 foram detectados apenas em grupos de urina de CD-HP. Comparado com metabólitos, metabólitos idênticos no plasma, urina e fezes foram 4, 42 e 21, respectivamente. Foram absorvidos 34 metabólitos no grupo CD, 39 no CD-NP e 40 no grupo CD-HP. M5, M7, M40 e M52 foram detectados apenas nos grupos CD-NP, enquanto M24, M4l e M48 foram detectados apenas nos grupos CD-HP.

Variações foram observadas na absorção e no metabolismo de compostos ativos em diversos produtos processados ​​de CD. A partir da Fig.14, descobrimos que a intensidade da conjugação HT-sulfato (M17) foi a mais alta na urina, seguida por 3-conjugação de sulfato de HPP (M29), conjugação de sulfato de HT metilado (M22), sulfato de CA desidroxilado conjugação (M32) e conjugação com sulfato de ácido 3,4-di-hidroxibenzeno propiônico (M19). O conteúdo de produtos metabólicos no grupo processado foi maior que no grupo CD, principalmente para M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Seu grupo precursor 6'-O-cafeoil na parte 8-O- -D-glucopiranosil, compostos como o hidroxitirosol têm propriedades antitumorais, anti-inflamatórias, antibacterianas, antivirais e antifúngicas [ 23]. O ácido cafeico possui atividades anti-inflamatórias, anticancerígenas e antivirais [24]. Foi consistente com o uso clínico de CD e seus produtos processados.

Discussão

CD é um TCM, e seus principais componentes bioativos, incluindo PhGs, iridóides, polissacarídeos foram documentados por vários estudos de pesquisa. Na prática clínica da MTC, os produtos processados ​​da DC têm sido amplamente utilizados em relação aos crus. A composição química será alterada durante o processamento, o que pode levar a alterações nos efeitos medicinais (Fig. 14).

PhGs são um tipo de composto fenólico caracterizado por uma estrutura de -glucopiranosídeo com uma porção hidroxi-feniletila como aglicona. Esses compostos geralmente compreendem ácido cafeico e ramnose ligados ao resíduo de glicose por meio de ligações éster ou glicosídicas, respectivamente. No presente estudo, as análises qualitativas de CD, CD-NP. e CD-HP, e um total de 97 compostos, incluindo glicosídeos feniletanoides (PhGs), iridóides, etc. foram identificados. Os resultados obtidos mostraram variações na composição química antes e após o processamento. A intensidade de PhGs com o grupo 4'-O-cafeoil na parte 8-O- -D-glucopiranosil, como acteosídeo, cistanosídeo C, campneosídeo II, lado osmanthus, diminuiu após ser processado, enquanto PhGs com

como isoacetosídeo, isocistanosídeo, isocampneosídeo I, isomartinosídeo aumentado, principalmente no grupo CD-NP. A intensidade de echinacoside e cistanoside B cuja estrutura possui a porção 6'-O- -D-glucopiranosil também aumentou. PhGs com um grupo 2'-acetil muitas vezes diminuído devido à reação de hidrólise durante o processo, como tubuloside B, 2-acetilacteoside.

A investigação dos metabólitos absorvidos in vivo foi realizada após a administração oral de CD e seus produtos processados. Os processos metabólicos da fase II foram as principais cascatas e a maioria dos metabólitos foram sulfato, glicuronídeo e conjugados metilados. Os glicosídeos de feniletanol têm baixa absorção e utilização oral. Eles são difíceis de serem absorvidos pelo sangue e atuam como progenitores para desempenhar seus papéis após a ativação metabólica in vivo. Feniletanoides produzidos em feniletanolaglicona, como hidroxitirosol (HT) e ácido cafeico (CA) e seu derivado 3-ácido hidroxifenilpropiônico (3-HPP), esses metabólitos podem ser mais facilmente absorvidos pelo plasma e ter uma melhor efeito medicinal.

CD e seus produtos processados. A conjugação de HT-sulfato (M17) tem a maior intensidade na urina, seguida por 3-conjugação de sulfato de HPP (M29), conjugação de sulfato de HT metilado (M22), conjugação de sulfato de CA desidroxilado (M32) e 3,{{ 7}} conjugação com sulfato de ácido dihidroxibenzenopropiônico (M19). O conteúdo de produtos metabólicos no grupo processado foi maior que no grupo CD, principalmente para M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Geralmente, os componentes com alta exposição em órgãos-alvo podem ser eficazes. Uma quantidade suficiente de feniletanoides e seus derivados foi avaliada e determinada in vitro. Acteoside é o composto característico, cujo teor diminuiu após ser processado por vinho de arroz, e o teor de isoacteoside, isocistanoside C, isocampneoside I aumentou correspondentemente. Os produtos de degradação de PhGs, como derivados de CA e HT, podem ser avaliados nas bio-amostras, e o processamento de vinho de arroz pode aumentar a absorção de metabólitos in vivo.

Conclusão

Neste estudo, 97 compostos foram detectados nos extratos de CD e seu produto processado. A degradação de alguns glicosídeos ocorreu sob temperatura elevada e como resultado, alguns novos isômeros e complexos foram sintetizados. No estudo in vivo, componentes protótipos (10) e metabólitos (44) foram determinados ou avaliados experimentalmente em plasma, fezes e urina de ratos. Os processos metabólicos de fase II foram as principais cascatas, a maioria dos metabólitos foram associados com echinacoside ou acteosídeo, como HT, CA e seus derivados 3-ácido hidroxifenilpropiônico 3-HPP. Esses metabólitos podem ser absorvidos mais facilmente no plasma e ter um melhor efeito medicinal. Os resultados obtidos mostraram que a composição química do CD foi diferente e afetou a disposição do composto in vitro e in vivo.

Abreviaturas

PhGs: Glicosídeos feniletanóides; CD: Cistanche deserticola; CMM: Matéria Médica Chinesa; MTC: Medicina Tradicional Chinesa; CD-NP: Gistanche deserticola Processado por vaporização com vinho de arroz sob pressão normal; CD-HP: Cistanche deserticola Processado por vaporização com vinho de arroz sob alta pressão; UPLC-Q-TOF-MS: Cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada a TOF-MS; PCA: Análise de componentes principais; VIP: Importância variável para a projeção;CA: Ácido cafeico; HA: Hidroxitirosol.

Agradecimentos

Não aplicável.

Contribuições dos autores

LZ, LBN, SJ participaram da redação, redação do manuscrito. RJ, LPP auxiliou nos experimentos com animais e redigiu e finalizou todas as figuras e tabelas. ZC, H. ITZ auxiliou na concepção e execução deste estudo e revisou o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Financiamento

Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Concessão No:81874345) e pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Liaoning (Concessão No: 2020-MS-223).

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados usados ​​e/ou analisados ​​durante o estudo atual estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.

Declarações

Aprovação ética e consentimento para participar

A aprovação ética para o uso de animais experimentais para este estudo foi obtida do Comitê de Ética Médica da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning (número de aprovação: 2018YS(DW)-044-01), Todos os procedimentos experimentais neste estudo estavam sob os padrões éticos de Comitê de Ética Médica da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning.

Consentimento para publicação

Não aplicável.

Interesses competitivos

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse a divulgar.

Detalhes do autor

'Departamento Farmacêutico, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning, Dalian, Liaoning, China.'Instituto de Pesquisa de Drogas do Grupo Monos, Ulaanbaatar 14250, Mongólia.

Recebido: 31 de maio de 2021 Aceito: 17 de setembro de 2021 Publicado online: 28 de setembro de 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1*, Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 e Tianzhu Jia1

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Nota do editor

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