Cistanosídeo de Cistanche Herba melhora os danos reprodutivos masculinos induzidos por hipóxia por meio da supressão do estresse oxidativo-Ⅰ

Introdução

Atualmente, aproximadamente 48,5 milhões (15%) de casais em idade reprodutiva em todo o mundo são afetados pela infertilidade, entre os quais 40-50% dos casos são atribuídos à infertilidade masculina, uma condição que está fortemente associada a fatores ambientais e de estilo de vida. As evidências sugerem que a suscetibilidade dos testículos dos mamíferos à baixa pressão de oxigênio é um fator causal em algumas formas de infertilidade masculina. Conforme demonstrado em estudos anteriores, a espermatogênese é prejudicada e reduzida após exposição à hipóxia hipobárica.

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Para explorar o mecanismo subjacente, estudos demonstraram que a exposição à hipóxia hipobárica aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). As ROS desempenham um papel importante no sistema reprodutor masculino. Em níveis baixos, eles são necessários para a capacitação espermática, a reação acrossômica e a fusão espermatozóide-oócito [10]. No entanto, o excesso de ERO pode induzir danos ao DNA nuclear/mitocondrial do esperma e danos peroxidativos à membrana plasmática, que por sua vez são os principais fatores etiológicos para oaumento do risco de infertilidade masculina. Assim, o acúmulo de ERO induzida por hipóxia pode ser uma das causas da infertilidade masculina.

Cistanches Herba, uma planta medicinal parasita perene, é amplamente distribuída em áreas áridas e amplamente utilizada devido às suas atividades farmacológicas. Entre todos os conteúdos eficazes deCistanches Herba, PhGs têm sido considerados o principal componente ativo. Até o momento, 34 PhGs foram isolados dePlantas de cistanches. Cistanosídeo(Cis), um PhG ativo isolado deCistanches Herba, tem recebido atenção por seus efeitos antioxidantes.

Considerando os efeitos antioxidantes do Cis e o papel das ERO na infertilidade masculina induzida por hipóxia, o Cis é considerado um potencial candidato a medicamento para o tratamento deinfertilidade masculina induzida por hipóxia. No entanto, poucos relatos abordaram os efeitos antioxidantes do Cis extraído do Cistanches Herba no tratamento da infertilidade masculina induzida por hipóxia ou das vias de sinalização envolvidas. Neste estudo, foram construídos modelos experimentais de hipóxia in vitro e in vivo e avaliados os efeitos componentes de diferentes Cis.

Materiais e métodos

Cultura celular e reagente

A linhagem celular de espermatogônias de camundongo GC-1spg (GC-1) foi adquirida da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivada em DMEM (Invitrogen, EUA) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1% L-glutamina (100 mM), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 ug/mL) a 37 graus em incubadora umidificada com 5% de CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) foi adquirido da Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd.

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Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi testada pelo ensaio do kit de contagem de células{{0}} (CCK-8). Em resumo, as células GC-1 foram semeadas em placas de 96-poços a 1,5×103 por poço e cultivadas a 37 graus por 24 h. Em seguida, as células foram tratadas com diferentes concentrações (20%, 15%, 10%, 5%) de oxigênio ou diferentes concentrações (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) de Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) pelo tempo necessário. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e a viabilidade celular foi detectada utilizando um kit CCK-8 (Dojindo Japan). A absorvância de cada poço foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas (BioRad USA). Por fim, as viabilidades celulares foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula: Viabilidade celular=(grupo ODexperimental - grupo ODbranco)/ (grupo ODcontrole - grupo ODbranco) × 100%.

Análise de Western Blot

As células ou tecidos colhidos foram homogeneizados em tampão RIPA para extrair proteínas (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Suíça). Os sobrenadantes foram coletados e a concentração de proteínas foi testada pelo método BCA (Beyotime). Aproximadamente 40 µg das proteínas extraídas de cada amostra foram separadas por SDS-PAGE e eletrotransferidas para uma membrana de filtro de nitrocelulose (NC) (Beyotime China). As membranas do filtro NC foram bloqueadas com leite desnatado a 5% por 1,5 h e incubadas com anticorpos específicos (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1 :1000, anti-GAPDH 1:1000; todos os anticorpos foram adquiridos da Cell Signaling Technology, EUA) durante a noite a 4 graus. Em seguida, todas as membranas NC foram incubadas com o correspondente anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano durante 1,5 h à temperatura ambiente e fotografadas com um sistema de imagem (Tannon, China).

Detecção do ciclo celular

Um ensaio citométrico de fluxo (FCM) foi realizado para analisar o ciclo celular. As células foram tratadas sob diferentes condições por 72 horas e colhidas. As células foram então lavadas com PBS, fixadas em etanol a 75% e coradas com iodeto de propídio (PI). Para cada amostra, 1x104 células foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo (FACS Calibur, BD Biosciences). Em seguida, foram calculados a proporção de células da fase G1/S/G2 e o índice de proliferação [Fase(S+G2)/Fase(G1+S+G2) × 100%].

Coloração Ki-67

As células foram cultivadas em placa confocal e tratadas com hipóxia ou diferentes subtipos de Cis por 72 h. Depois de fixar todas as células com paraformaldeído a 4%, elas foram incubadas com um anticorpo anti-Ki-67 (1:200, Cell Signaling Technology). Em seguida, todas as células foram incubadas com um anticorpo IgG anti-coelho conjugado com CY -3- correspondente (1:200, Boster, China) e solução DAPI (1,0 ug/mL, Beyotime). A fluorescência foi observada com um microscópio confocal Fluoview FV1000 (Olympus, Japão).

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Detecção de ROS

O FCM foi introduzido para medir os níveis intracelulares de ERO usando DCFH-DA. As células suspensas foram semeadas em 6-placas de poços e submetidas a diferentes tratamentos. Após 72 h de tratamento, as células foram suspensas em DMEM isento de soro com 10 μM de DCFH-DA (Beyotime). O conteúdo de ROS foi então determinado por classificação de células ativadas por fluorescência em um sistema de citometria de fluxo Beckman Coulter com comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 525 nm [18].

Determinação da Peroxidação Lipídica (LPO)

O ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi realizado para detectar LPO. Todas as etapas operacionais foram realizadas de acordo com as instruções (Sigma USA). As concentrações foram calculadas utilizando um coeficiente de extinção molar de 1,56×105/(M·cm), obtido utilizando o malondialdeído como padrão. Os resultados são expressos como nmol de equivalentes de MDA/mg de proteína.

Determinação de atividades enzimáticas

As atividades enzimáticas foram testadas usando kits de ensaio incluindo glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD). Todas as etapas operacionais foram realizadas de acordo com as instruções fornecidas (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).

Animais e Protocolo Experimental

Ratos Wistar machos maduros (180-220 g, 8 semanas de idade) foram obtidos do centro animal da Quarta Universidade Médica Militar, Xi'an, China. A autorização para utilização dos animais foi obtida do Comitê de Ética Universitária (número de referência: 20190506). O experimento animal foi realizado de acordo com as diretrizes da universidade para o cuidado e uso de animais de laboratório.

Todos os ratos foram autorizados a se adaptar durante aproximadamente 1 semana antes do início do experimento. Após a aclimatação, os ratos foram distribuídos aleatoriamente em 6 grupos com 5 animais em cada grupo. Os ratos do grupo controle foram criados sob pressão normal (PO2: 20%; pressão do ar: 101,3 kPa), enquanto os ratos do grupo modelo e tratado com Cis foram criados em uma câmara de oxigênio de baixa pressão (pressão interna de 61,6 kPa). , equivalente a uma altura de 4.000 metros acima do nível do mar; PO2: 14,55%) para simular um ambiente hipóxico de alta altitude. Todos os ratos tiveram livre acesso a comida e água em gaiolas plásticas a 22 ± 2 graus e condições de umidade com ciclo claro/escuro automático de 12-h. Os ratos dos grupos modelo e tratado com Cis permaneceram em condições hipobáricas, mas foram transferidos para condições normobáricas a cada 96 horas, momento em que lhes foram fornecidas comida e água e as gaiolas limpas. A duração da transição de hipobárico para hipobárico foi de aproximadamente 2 horas. Todos os grupos de tratamento foram tratados com o Cis correspondente (8 mg/kg/d) por sonda oral durante 8 semanas, enquanto os ratos controle e modelo foram tratados com igual volume de água.

Após 8 semanas, os ratos foram sacrificados sob anestesia. Testículos, epidídimos e vesículas seminais foram separados e pesados, e o índice de órgãos foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: (peso do órgão/peso do animal) × 100%. Posteriormente, os espermatozoides no epidídimo foram coletados e sua motilidade e atividade enzimática acrossômica foram testadas. Da mesma forma, tecidos testiculares foram coletados para estudos histopatológicos e detecção de ERO, LPO e atividade de enzimas antioxidantes.

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Avaliação da taxa de espermatozóides vivos

O epidídimo foi incisado com tesoura cirúrgica e a suspensão espermática foi preparada em solução salina normal. Para avaliar a taxa de espermatozóides vivos, 5 μL da suspensão de espermatozoides foram cuidadosamente misturados com um volume igual de corante de eosina-Y. Os espermatozoides foram então contados em microscópio óptico. As taxas de espermatozoides vivos foram avaliadas calculando-se os espermatozoides corados (espermatozoides mortos) e os não corados (espermatozoides vivos).

Determinação da atividade enzimática do acrossomo espermático

O ensaio de atividade enzimática do acrossomo espermático foi utilizado para avaliar as enzimas acrossômicas espermáticas [19]. Os resultados em cada grupo foram calculados usando a seguinte fórmula: Atividade da enzima acrossômica (μIU)=(grupo ODExperiment - grupo ODBlank)/(247,5×10) × 106.

Resultados

Efeitos da hipóxia em células GC-1

Para determinar os efeitos da hipóxia nas células germinativas, primeiro examinamos as mudanças na viabilidade celular após o tratamento com hipóxia com diferentes concentrações de oxigênio (20%, 15%, 10% e 5%) por 1, 3, 5 e 7 dias, respectivamente. Os resultados do ensaio CCK-8 mostraram que, em comparação com o grupo controle (concentração de oxigênio de 20%), as células expostas à hipóxia exibiram uma diminuição significativa na viabilidade (P <0,01; Figura 1A). Além disso, a sua taxa de sobrevivência foi inversamente proporcional à concentração de oxigénio e diminuiu ainda mais com o tempo de indução. Para evitar um efeito citotóxico excessivo, uma concentração de oxigênio de 10% e um tempo de indução de 3-dia foram selecionados como critérios do modelo hipóxico para experimentos in vitro subsequentes.

Posteriormente, foram realizadas coloração com FCM e imunofluorescência para avaliar melhor a alteração da proliferação de células GC {{0}} sob tratamento com hipóxia. Os resultados mostraram que a hipóxia poderia induzir a parada de células GC-1 na fase G1, reduzindo assim a entrada celular na fase S e inibindo a replicação do DNA. Assim, a hipóxia reduziu significativamente o índice de proliferação de células GC -1 (P <0,01; Figura 1B). A coloração positiva de Ki-67 é outro biomarcador específico de células em proliferação. Portanto, também examinamos a proporção de células positivas para Ki-67- com ou sem tratamento de hipóxia. Em comparação com o grupo controle, o tratamento com hipóxia reduziu notavelmente as células positivas para Ki-67-, como mostrado na Figura 1C.

Em seguida, pretendemos investigar o modo de inibição da viabilidade celular do GC{{0}} induzido pela hipóxia. Conforme relatado na literatura, o nível de ERO aumentou à medida que os ratos foram expostos a um ambiente hipóxico hipobárico [8, 20]. Assim, os níveis endógenos de ROS em células GC-1 foram medidos usando o ensaio FCM. Os resultados mostraram níveis mais elevados de ERO sob hipóxia em comparação ao grupo de oxigênio normal (P <0,01; Figura 1D). O acúmulo de ERO causa comprometimento acentuado do DNA, que por sua vez causa a ativação da via de apoptose celular e pode ser o principal fator etiológico para o risco crescente de infertilidade masculina [21, 22]. Em seguida, detectamos o efeito de ativação apoptótica da hipóxia nas células GC -1 pela coloração TUNEL. Conforme mostrado na Figura 1E, o tratamento com hipóxia resultou em aumento da fluorescência TUNEL em comparação com o grupo controle, indicando aumento da apoptose no grupo modelo.

Como o dano celular induzido por ROS geralmente é causado pelo sistema operacional, testamos ainda mais o sistema operacional das células GC -1. Conforme apresentado na Figura 1F, os níveis de LPO das células GC-1 no grupo modelo aumentaram acentuadamente em comparação com os níveis de LPO das células GC-1 no grupo de controle. Essas descobertas sugeriram que a lesão celular GC induzida por hipóxia pode estar relacionada ao OS, que é induzido pelo acúmulo de ROS.