Cistanche Tubulosa protege neurônios dopaminérgicos por meio da regulação da apoptose e do fator neurotrófico derivado de células gliais: in vivo e in vitro-Ⅰ

INTRODUÇÃO

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa comum que ocorre em idosos com manifestações patológicas de perda de neurônios dopaminérgicos na substância negra (SN) devido à degeneração. A gravidade da doença está correlacionada com a perda de células neuronais de dopamina (DA) no SN, o que é consistente com a visão de que a doença neurodegenerativao processo progride ao longo de muitos anos antes que qualquer sintoma apareça (Sawle e Myers, 1993). A natureza progressiva da doença sugere possibilidades interessantes de intervenção terapêutica, bloqueando o processo neurodegenerativo subjacente. A busca por ações potentes e específicas induzidas pela terapia de fatores neurotróficos na sobrevivência dos neurônios DA é, portanto, de considerável interesse.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA PROTEGER NEURÔNIOS DOPAMINÉRGICOS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Fatores neurotróficos são proteínas essenciais, incluindo fator de crescimento nervoso (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF), que promovem o crescimento nervoso, o desenvolvimento neurológico, a orientação axonal e a função neuronal. Entre todos os fatores neurotróficos que protegem e promovem a reparação dos neurônios dopaminérgicos, o GDNF tem os efeitos mais fortes (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Foi demonstrado que o GDNF possui efeitos neurotróficos potentes nos neurônios DA in vitro (Lin et al., 1993) e exerce efeitos neuroprotetores in vivo. Foi demonstrado que o GDNF resgata neurônios DA nigrais da morte celular induzida por lesão após axotomia induzida por cirurgia ou toxina em ratos (Beck et al., 1995; Kearns e Gash, 1995; Sauer et al., 1995) e parcialmente também após administração sistêmica deN-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP)em camundongos (Tomac et al., 1995). O aumento da incidência de apoptose neuronal e a redução dos efeitos protetores dos fatores neurotróficos, potencialmente desencadeados por vários fatores patológicos, estão na base da degeneração dos neurônios dopaminérgicos (Holden et al., 2006).

C. tubulosa é um fitoterápico originário de diversas plantas do gênero Cistanche. É uma importante opção terapêutica para a síndrome de deficiência renal, que está intimamente relacionada aos hormônios andrógenos na medicina tradicional chinesa (MTC). Até o momento, muitas pesquisas clínicas e básicas sobre C. tubulosa mostraram as atividades de doenças neurodegenerativas. A identificação de prescrições de tonificação renal da MTC no tratamento da DP pode, portanto, fornecer um tratamento clínico alternativo para a DP.Equinacósido (ECH)é um importante componente bioativo encontrado na erva medicinal C. tubulosa. Estudos demonstraram os efeitos terapêuticos dos glicosídeos de Cistanche e ECH,verbascosídeo(VER) e icariína (ICA) na doença de Alzheimer (DA), DP e outros pacientes com demência vascular (Urano e Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) sugeriram que extratos de C. tubulosa que continham ECH e acteosídeo suficientes melhoraram a disfunção cognitiva causada por A -42 por meio do bloqueio da deposição de amiloide e da reversão da função neuronal dopaminérgica colinérgica e do hipocampo. Tao et al. (2015) descobriram queglicosídeos feniletanóidesde C. tubulosa (Ph Gs-Ct) preveniu o edema cerebral em grandes altitudes, diminuindo a expressão de proteína e mRNA de AQP4 no tecido cerebral de modelos de ratos.

EXTRATO NATURAL DE CISTANCHE TUBULOSA MELHORA A MEMÓRIA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Estudos anteriores mostraram que compostos fitoterápicos chineses, incluindo os três ingredientes de C. tubulosa, epimedium e rhizoma polygonati, aliviaram os danos aos neurônios dopaminérgicos e aumentaram os níveis de dopamina, regulando a expressão de fatores neurotróficos (Wu et al., 2013). Assim, ainda não se sabe se os efeitos neuroprotetores induzidos por C. tubulosa são duradouros e até que ponto o resgate de neurônios DA nigrais pela administração de GDNF pode proporcionar uma preservação significativa de comportamentos motores relevantes para a sintomatologia de animais com DP. Este estudo utilizou uma receita de tonificação renal da MTC, nanopó de C. tubulosa, que recebeu uma patente nacional (número de patente: 2011103028541) na China e já mostrou um certo efeito terapêutico na DP. O presente estudo, portanto, foi desenhado para examinar os efeitos neuroprotetores e regenerativos do tratamento com C. tubulosa e para investigar a apoptose nas células MES23.5 e ratos comportamentais definitivos, e a regulação do GDNF, conforme medido por uma bateria de testes-alvo .

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais, Reagentes e Equipamentos

C. tubulosa foi adquirida do Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Pequim, China. ECH, VER e ICA vieram dos Institutos Nacionais de Controle de Alimentos e Medicamentos da China. A linha celular neuronal dopaminérgica MES23.5 foi um presente do Professor Biao Chen, Laboratório de Neurobiologia, Capital Medical University, Pequim, China. Cinquenta camundongos machos C57BL / 6 (pesando 20-25 g cada) foram adquiridos da Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (número de licença: SCXK 2012-0002), Xangai, China.

MPP +, MTT e glutamina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, EUA); O meio DMEM / F12 e o soro fetal bovino foram adquiridos à Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA); e MPTP, padrão DA e padrão de ácido homovanílico (HVA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, EUA). -actina, Bax, Bcl2, GDNF, receptor alfa da família GDNF (GFR 1) e anticorpos Ret foram adquiridos da Cell Signaling Technology, Inc. O kit de reagentes de coloração 3,3'-diaminobenzidina (DAB) foi adquirido à Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. e o kit de preparação de amostras de gel SDS-PAGE, o kit de detecção ultrassensível de quimioluminescência aprimorada (ECL) e o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) foram adquiridos no Beyotime Institute of Biotechnology (Pequim, China).

Este estudo utilizou os seguintes instrumentos: leitor de microplacas ELX800 (Bio Tek Winooski, VT, EUA); Incubadora de CO2 (Heraeus, Hanau, Alemanha); Sistema de análise de imagens em gel Gel DOC 2000, célula de eletroforese e tanque de eletroforese (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA); analisador de proteínas DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EUA); Centrífuga refrigerada de alta velocidade 5417R (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha); Moinho de bolas planetário duplo SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, China); Moinho misturador MM400 (Retsch GmbH, Haan, Alemanha); Cromatografia líquida de alta eficiência Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA); Eletroforese PowerPac Basic, sistema de transferência transmembrana PowerPac Basic, gerador de imagens de quimioluminescência Universal Hood II, sistema de transcrição reversa de RNA do Thermal Cycler S1000 (Bio-Rad); Sistema de análise de imagens de tecidos e células Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China).

Preparação deC. tubulosaNanopó

C. tubulosa foi pesada, depois purificada e desidratada. Após a pulverização convencional, o pó fino de C. tubulosa foi passado por uma peneira 200-de malha e liofilizado. Um vácuo com temperatura controlada e um moinho de bolas de alta energia foram usados ​​para preparar o nanopó de C. tubulosa. Primeiro, o nanopó bruto de C. tubulosa foi colocado em um tanque de moagem a vácuo que foi carregado com bolas de moagem de metal duro. A proporção entre as esferas de moagem e o nanopó de C. tubulosa variou de 15:1 a 5:1. Para obter um pó fino, a velocidade e a duração do moinho de bolas de alta energia foram ajustadas para 300 rpm e 20 min, respectivamente. O pó fino foi pesado para processamento de materiais em nanoescala e processado no moinho misturador com frequência de 25/s e oscilação de 20s por três repetições. PBS foi usado para dissolver e preparar uma solução estoque de 25 mg/mL, seguida de 30 min de ultrassom, autoclavagem e, finalmente, armazenamento a -20◦C.

Controle de Qualidade dos Componentes Ativos deC. tubulosapor HPLC

O ECH e VER continham eluição gradiente com sílica ligada a octadecilsilano como enchimento, metanol como fase móvel A e 0 solução de ácido fórmico a 1% como fase móvel B. O comprimento de onda de detecção foi de 330 nm. O ICA continha eluição gradiente com sílica ligada a octadecilsilano como carga e acetonitrila-água (30:70) como fase móvel. O comprimento de onda de detecção foi de 270 nm. A amostra, o controle e o controle negativo foram medidos como 10 µL cada para o teste.

Cultura Celular e Ensaio MTT para Medir a Viabilidade do MPP+-Células tratadas

Células MES23.5 foram inoculadas com 5% de soro fetal de bezerro, 1% de glutamina, 2% de solução 50× Sato e meio DMEM/F12 com 2% de penicilina/estreptomicina. Eles foram incubados a 37◦C em uma incubadora com 5% de CO2 e umidade saturada. As células foram isoladas e passadas com tripsina a 0,25% e a suspensão celular foi colhida na fase de crescimento logarítmico. Células isoladas com densidade de 1 × 105 foram semeadas em placas de 96-poços revestidas com polilisina, seguidas pela adição de diferentes concentrações finais (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 e 800 µmol/L ) da mídia MPP+. Células MES23.5 que foram incubadas com meio de cultura normal por 24 horas e 48 horas foram utilizadas como controles negativos nos experimentos in vitro. As células dos diferentes grupos de tratamento foram incubadas com reagente MTT durante 4 h. A solução nos poços foi posteriormente descartada e 150 µL de DMSO foram adicionados e oscilados por 10 min. A absorvância de cada amostra a um comprimento de onda de 570 nm foi medida utilizando um leitor automático de microplacas. A percentagem de viabilidade celular (%)=absorvância média do grupo experimental/absorvância média do grupo de controlo negativo × 100%.

Concentrações relevantes de meio MPP+ foram adicionadas para o tratamento de 24-hora em células MES23.5 usando a mesma abordagem da cultura in vitro. Após o tratamento, a solução do poço foi descartada. Meios contendo diferentes concentrações (10, 50, 100, 200, 250, 500 e 1000 µg/mL) de nanopó de C. tubulosa foram adicionados às células MES23.5 em diferentes poços e deixados para incubar por 24 horas e 48 horas. As células MES23.5 que foram incubadas com meio de cultura normal por 24 horas e 48 horas foram utilizadas como controles negativos. As células MES23.5 que foram incubadas com meio MPP+ foram utilizadas como veículo. As medições foram feitas em triplicado para cada amostra. A absorvância dos grupos de tratamento e controle correspondentes foi medida para calcular a viabilidade celular.

EXTRATO NATURAL DE CISTANCHE TUBULOSA ANTI FADIGA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Expressão de TH medida por imunocitoquímica

Quando o nanopó de C. tubulosa estava em 100, 200 e 250 µg/ml, a taxa de sobrevivência celular aumentou significativamente (Figura 2G). Assim, em experimentos subsequentes, testamos as três concentrações: grupos de dose baixa, dose média e dose alta. Três repetições foram testadas para cada um dos grupos de C. tubulosa. Lamelas esterilizadas revestidas com polilisina foram colocadas em placas de 6-poços. Em seguida, 5 x 104 células foram semeadas em cada poço e incubadas por 24 h. O meio fresco convencional foi substituído no grupo de controle normal e uma concentração final de 100 µmol/L de meio MPP+ foi substituída nos demais grupos de tratamento para incubar por 24 h. Meios frescos convencionais foram então substituídos nos grupos controle normal e veículo, e concentrações finais de 100, 200 e 250 µg/mL de nanopó de C. tubulosa foram incubadas com as células por 24 h em doses baixas, moderadas e altas. grupos de tratamento de C. tubulosa, respectivamente. As células MES23.5 nos diferentes grupos foram lavadas três vezes em PBS para remover o sobrenadante e posteriormente fixadas em paraformaldeído a 4% durante 15 min. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com bloqueador de peroxidase a 37◦C por 30 min e depois lavadas novamente com PBS. Uma solução de Triton X-100 a 0,2% foi usada para permeabilização celular por 10 min, seguida de lavagem com PBS. Soro de cabra normal foi adicionado a cada amostra e incubado à temperatura ambiente durante 30 min. O soro normal de cabra foi então removido e o anticorpo primário diluído 1:400 em PBS foi adicionado a cada amostra e incubado a 4◦C durante a noite. As células do grupo de controle negativo foram incubadas com PBS a 4◦C durante a noite. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpos secundários marcados com biotina na câmara úmida a 37◦C por 20 min. Cada amostra foi então lavada em PBS e marcada com conjugados de peroxidase de rábano-estreptavidina (solução de trabalho C) a 37◦C por 20 min. Após lavagem com PBS, as células foram coradas com reagente DAB no escuro durante aproximadamente 1 a 10 min e o desenvolvimento de uma cor castanha foi monitorizado sob microscopia óptica. Cada amostra foi então lavada duas vezes em água destilada por 1 a 2 minutos e os núcleos foram contrastados com solução de hematoxilina por 0,5 a 1 minuto. Depois de enxaguar completamente cada amostra em água, as células foram imersas em álcool de ácido clorídrico a 1% para diferenciação e amónia aquosa a 1%, seguido de lavagem completa das células em água. As células de cada amostra foram então desidratadas em etanol a 70% por 2 min, etanol a 80% por 2 min, etanol a 90% por 2 min duas vezes, etanol a 95% por 2 min duas vezes e etanol a 100% por 2 min duas vezes. As células foram então imersas em solução de xileno por 2 minutos duas vezes e montadas em lâmina de vidro com resinas neutras. Sob microscopia óptica, cada amostra foi submetida à captura de imagens e seleção aleatória de 5 a 10 campos visuais efetivos para determinar a expressão de proteínas selecionadas em neurônios dopaminérgicos indicada pela intensidade das partículas marrons e para semiquantificar o conteúdo proteico pelo seu valor médio de cinza. .

Taxa de apoptose de células MES23.5 medida por citometria de fluxo

As células aderentes foram lavadas uma vez com PBS. Para isolamento celular, uma quantidade apropriada de solução de tripsina isenta de EDTA foi adicionada à temperatura ambiente e a solução foi pipetada suavemente para permitir o desprendimento das células aderentes. Um meio de cultura celular foi então adicionado para interromper a tripsinização. A mistura foi transferida para um novo tubo de centrífuga e depois centrifugada por 5 min a 1500 rpm para coletar as células isoladas. Após descartar o sobrenadante, o sedimento celular foi ressuspenso suavemente utilizando PBS e as células foram contadas. Aproximadamente 1 x 105 a 5 x 105 células ressuspensas foram centrifugadas durante 5 min a 1500 rpm e o sobrenadante foi descartado. Cinco microlitros de solução de ligação de Anexina V-FITC foram adicionados ao sedimento celular para ressuspender suavemente as células. Outros 5 µL de Anexina V-FITC foram adicionados e bem misturados. Cinco microlitros de solução de iodeto de propídio foram utilizados para coloração celular por incubação à temperatura ambiente durante 10 min, pouco antes da citometria de fluxo.

Análise Western Blot paraem vitro

As células foram divididas em grupo normal, grupo de tratamento MPP+, grupo de tratamento com dose baixaC. tubulosagrupo de tratamento, grupo de tratamento com dose moderada de C. tubulosa e grupo de tratamento com dose alta de C. tubulosa. A expressão de Bcl2 e Bax foi medida em cada um. Um total de 1 × 105 células por poço na placa de 6-poços foram usadas para modelagem e tratamento em cada grupo antes da colheita de células. Um lisado misto, contendo tampão RIPA, inibidor de protease e inibidor de fosfatase, foi adicionado para lisar as células durante 30 min em gelo. Após centrifugação, o sobrenadante foi utilizado para análise proteica. A proteína total foi quantificada utilizando um ensaio BCA e separada por SDS-PAGE a 10%. As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana e incubadas com tampão bloqueador de leite desnatado a 5% à temperatura ambiente durante 2 h. A membrana foi então incubada em anticorpo primário (Bcl-2 00,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, diluição 1:200) a 4◦C durante a noite. Após uma etapa de lavagem, a membrana foi incubada em anticorpo secundário (0,5 mg/ml, diluição 1:5000) a 4◦C por 1 h e depois em revelador ECL por 2 min para revelação convencional. O software Quantidade Um foi utilizado para a análise semi-quantitativa da expressão proteica.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA ANTI FADIGA PROTEGE FÍGADO PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Modelagem Animal Experimental e Administração de Medicamentos

Cinquenta camundongos machos livres de patógenos específicos com 8- semanas de idade foram divididos aleatoriamente em cinco grupos: um grupo normal, grupo de tratamento com MPTP (veículo), grupo de tratamento com dose baixa de C. tubulosa, tratamento com dose moderada de C. tubulosa grupo e grupo de tratamento com altas doses de C. tubulosa. Os animais foram alojados entre 20 e 22◦C, com livre acesso a comida e água. Os ratos do grupo normal foram injetados intraperitonealmente com igual volume de solução salina normal durante sete dias consecutivos. Os camundongos nos outros grupos de tratamento foram injetados intraperitonealmente com MPTP (30 mg/kg/d) durante sete dias consecutivos para estabelecer veículos.

Durante a modelagem de DP, os camundongos nos grupos de tratamento de C. tubulosa com dose baixa, dose moderada e dose alta receberam intragastricamente volumes clínicos equivalentes de 4 g/kg/d, 8 g/kg/d e 16 g/d. kg/dNanopó de C. tubulosa, respectivamente, por 14 dias consecutivos. Os camundongos nos grupos controle e veículo receberam volumes equivalentes de solução salina normal por via intragástrica durante 14 dias consecutivos. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Fujian do TCM e foram realizados de acordo com os princípios internacionalmente aceitos para uso e cuidado de animais de laboratório. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais neste estudo.