Clonagem, identificação funcional e análise de expressão da chalcona sintase de Cistanche Tubulosa

Resumo: Objetivo Estudar a função da chalcona sintase de Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) e o padrão de expressão do gene CtCHS em flores brancas, vermelhas e roxas.

Métodos O gene CtCHS foi clonado por RT-PCR e realizada análise bioinformática. O plasmídeo pET-28a-CtCHS foi transferido para Escherichia coli para induzir a expressão proteica por IPTG. A proteína recombinante CtCHS foi incubada com os substratos p-coumaroil CoA e malonil CoA, e os produtos foram detectados por HPLC e MS. O plasmídeo pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS foi transferido para o protoplasto de Arabidopsis thaliana para observar a localização subcelular da proteína CtCHS. O padrão de expressão do gene CtCHS nas flores deC. tubulosacom três cores foi detectado por qRT-PCR.

Resultados Um gene CtCHS foi clonado. O comprimento do quadro de leitura aberto (ORF) foi de 1173 pb, codificando 390 aminoácidos, e o peso molecular da proteína foi 42 8000. CtCHS continha os resíduos catalíticos Cys164, His303, Asn336, que foram conservados em chalcona sintase. A proteína CtCHS foi expressa em E. coli e purificada para obtenção da proteína recombinante. A proteína CtCHS poderia catalisar p-cumaroil CoA e malonil CoA para produzir naringenina chalcona. A proteína CtCHS estava localizada principalmente no citoplasma. O gene CtCHS foi altamente expresso em flores roxas e vermelhas, e os níveis relativos de expressão foram 8,44 e 3,21 vezes maiores que em flores brancas, respectivamente.

Conclusão Um gene CtCHS foi clonado da flor deC. tubulosae a proteína foi expressa. A proteína CtCHS tem função de chalcona sintase, e a expressão do gene CtCHS é maior em flores mais escuras, indicando que o gene CtCHS pode regular a cor da flor de C. tubulosa, o que estabelece uma base para futuras pesquisas sobre amecanismo de regulação da cor da flor de C. tubulosa.

Palavras-chave:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalcona sintase; análise de atividade enzimática; localização subcelular; análise de expressão

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O biossintéticocaminho dos flavonóidescomeça com a via dos fenilpropanóides.Fenilalaninaé primeiro convertido em ácido cinâmico sob oação da fenilalanina amonialiase(PAL), e o ácido cinâmico é 4-hidroxilado pelo ácido cinâmico. A enzima (ácido cinâmico-4-hidroxilase, C4H) e 4-cumaratecoenzima A ligase (4-cumaratecoenzima A ligase, 4CL) catalisam a reação para gerar 4-cumaroil-CoA [11 ]. Uma molécula de 4-cumaroil-CoA e três moléculas de malonil-CoA são catalisadas pela chalcona sintase (CHS) para gerar naringenina chalcona, que possui compostos flavonóides O esqueleto básico da chalcona isomerase, flavanona-3-hidroxilase, diidroflavonol 4- redutase, etc. gera uma variedade de flavonóides, como isoflavonas, flavonóis, antocianinas, etc. Como uma enzima chave na via biossintética dos flavonóides, o CHS regula o conteúdo de flavonóides nas plantas e também desempenha um papel importante na regulação da cor das flores das plantas [13]. Por exemplo, o silenciamento gênico pós-transcricional de Gentiana scabra Bunge CHS pode inibir a biossíntese de antocianinas e causar branqueamento específico dos lóbulos da corola [14]. Silenciamento do gene CHS de Actinidia erianthaBenth. CHS reduz o teor de antocianinas nas pétalas e torna-as vermelhas. As pétalas ficam com uma cor mais clara[15]. Portanto, neste estudo, um gene CtCHS foi clonado de flores de Cistanche tubulosa, e análise de bioinformática, expressão e purificação procariótica, análise de atividade enzimática, análise de localização subcelular e análise de expressão em três cores de flores foram realizadas para explorar a função de CtCHS A proteína e o padrão de expressão do gene CtCHS foram usados ​​para explorar preliminarmente a relação entre CtCHS e a cor da flor Cistanche tubulosa, o que lançou as bases para o estudo do mecanismo regulatório deCor da flor Cistanche tubulosa.

1 Materiais e instrumentos

1.1 Materiais

Flores de Cistanche tubulosa foram coletadas no condado de Yutian, província de Hotan, Xinjiang em maio de 2018. O princípio aleatório foi seguido durante a amostragem, e flores de Cistanche tubulosa com bom estado fisiológico e altura de planta consistente foram selecionadas. Três cepas de Cistanche tubulosa com três cores de flores brancas, vermelhas e roxas foram colhidas e identificadas como Cistanche tubulosa (Schenk) Wight pelo professor Tu Pengfei da Escola de Farmácia da Universidade de Pequim. Eles foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e depois transportados para Pequim em armazenamento com gelo seco. Células quimicamente competentes de E. coli DH5 foram adquiridas à Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., e células quimicamente competentes de E. coli BL21 (DE3) foram adquiridas à Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP O vetor foi adquirido do Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. O malonil-CoA foi adquirido da Sigma Company, 4-coumaroil-CoA, naringenina -chalcona foi adquirida da Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., e a naringenina foi adquirida da Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumentos

Espectrofotômetro Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, EUA); instrumento de PCR gradiente (Eppendorf Company, Alemanha); Instrumento de PCR quantitativo de fluorescência CFX 96, gerador de imagens em gel UVP, instrumento de eletroforese em gel, instrumento de eletroforese de proteínas (BioRad Company, EUA); EnSpire

Leitor de microplacas (PerkinElmer Company, EUA); incubadora de temperatura constante (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Oscilador de temperatura total de grande capacidade DHZ-D (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Um oscilador de temperatura constante em banho-maria (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Bancada de trabalho ultralimpa AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); esterilizador a vapor de alta pressão (TOMY Company, Japão); instrumento de água pura Milli Q (Millipore, Estados Unidos); LC-20Um cromatógrafo de fase líquida de alta eficiência (Shimadzu Company, Japão); espectrometria de massa de alta resolução UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, EUA); Microscópio confocal a laser FV1200 (Olympus Company, Japão).

2 métodos experimentais

2.1 Extração de RNA e síntese de cDNA.

Flores de Cistanche tubulosa foram moídas em nitrogênio líquido e depois submetidas ao ensaio de extração de RNA.

O RNA total foi extraído usando um kit (Norgen, Cat 17200), a concentração e a qualidade do RNA foram detectadas pelo NanoDrop 2000C, e amostras de RNA com proporção A260/A280 entre 1,8 e 2,1 foram selecionadas para transcrição reversa para sintetizar cDNA. A transcriptase reversa M-MLV (Promega, M170B) foi usada para transcrever reversamente o RNA total qualificado em cDNA. As operações experimentais foram realizadas de acordo com as instruções.

2.2 Clonagem do gene CtCHS

Com base nos dados do transcriptoma da flor Cistanche tubulosa do nosso grupo de pesquisa [16], um CtCHS com um quadro de leitura aberto completo foi selecionado e o software SnapGene foi usado para projetar primers específicos com base na sequência do gene (Tabela 1). A amplificação por PCR foi realizada utilizando cDNA de flor de Cistanche tubulosa como modelo. O sistema de amplificação foi 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, primers upstream e downstream (10 μmol/L) 2 μL cada, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. As condições de reação foram: pré-desnaturação a 95 graus por 3 min; 25 ciclos de desnaturação a 95 graus por 15 s, recozimento a 55 graus por 15 s e extensão a 72 graus por 1 min; extensão da reação a 72 graus por 5 min. O produto de PCR foi detectado por eletroforese em gel de agarose a 1%, e o kit de purificação de DNA (Novizan, Cat DC301-01) foi usado para recuperação de gel, e então o DNA recuperado foi purificado por um kit de clonagem rápida (Novizan, Cat C601-01). O fragmento de DNA foi ligado ao vetor pCE2TA/Blunt-Zero, transformado em células competentes de Escherichia coli DH5, e após cultura durante a noite a 37 graus, cepas de clone único foram selecionadas e enviadas à empresa para sequenciamento.

Tabela 1 Sequências de primers

2.3 Análise bioinformática

Use o software online ProtParam para analisar propriedades físicas e químicas de proteínas; usar a ferramenta online Prot Scale para analisar a hidrofilicidade/hidrofobicidade das proteínas; usar a ferramenta online SOPMA para prever a estrutura secundária da proteína; usar o software de análise on-line SWISS-MODEL para prever a estrutura terciária da proteína; use o software online TMHMM Preveja a estrutura transmembrana da proteína; usar o software DNAMAN para comparar a homologia de CtCHS com as sequências de aminoácidos CHS de outras espécies; usar o software MEGA-X para construir uma árvore filogenética, usando junção de vizinhos (NJ) e correção de Poisson. A distância evolutiva é calculada usando o método Bootstrap, e o número de repetições de Bootstrap é 1000 vezes.

2.4 Expressão e purificação procariótica de CtCHS

Projetar primers com locais de restrição BamHⅠ e XhoⅠ com base na sequência CtCHS e amplificar por PCR os fragmentos alvo correspondentes. O vetor pET-28a e o fragmento alvo foram digeridos usando as endonucleases BamHI e A cepa clonada é sequenciada e o plasmídeo é extraído após o sequenciamento correto. O plasmídeo pET-28a-CtCHS verificado por sequenciamento foi transferido para células competentes de Escherichia coli BL21 (DE3). Consulte o método de Ding Ning et al. [17] com isopropil

-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) foi utilizado para induzir a expressão proteica em baixa temperatura e foi purificado através de coluna de cromatografia de afinidade com Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). A proteína foi concentrada por centrifugação em tubo de ultrafiltração (Millipore, 30 000) e dessalinizada. Armazenar em tampão KPB 20 mmol/L (pH 8,0, contendo 1 mmol/LEDTA) e armazenar em geladeira de -80 graus para armazenamento a longo prazo.

2.5 Análise da atividade enzimática CtCHS

Sistema de reação enzimática CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-cumaroil-CoA 2 μL, CtCHS recombinante proteína 20 μL, em Após reagir em banho-maria a 37 graus por 12 horas, a mistura foi extraída três vezes com 800 μL de acetato de etila, seca por fluxo de nitrogênio e depois dissolvida em 100 μL de metanol. Use cromatografia líquida de alta eficiência para detectar o produto. As condições são coluna Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), temperatura da coluna 30 graus, volume de amostra 10 μL e água (A) e acetonitrila (B) como fluxo. Fase, gradiente de eluição: 0~10

min, 30% de B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% de B; 25~30 min, 70%~80%B; 30~35 min, 80%~100% de B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. A vazão volumétrica é de 1 mL/min e a detecção ocorre em um comprimento de onda de 290 nm.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS foi usado para detecção adicional. As condições da fase líquida foram coluna Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3,0 mm, 1,7 μm), temperatura da coluna 40 graus, naringenina- controles de chalcona e naringenina. O volume de carga do produto é de 4 μL e o volume de carga do produto da reação enzimática é de 7 μL. Água (A)-acetonitrila (B) é usada como fase móvel. O gradiente de eluição é: 0 a 5 min, 30% B; 5 a 15 min, 30%-60%B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. A vazão volumétrica é de 0,3 mL/min. As condições de espectrometria de massa são fonte de íons de eletropulverização, nitrogênio como gás de arraste, pressão do gás de bainha 3,5 MPa, pressão do gás auxiliar 1,0 MPa, pressão de pulverização 3500 V, temperatura capilar 350 graus, temperatura de aquecimento do gás auxiliar 200 graus, modos de íons positivos e negativos, varredura faixa de íons m/z é 100-1500, a resolução completa do MS é 35 000, a resolução dd-MS2 é 17 500, (N)

CE/escalonado definido como 35, 60.

2.3 Análise bioinformática

Use o software online ProtParam para analisar propriedades físicas e químicas de proteínas; usar a ferramenta online Prot Scale para analisar a hidrofilicidade/hidrofobicidade das proteínas; usar a ferramenta online SOPMA para prever a estrutura secundária da proteína; usar o software de análise on-line SWISS-MODEL para prever a estrutura terciária da proteína; use o software online TMHMM Preveja a estrutura transmembrana da proteína; usar o software DNAMAN para comparar a homologia de CtCHS com as sequências de aminoácidos CHS de outras espécies; usar o software MEGA-X para construir uma árvore filogenética, usando junção de vizinhos (NJ) e correção de Poisson. A distância evolutiva é calculada usando o método Bootstrap, e o número de repetições de Bootstrap é 1000 vezes.

2.4 Expressão e purificação procariótica de CtCHS

Projetar primers com locais de restrição BamHⅠ e XhoⅠ com base na sequência CtCHS e amplificar por PCR os fragmentos alvo correspondentes. O vetor pET-28a e o fragmento alvo foram digeridos usando as endonucleases BamHI e A cepa clonada é sequenciada e o plasmídeo é extraído após o sequenciamento correto. O plasmídeo pET-28a-CtCHS verificado por sequenciamento foi transferido para células competentes de Escherichia coli BL21 (DE3). Consulte o método de Ding Ning et al. [17] com isopropil

-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) foi utilizado para induzir a expressão proteica em baixa temperatura e foi purificado através de coluna de cromatografia de afinidade com Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). A proteína foi concentrada por centrifugação em tubo de ultrafiltração (Millipore, 30 000) e dessalinizada. Armazenar em tampão KPB 20 mmol/L (pH 8,0, contendo 1 mmol/LEDTA) e armazenar em geladeira de -80 graus para armazenamento a longo prazo.

2.5 Análise da atividade enzimática CtCHS

Sistema de reação enzimática CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-cumaroil-CoA 2 μL, CtCHS recombinante proteína 20 μL, em Após reagir em banho-maria a 37 graus por 12 horas, a mistura foi extraída três vezes com 800 μL de acetato de etila, seca por fluxo de nitrogênio e depois dissolvida em 100 μL de metanol. Use cromatografia líquida de alta eficiência para detectar o produto. As condições são coluna Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), temperatura da coluna 30 graus, volume de amostra 10 μL e água (A) e acetonitrila (B) como fluxo. Fase, gradiente de eluição: 0~10

min, 30% de B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% de B; 25~30 min, 70%~80%B; 30~35 min, 80%~100% de B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. A vazão volumétrica é de 1 mL/min e a detecção ocorre em um comprimento de onda de 290 nm.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS foi usado para detecção adicional. As condições da fase líquida foram coluna Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3,0 mm, 1,7 μm), temperatura da coluna 40 graus, naringenina- controles de chalcona e naringenina. O volume de carga do produto é de 4 μL e o volume de carga do produto da reação enzimática é de 7 μL. Água (A)-acetonitrila (B) é usada como fase móvel. O gradiente de eluição é: 0 a 5 min, 30% B; 5 a 15 min, 30%-60%B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. A vazão volumétrica é de 0,3 mL/min. As condições de espectrometria de massa são fonte de íons de eletropulverização, nitrogênio como gás de arraste, pressão do gás de bainha 3,5 MPa, pressão do gás auxiliar 1,0 MPa, pressão de pulverização 3500 V, temperatura capilar 350 graus, temperatura de aquecimento do gás auxiliar 200 graus, modos de íons positivos e negativos, varredura faixa de íons m/z é 100-1500, a resolução completa do MS é 35 000, a resolução dd-MS2 é 17 500, (N)

CE/escalonado definido como 35, 60.

2.6 Localização subcelular da proteína CtCHS

Com base na sequência CtCHS e no princípio da clonagem contínua, foram desenhados iniciadores com locais de corte enzimático Kpn Ⅰ e BamH Ⅰ, e os fragmentos alvo correspondentes foram amplificados por PCR. O plasmídeo pCAMBIA1300-35S-GFP foi digerido com endonucleases de restrição Kpn Ⅰ e BamH Ⅰ, e o fragmento alvo e o vetor foram conectados através do kit de clonagem contínua (Novizan, Cat C115-01) e depois transferidos em células competentes de E. coli DH5. , selecione cepas de clone único para sequenciamento e extraia plasmídeos das cepas corretas. Os plasmídeos pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS e pCAMBIA 1300-35S-GFP foram transformados em protoplastos de Arabidopsis thaliana usando PEG4000 e cultivados sob luz fraca por 8 a 10 h. A localização subcelular da proteína CtCHS foi observada sob microscópio confocal a laser.

2.7 Análise do padrão de expressão CtCHS

Iniciadores quantitativos fluorescentes em tempo real foram projetados usando DNAMAN baseado na sequência CtCHS, com F-box como gene de referência interno. As sequências de primers são mostradas na Tabela 1. A expressão relativa de CtCHS em flores de Cistanche tubulosa de diferentes cores foi detectada por PCR quantitativo fluorescente em tempo real. Use TransStart Green qPCR SuperMix (full gold, AQ101-02) para medir com o método de corante fluorescente SYBRGreen. Sistema de reação: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, primers upstream e downstream (10 μmol/L) 0,2 μL cada, modelo de cDNA 0,5 μL, 4,1 μL de água livre de nucleotidase foram usados para a reação usando um método de duas etapas. O procedimento de reação foi baseado no método de Dong Xianjuan et al. [18]. Cada amostra continha 3 réplicas biológicas e o experimento foi repetido três vezes. Os dados experimentais foram analisados ​​​​no Excel, a expressão relativa de CtCHS foi calculada pelo método 2-ΔΔCt e o GraphPadPrism 8 foi utilizado para realizar análises de significância e desenhar histogramas.