Cistanche Tubulosa protege neurônios dopaminérgicos através da regulação da apoptose e do fator neurotrófico derivado de células gliais: in vivo e in vitro

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa com a característica patológica de dopamina nigroestriatal reduzida. Na prática clínica da medicina tradicional chinesa (MTC), o nanopó de Cistanche tubulosa tem efeitos terapêuticos na DP. Para identificar o mecanismo terapêutico, este estudo testou o efeito protetor de diferentes doses de toxicidade induzida por MPP mais em células MES23.5 usando o ensaio MTT e no 1-metil-4-fenil-1 ,2,3,6-camundongos com DP induzida por tetra-hidropiridina (MPTP) (veículos). A imuno-histoquímica foi utilizada para avaliar a citomorfologia e a expressão da tirosina hidroxilase (TH). Testes comportamentais em veículos, testes de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em dopamina, imuno-histoquímica e análise de western blot foram usados ​​para detectar a expressão de TH, fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais (GDNF) e seus receptores. Nossos resultados demonstraram que o nanopó cistanche tubulosa melhorou a viabilidade das células tratadas com MPP plus, aumentou a expressão de TH e reduziu o número de células apoptóticas. Também aumentou a expressão da proteína Bcl2 e suprimiu a expressão da proteína Bax em células tratadas com MPP plus de uma maneira dependente da dose.

Além disso,cistanchetubulosa nanopowder melhorou os déficits comportamentais em camundongos veículos, reduziu a duração estacionária da natação, aumentou a capacidade de atividade espontânea e aumentou a expressão de GDNF, o receptor alfa da família GDNF (GFR 1) e Ret em células da substância negra ( SN).

Além disso, a expressão proteica de GDNF, GFR 1 e Ret aumentou após o tratamento com diferentes doses decistanchenanopó tubulosa, com diferença significativa entre os grupos de alta dose e veículo. A expressão protéica de Bcl2 e Bax foram semelhantes in vivo e in vitro, o que sugere quecistanchenanopowder tubulosa tem efeitos anti-apoptóticos em neurônios.

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Introdução

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa comum que ocorre em pessoas idosas com manifestações patológicas de perda de neurônios dopaminérgicos na substância negra (SN) devido à degeneração. A gravidade da doença está correlacionada com a perda de células neuronais de dopamina (DA) no SN, o que é consistente com a visão de que o processo neurodegenerativo progride ao longo de muitos anos antes do aparecimento de quaisquer sintomas (Sawle e Myers, 1993). A natureza progressiva da doença sugere possibilidades interessantes de intervenção terapêutica, bloqueando o processo neurodegenerativo subjacente. A busca por ações potentes e específicas induzidas por terapia de fatores neurotróficos na sobrevivência do neurônio DA é, portanto, de interesse considerável.

Fatores neurotróficos são proteínas essenciais, incluindo fator de crescimento nervoso (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF), que promovem crescimento nervoso, desenvolvimento neurológico, orientação axonal e função neuronal. Entre todos os fatores neurotróficos que protegem e promovem o reparo de neurônios dopaminérgicos, o GDNF tem os efeitos mais fortes (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). GDNF demonstrou possuir efeitos neurotróficos potentes em neurônios DA in vitro (Lin et al., 1993) e exercer efeitos neuroprotetores in vivo. Demonstrou-se que GDNF resgata neurônios DA nigral da morte celular induzida por lesão após axotomia induzida por cirurgia ou toxina em ratos (Beck et al., 1995; Kearns e Gash, 1995; Sauer et al., 1995) e parcialmente também após administração sistêmica de N-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) em camundongos (Tomac et al., 1995). O aumento da incidência de apoptose neuronal e a redução dos efeitos protetores dos fatores neurotróficos, potencialmente desencadeados por vários fatores patológicos, fundamentam a degeneração dos neurônios dopaminérgicos (Holden et al., 2006).

cistanchetubulosa é um fitoterápico originário de diversas plantas do gênero Cistanche. É uma opção terapêutica importante para a síndrome de deficiência renal que está intimamente relacionada aos hormônios andrógenos na medicina tradicional chinesa (MTC). Até o momento, muitas pesquisas clínicas e básicas sobrecistanchetubulosa mostraram as atividades de doenças neurodegenerativas. A identificação de prescrições tonificantes renais da MTC no tratamento da DP pode, portanto, fornecer um tratamento clínico alternativo para a DP. Echinacoside (ECH) é um dos principais componentes bioativos encontrados na erva medicinalcistanchetubulosa. Estudos demonstraram os efeitos terapêuticos dos glicosídeos de Cistanche e ECH, verbascoside (VER) e icariin (ICA) na doença de Alzheimer (DA), DP e outros pacientes com demência vascular (Urano e Tohda, 2010; Wang et al., 2013 ; Wu et al., 2014). Wu e outros. (2014) sugeriram que cistanche. tubulosa que continha ECH e acteoside suficientes melhoraram a disfunção cognitiva causada por A -42 por meio do bloqueio da deposição de amilóide e da reversão da função neuronal dopaminérgica colinérgica e do hipocampo. Tao et ai. (2015) descobriram que glicosídeos feniletanóides de cistanche tubulosa (Ph Gs-Ct) preveniram o edema cerebral de alta altitude diminuindo a expressão de proteína e mRNA de AQP4 no tecido cerebral de modelos de ratos.

Estudos anteriores mostraram que compostos de ervas chinesas, incluindo os três ingredientes decistanchetubulosa, epimedium e rizoma poligonal, aliviou o dano aos neurônios dopaminérgicos e aumentou os níveis de dopamina regulando a expressão de fatores neurotróficos (Wu et al., 2013).

Assim, ainda não se sabe se ocistancheos efeitos neuroprotetores induzidos por tubulosa são duradouros e até que ponto o resgate de neurônios DA nigrais pela administração de GDNF pode proporcionar uma preservação significativa de comportamentos motores relevantes para a sintomatologia de animais com DP. Este estudo usou uma receita de tonificação renal TCM,cistanchetubulosa nanopowder, que recebeu uma patente nacional (número da patente: 2011103028541) na China e já demonstrou um certo efeito terapêutico na DP. O presente estudo, portanto, foi desenhado para examinar os efeitos neuroprotetores e regenerativos decistanchetubulosa e investigar a apoptose nas células MES23.5 e comportamento definitivo de ratos, e a regulação de GDNF, medida por uma bateria de testes alvo.

Materiais e métodos

Materiais, Reagentes e Equipamentos

cistanchetubulosa foi adquirido da Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Pequim, China. ECH, VER e ICA vieram dos Institutos Nacionais de Controle de Alimentos e Medicamentos, China. A linha celular neuronal dopaminérgica MES23.5 foi um presente do Professor Biao Chen, Laboratório de Neurobiologia, Capital Medical University, Pequim, China. Cinqüenta camundongos machos C57BL/6 (pesando 20–25 g cada) foram adquiridos da Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (número de licença: SCXK2012-0002), Shanghai, China.

MPP plus, MTT e glutamina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, EUA); O meio DMEM/F12 e o soro bovino fetal foram adquiridos da Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA); e padrão MPTP, DA e ácido homovanílico (HVA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, EUA). -actina, Bax, Bcl2, GDNF, receptor alfa da família GDNF (GFR 1) e anticorpos Ret foram adquiridos da Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, EUA); O kit de reagente de coloração de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) foi adquirido de Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, China); e kit de preparação de amostra de gel SDS-PAGE, kit de detecção de quimioluminescência avançada ultrassensível (ECL) e ensaio de ácido bicinconínico (BCA) foram adquiridos do Beyotime Institute of Biotechnology (Pequim, China).

Este estudo utilizou os seguintes instrumentos: ELX800 leitor de microplacas (Bio Tek Winooski, VT, EUA); incubadora de CO2 (Heraeus, Hanau, Alemanha); Sistema de análise de imagens de gel Gel DOC 2000, célula de eletroforese e tanque de eletroforese (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA); analisador de proteína DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EUA); centrífuga refrigerada de alta velocidade 5417R (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha); moinho de bolas planetário duplo SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, China); moinho misturador MM400 (Retsch GmbH, Haan, Alemanha); Cromatografia líquida de alta performance Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA); Eletroforese PowerPac Basic, sistema de transferência transmembrana PowerPac Basic, gerador de imagens de quimioluminescência Universal Hood II, sistema de transcrição reversa de RNA termociclador S1000 (Bio-Rad); Sistema de análise de imagens de tecidos e células Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China).

Preparação decistanchetubulosa Nanopowder

cistanchetubulosa foi pesada, purificada e desidratada. Após a pulverização convencional,cistancheo pó fino de tubulosa foi passado por uma peneira 200-mesh e liofilizado. Um vácuo com temperatura controlada e um moinho de bolas de alta energia foram usados ​​para preparar ocistanchetubulosa nanopó. Primeiro, crucistanchetubulosa nanopowder foi colocado em um tanque de moagem a vácuo que foi carregado com bolas de moagem de carboneto. A proporção entre as bolas de moagem e o nanopó cistanche tubulosa variou de 15:1 a 5:1. Para obter um pó fino, a velocidade e a duração do moinho de bolas de alta energia foram ajustadas para 300 rpm e 20 min, respectivamente. O pó fino foi pesado para o processamento dos materiais em nanoescala e processado no moinho misturador com frequência de 25/s e oscilação de 20s por três repetições. PBS foi usado para dissolver e preparar uma solução estoque de 25 mg/mL, seguida por 30 min de ultrassom, autoclavagem e, finalmente, armazenamento a -20 graus.

Controle de Qualidade dos Componentes Ativos decistanchetubular por HPLC

O ECH e VER continham eluição gradiente com sílica ligada a octadecilsilano como carga, metanol como fase móvel A e 00,1 por cento de solução de ácido fórmico como fase móvel B. O comprimento de onda de detecção foi de 330 nm. O ICA continha eluição gradiente com sílica ligada a octadecilsilano como carga e acetonitrila-água (30:70) como fase móvel. O comprimento de onda de detecção foi de 270 nm. A amostra, o controle e o controle negativo foram medidos como 10 μL cada para o teste.

Cultura de células e ensaio de MTT para medir a viabilidade de células tratadas com MPP plus

As células MES23.5 foram inoculadas com 5 por cento de soro fetal de vitela, 1 por cento de glutamina, 2 por cento de solução 50× Sato e meio DMEM/F12 com 2 por cento de penicilina/estreptomicina. Eles foram incubados a 37 graus em uma incubadora de 5% de CO2 com umidade saturada. As células foram isoladas e passadas com tripsina a 0,25 por cento e a suspensão celular foi colhida na fase de crescimento logarítmico. Células isoladas com uma densidade de 1 × 105 foram semeadas em placas de poços 96-revestidas com polilisina, seguidas pela adição de diferentes concentrações finais (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 e 800 μmol/ L) de MPP mais mídia. Células MES23.5 que foram incubadas com meio de cultura normal por 24 h e 48 h foram usadas como controles negativos nos experimentos in vitro. As células dos diferentes grupos de tratamento foram incubadas com reagente MTT por 4 h. A solução nos poços foi posteriormente descartada e 150 μL de DMSO foram adicionados e oscilados por 10 min. A absorbância de cada amostra em um comprimento de onda de 570 nm foi medida usando um leitor automático de microplacas. A porcentagem de viabilidade celular (por cento)=média de absorbância do grupo experimental/média de absorbância do grupo de controle negativo × 100 por cento.

Concentrações relevantes de MPP mais meio foram adicionadas para o tratamento de 24 h em células MES23.5 usando a mesma abordagem da cultura in vitro. Após o tratamento, a solução no poço foi descartada. Meios contendo diferentes concentrações (10, 50, 100, 200, 250, 500 e 1000 ug/mL) decistanchenanopowder tubulosa foi adicionado às células MES23.5 em diferentes poços e deixado para incubar por 24 h e 48 h. As células MES23.5 que foram incubadas com meio de cultura normal por 24 h e 48 h foram usadas como controles negativos. As células MES23.5 que foram incubadas com meio MPP plus foram usadas como veículo. As medições foram feitas em triplicado para cada amostra. A absorbância dos grupos de tratamento e controle correspondentes foi medida para calcular a viabilidade celular.

Expressão de TH medida por imunocitoquímica

Quandocistanchetubulosa nanopowder estava em 100, 200 e 250 ug/ml, a taxa de sobrevivência celular aumentou significativamente (Figura 2G). Assim, em experimentos subsequentes, testamos as três concentrações: grupos de baixa dose, média dose e alta dose. Três repetições foram testadas para cada um doscistanchegrupos tubulosa. Lamelas esterilizadas revestidas com polilisina foram colocadas em 6-placas de poços. Em seguida, 5 × 104 células foram semeadas em cada poço e incubadas por 24 horas. Meio fresco convencional foi substituído no grupo de controle normal e uma concentração final de 100 μmol/L MPP mais meio foi substituído nos demais grupos de tratamento para incubar por 24 h. Os meios frescos convencionais foram então substituídos nos grupos de controle e veículo normais, e as concentrações finais de 100, 200 e 250 ug/mLcistanchetubulosa nanopowder foram incubados com as células por 24 h nas doses baixa, moderada e altacistanchegrupos de tratamento tubulosa, respectivamente. As células MES23.5 nos diferentes grupos foram lavadas três vezes em PBS para remover o sobrenadante e posteriormente fixadas em paraformaldeído a 4% por 15 min. Após a lavagem com PBS, as células foram incubadas com um bloqueador de peroxidase a 37 graus por 30 min e depois lavadas novamente com PBS. Uma solução de Triton X-100 a 0,2 por cento foi usada para permeabilização celular por 10 min, seguida de lavagem com PBS.

Soro de cabra normal foi adicionado a cada amostra e incubado à temperatura ambiente por 30 min. O soro normal de cabra foi então removido e um anticorpo primário diluído 1:400 em PBS foi adicionado a cada amostra e incubado a 4 graus durante a noite. As células do grupo de controle negativo foram incubadas com PBS a 4 graus durante a noite. Após a lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpos secundários marcados com biotina na câmara de umidade a 37 graus por 20 min. Cada amostra foi então lavada em PBS e marcada com conjugados de rábano peroxidase-estreptavidina (solução de trabalho C) a 37 graus por 20 min. Após a lavagem com PBS, as células foram coradas com reagente DAB no escuro por aproximadamente 1 a 10 minutos e o desenvolvimento de uma cor marrom foi monitorado sob microscopia de luz.

Cada amostra foi então lavada duas vezes em água destilada por 1–2 min e os núcleos foram contracorados com solução de hematoxilina por 0,5–1 min. Depois de enxaguar minuciosamente cada amostra em água, as células foram imersas em álcool de ácido clorídrico a 1 por cento para diferenciação e amônia aquosa a 1 por cento, seguido de lavagem minuciosa das células em água. As células de cada amostra foram então desidratadas em etanol 70% por 2 min, etanol 80% por 2 min, etanol 90% por 2 min duas vezes, etanol 95% por 2 min duas vezes e etanol 100% por 2 min duas vezes. As células foram então imersas em solução de xileno por 2 min duas vezes e montadas em uma lâmina de vidro com resinas neutras. Sob microscopia de luz, cada amostra foi submetida a captura de imagem e seleção aleatória de 5 a 10 campos visuais efetivos para determinar a expressão de proteínas selecionadas em neurônios dopaminérgicos indicados pela intensidade das partículas marrons e para semi-quantificar o conteúdo de proteína por seu valor médio de cinza .

Taxa de apoptose de células MES23.5 medida por citometria de fluxo

As células aderentes foram lavadas uma vez com PBS. Para o isolamento celular, uma quantidade apropriada de solução de tripsina livre de EDTA foi adicionada à temperatura ambiente e a solução foi suavemente pipetada para permitir que as células aderentes se desprendessem. Um meio de cultura celular foi então adicionado para interromper a tripsinização. A mistura foi transferida para um novo tubo de centrífuga e então centrifugada por 5 min a 1500 rpm para coletar as células isoladas. Depois de descartar o sobrenadante, o sedimento celular foi gentilmente ressuspenso usando PBS e as células foram contadas. Aproximadamente 1 × 105 a 5 × 105 células ressuspensas foram centrifugadas por 5 min a 1500 rpm e o sobrenadante foi descartado. Cinco microlitros de solução de ligação de Anexina V-FITC foram adicionados ao sedimento celular para ressuspender suavemente as células. Outros 5 μL de Anexina V-FITC foram adicionados e bem misturados. Cinco microlitros de solução de iodeto de propídio foram usados ​​para coloração celular por incubação à temperatura ambiente por 10 minutos pouco antes da citometria de fluxo.

Análise de Western Blot para in vitro

As células foram divididas em um grupo normal, MPP mais grupo de tratamento, baixa dosecistanchegrupo de tratamento tubulosa, dose moderadacistanchegrupo de tratamento tubulosa e alta dosecistanchegrupo de tratamento tubulosa. A expressão de Bcl2 e Bax foi medida em cada um. Um total de 1 × 105 células por poço na 6-placa de poços foi usado para modelagem e tratamento em cada grupo antes da colheita de células. Um lisado misto, contendo tampão RIPA, inibidor de protease e inibidor de fosfatase, foi adicionado para lisar as células por 30 min em gelo. Após a centrifugação, o sobrenadante foi utilizado para análise de proteínas. A proteína total foi quantificada usando um ensaio BCA e separada por 10 por cento SDS-PAGE. As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana e incubadas com tampão bloqueador de leite desnatado a 5% em temperatura ambiente por 2 h. A membrana foi então incubada em anticorpo primário (Bcl-2 00,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, diluição de 1:200) a 4 graus durante a noite. Após uma etapa de lavagem, a membrana foi incubada em anticorpo secundário (0,5 mg/ml, diluição 1:5000) a 4 graus por 1 hora e depois em revelador ECL por 2 minutos para revelação convencional. O software Quantity One foi usado para a análise semi-quantitativa da expressão da proteína.

Modelagem Animal Experimental e Administração de Medicamentos

Cinquenta camundongos machos de 8-semanas livres de patógenos específicos foram aleatoriamente divididos em cinco grupos: um grupo normal, grupo de tratamento com MPTP (Veículo), baixa dosecistanchegrupo de tratamento tubulosa, dose moderadacistanchegrupo de tratamento tubulosa e alta dosecistanchegrupo de tratamento tubulosa. Os animais foram alojados em 20-22 graus com livre acesso a comida e água. Os camundongos do grupo normal foram injetados por via intraperitoneal com um volume igual de solução salina normal por sete dias consecutivos. Os camundongos nos outros grupos de tratamento foram injetados intraperitonealmente com MPTP (30 mg/kg/d) por sete dias consecutivos para estabelecer os veículos.

Durante a modelagem de DP, os camundongos nas doses baixa, moderada e altacistanchegrupos de tratamento tubulosa foram administrados por via intragástrica volumes clínicos equivalentes de 4 g/kg/d, 8 g/kg/d e 16 g/kg/dcistanchenanopowder tubulosa, respectivamente, por 14 dias consecutivos. Os camundongos nos grupos controle e veículo foram administrados por via intragástrica com volumes equivalentes de solução salina normal por 14 dias consecutivos. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Fujian de TCM e foram realizados de acordo com os princípios internacionalmente aceitos para uso e cuidado de animais de laboratório. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais neste estudo.

Testes Comportamentais

Teste de Natação (Zhu et al., 2014)

A coordenação do movimento corporal em camundongos foi medida pelo teste de Natação. Os camundongos foram colocados individualmente em um tanque de água (25 cm de altura e 10 cm de diâmetro) contendo 10 cm de água e testados em um ambiente silencioso para registrar sua duração estacionária durante 5 min.

Teste de Campo Aberto (Kawai et al., 1998)

A atividade locomotora foi medida usando o teste de campo aberto. Os camundongos foram testados em um ambiente silencioso e com pouca iluminação e colocados individualmente em um recipiente de acrílico transparente de 30 cm × 30 cm × 15 cm com uma grade de separação de 6 cm × 6 cm na parte inferior. Os camundongos tiveram 10 minutos para se adaptar ao ambiente e, em seguida, a deambulação do número da grade e a frequência de criação de camundongos individuais foram medidas cinco vezes consecutivas para obter valores médios.

Amostragem de Tecido Cerebral

Antes da amostragem de tecido, os camundongos foram alimentados à vontade com livre acesso à água e receberam intervenção medicamentosa por 14 dias consecutivos. Quatro ratos em cada grupo foram selecionados e rapidamente decapitados. O SN (Bregma: −2,75 mm −2,92 mm) de cada animal foi isolado e colocado no gelo. Os tecidos cerebrais foram enxaguados com 00,9 por cento de solução gelada de cloreto de sódio para remover qualquer sangue e secos em papel de filtro antes de armazenar a -80 graus. Quatro camundongos de cada grupo foram anestesiados por via intraperitoneal e seus tórax foram abertos. Uma agulha de infusão foi então inserida no ventrículo esquerdo de cada animal. Para remover o sangue do sistema circulatório, o apêndice atrial direito foi cortado e o animal foi infundido com solução salina normal a 4 graus até o fígado ficar pálido para garantir a perfusão sucessiva. Uma vez que o efluente do átrio direito ficou claro, cada animal foi perfundido com fixador de paraformaldeído a 4 por cento. Após a perfusão, o tecido cerebral de cada animal foi cuidadosamente dissecado e pós-fixado em paraformaldeído a 4 por cento por 24 horas. Os tecidos cerebrais fixados foram então enxaguados em água corrente, desidratados em uma série graduada de soluções de etanol e limpos em solução de xileno. Seguiu-se a imersão em parafina e inclusão.

Mudanças na quantidade DA medida por HPLC

O nanopó SN de cada grupo foi colocado em um banho de gelo contendo solução de cloreto de sódio 0,9 por cento (proporção 1:9). O tecido cerebral foi homogeneizado usando um disruptor celular ultrassônico e centrifugado a 1200 rpm por 20 min a 4 graus para obter o sobrenadante. Para HPLC, foi utilizada uma coluna Hypersil AA-ODS (2,1 mm × 200 mm, 5 μm) a 30 graus de temperatura da coluna. A detecção de fluorescência foi realizada em 280 nm λex e 340 nm λem. O volume de injeção foi de 10 μL.

Expressão de TH, GDNF, GFR 1 e Ret detectados por imuno-histoquímica

Seções de parafina (5 μm de espessura) de tecido cerebral individual foram isoladas de cada animal e colocadas em um banho de água morna a 40 graus para achatar e aderir às lâminas de vidro. Todas as lâminas de tecido foram incubadas em um forno de 60 graus por 3 a 6 horas, seguidas de desparafinação com xileno, desidratação com gradiente de etanol e recuperação de antígeno por incubação em um tampão de ácido cítrico e aquecimento em micro-ondas por 20 minutos. As lâminas de tecido foram então incubadas em uma solução de H2O2 a 3 por cento em temperatura ambiente por 10 min. Após três lavagens em PBS, as lâminas de tecido foram incubadas com soro normal em câmara fechada à temperatura ambiente por 20 min. A coloração imuno-histoquímica foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Um analisador de imagem Motic Med 6.0 foi usado para calcular o valor da densidade óptica integrada nas células coradas positivamente.

Análise de Western Blot em Tecidos Cerebrais de Camundongos

Este estudo avaliou a expressão proteica de tirosina hidroxilase (TH), GDNF, GFR 1, Ret, Bcl2 e Bax. O lisado cerebral de cada grupo foi homogeneizado por 3{{10}} min em gelo, seguido de centrifugação em baixa temperatura, 20,000 rpm, a 4 graus por 5 min para coletar o sobrenadante. As amostras de proteína foram separadas sob pressão constante usando um gel SDS-PAGE de 10 por cento, conforme descrito acima. A concentração primária do anticorpo: TH 0,15 mg/ml, GDNF 0,5 mg/ml, GFR 1 0,8 mg/ml, Ret 0,63 mg/ml, Bcl-2 0,34 mg/ml e Bax 0,11 mg/ml. O procedimento foi o mesmo descrito acima.

Análise Estatística

Este estudo utilizou o software estatístico SPSS 20.0 para processamento e análise de dados. Os valores dos parâmetros foram expressos como média ± desvio padrão (x¯

± S). ANOVA foi usada para análise de dados de fator único. O teste LSD ou Games-Howell foi usado para comparar os grupos. P < 0.05 (ou P < 0,01) foi considerada uma diferença estatisticamente significativa.

Resultados

Os componentes ativos decistanchetubulosa Nanopowder

Na faixa de varredura de 200 a 400 nm, ECH emcistanchetubulosa e VER em 330 nm tiveram o pico máximo de absorção, que apareceu em 20 min. A ICA apresentou picos máximos de absorção em 270 nm e apareceu após 20 min (Figura 1A). Os resultados mostraram que as amostras negativas não interferiram na detecção (Figura 1B). As amostras e o controle tinham os mesmos picos cromatográficos e a amostra negativa não tinha nenhum. Isso mostrou que os outros ingredientes da amostra não interferiram no componente medido. Além disso, os três componentes e os picos adjacentes podem atingir a linha de base de separação e o grau de separação foi maior que 1,5.

cistanchetubulosa Nanopowder MPP reduzido mais - Citotoxicidade induzida em células MES23.5

A viabilidade das células MES23.5 foi significativamente reduzida com concentrações crescentes de MPP plus. A Figura 2F mostra a citotoxicidade significativa de diferentes concentrações de MPP plus.

cistanchenanopowder tubulosa reduziu a citotoxicidade induzida por MPP plus e aumentou a viabilidade das células MES23.5. A Figura 2G mostra quecistanchedosagens de nanopó tubulosa de 10–250 ug/mL exerceram efeitos protetores dependentes da dose nas células MES23.5 tratadas com MPP plus.

Efeito citomorfológico decistanchetubulosa Nanopowder

As células MES23.5 normais tinham boa adesão celular e eram fusiformes com limites celulares e sinapses claros. Células MES23.5 danificadas por MPP mais apresentaram fraca adesão celular e encolhimento, e muitas foram suspensas no meio com sinapses contraídas. Essas células foram agregadas, encolhidas e arredondadas com vacúolos no interior, e os núcleos foram desintegrados ou colapsados.cistancheO nanopó de tubulosa em diferentes dosagens melhorou a citomorfologia das células MES23.5 em diferentes graus, melhorando a adesão celular e a depuração sináptica do grupo veículo. Células MES23.5 na dose altacistancheo grupo de tratamento tubulosa mostrou morfologia semelhante ao grupo de controle normal (Figuras 2A–E).

Efeito decistancheNanopowder tubulosa na Expressão TH e Apoptose nas Células

A Figura 3 mostra uma redução significativa na expressão da proteína TH no grupo veículo. A expressão da proteína TH aumentou de forma diferente nos grupos tratados com diferentes dosagens decistanchetubulosa. No entanto, o teste LSD mostrou que não houve diferença significativa entre os três grupos tratados.

A Figura 4 mostra os resultados da avaliação da apoptose usando citometria de fluxo. A taxa de apoptose no grupo veículo foi significativamente maior do que nos outros grupos. Células tratadas com diferentes dosagens decistanchenanopowder tubulosa mostrou diferentes graus de declínio na taxa apoptótica em comparação com o grupo veículo. Células em dose média e altacistanchegrupo de tratamento tubulosa teve a melhora mais significativa na taxa apoptótica em comparação com o outrocistanchegrupos de tratamento tubulosa. O teste LSD mostrou que não houve diferença significativa entre os dois grupos tratados, mas uma diferença significativa entre o grupo de baixa dose para eles.

Efeito decistancheNanopowder tubulosa na Expressão da Proteína Bcl2/Bax nas Células

A Figura 5 mostra que a expressão da proteína Bcl2 nas células do grupo veículo foi significativamente menor em comparação com o grupo controle normal. Em contraste, a expressão da proteína Bax nas células do grupo veículo foi significativamente maior do que no grupo controle normal.cistanchegrupos de tratamento tubulosa mostraram aumento da expressão da proteína Bcl2 e diminuição da expressão da proteína Bax em células MES23.5 tratadas com MPP plus. Entre os três grupos tratados, houve diferenças significativas no teste LSD. Estes efeitos foram dependentes da dose.

Testes Comportamentais

Os resultados do teste de Natação sugeriram que os camundongos do grupo veículo tiveram durações estacionárias relativamente longas, que aumentaram com o tempo. No dia 14, os camundongos do grupo veículo tiveram uma duração estacionária significativamente mais longa do que os camundongos do grupo controle normal. A duração estacionária dos camundongos na dose baixacistanchegrupo de tratamento tubulosa não foi significativamente diferente dos camundongos no grupo veículo. No entanto, a duração estacionária dos camundongos no grupo de alta dosecistanchegrupo de tratamento tubulosa foi significativamente menor do que a dos camundongos no grupo de veículo.

Os resultados do teste de campo aberto sugerem que após o dano induzido por MPTP nos camundongos, os camundongos do grupo do veículo demonstraram um declínio significativo em sua capacidade de atividade espontânea, conforme mostrado pela frequência de criação. Após uma administração de 14-dia decistanchetubulosa nanopowder, os camundongos nos grupos de tratamento de dose moderada e alta tiveram frequências de criação significativamente mais altas em comparação com os camundongos no grupo de veículo (Figuras 6A, B).

Efeito decistanchetubulosa Nanopowder em conteúdo DA em camundongos

Alterações no teor de DA do SN foram determinadas por HPLC. Verificou-se que o conteúdo de DA no cérebro do grupo veículo foi significativamente reduzido. O conteúdo de DA no cérebro de camundongos com DP na dose baixacistanchegrupo de tratamento tubulosa não diferiu significativamente dos camundongos no grupo de veículo. No entanto,cistancheO tratamento com tubulosa aumentou os níveis de DA no cérebro de camundongos com DP de maneira dose-dependente. Os cérebros de camundongos com DP tratados com altas dosescistanchetubulosa tinha um teor de DA significativamente maior do que os cérebros de camundongos no grupo do veículo (Figura 6C).

Efeito decistanchetubulosa Nanopowder na expressão TH em camundongos

O número de células TH-positivas e o nível de expressão da proteína TH no SN de camundongos com DP induzida por MPTP foram menores em comparação com camundongos do grupo controle. Depois decistanchetubulosa, o número de células TH-positivas e o nível de expressão da proteína TH no SN de camundongos com DP induzida por MPTP aumentaram, com uma diferença significativa entre a dose altacistanchegrupo tratamento tubulosa e grupo veículo pelo teste LSD; e houve diferenças significativas entre os três grupos tratados (Figura 7).

Efeito decistanchetubulosa Nanopowder na Expressão Proteica de GDNF e seus Receptores, GFR 1 e Ret em Camundongos

A expressão da proteína de GDNF e seus receptores, GFR 1 e Ret, nas células marcadas positivamente, foi avaliada por imuno-histoquímica. A análise de Western blot foi utilizada para avaliar os níveis de expressão de proteínas no SN dos diferentes grupos de camundongos. Os resultados para os diferentes grupos foram semelhantes usando os dois métodos de detecção. A expressão de GDNF e suas proteínas receptoras, GFR 1 e Ret, em células coradas positivamente no SN dos camundongos do grupo veículo foi significativamente menor do que nos camundongos do grupo controle normal. Diferentes dosagens decistancheo tratamento com tubulosa aumentou o número de células GDNF-, GFR 1- e Ret-positivo (Figuras 8A-S).

A expressão proteica de GDNF, GFR 1 e Ret no SN dos camundongos do grupo veículo foi significativamente menor do que nos camundongos do grupo controle. Aumentar as concentrações de tratamento decistanchenanopowder tubulosa melhorou significativamente a expressão dessas proteínas. A expressão da proteína de GDNF, GFR 1 e Ret no SN dos camundongos na dose altacistanchegrupo de tratamento tubulosa foi significativamente maior do que nos camundongos no grupo de veículo (P <{0}},01; Figuras 8T, U).

Efeito decistancheTubulosa Nanopowder na Expressão Proteica de Bcl2/Bax em Camundongos

A expressão da proteína Bcl2 foi significativamente reduzida e a expressão da proteína Bax foi significativamente aumentada no SN de camundongos no grupo veículo (P <00,01) em comparação com os camundongos no grupo de controle normal. alta dosecistancheo tratamento com tubulosa aumentou significativamente a expressão da proteína Bcl2 e reduziu significativamente a expressão da proteína Bax nos cérebros dos camundongos veículo (P <00,01; Figura 9). O teste LSD mostrou que não houve diferença significativa entre os grupos de dose média e alta, mas uma diferença significativa entre o grupo de dose baixa para eles.

Discussão

DP e Apoptose

A DP é uma doença neurodegenerativa. De acordo com Zhang et al. (2005), a prevalência é de 10,7 por cento na população chinesa com mais de 55 anos e 1,67 por cento naqueles com mais de 65 anos. e a sociedade em geral.

No cérebro, os neurônios dopaminérgicos estão envolvidos principalmente na síntese e secreção de DA. Eles são amplamente distribuídos no sistema nervoso central e localizados principalmente no SN (80 por cento). TH é a principal enzima limitante da taxa para a síntese de DA.

Assim, a inibição da atividade de HT reduz a síntese de DA (Huot e Parent, 2007). As principais alterações patológicas e bioquímicas da DP são a apoptose de neurônios dopaminérgicos no SN, uma redução significativa de DA nigroestriatal e a formação de corpos de Lewy em neurônios dopaminérgicos (Dexter e Jenner, 2013). A etiologia da DP envolve fatores genéticos associados, fatores ambientais e envelhecimento do sistema nervoso (Allam et al., 2005). A patogênese da DP permanece obscura na medicina moderna. Desde o final da década de 1960, a terapia de reposição de levodopa tem sido usada com sucesso para tratar a DP e tem sido reconhecida como um importante ponto de virada no tratamento da DP. No entanto, a aplicação a longo prazo desta terapia causa efeitos colaterais e a terapia não trata as causas subjacentes da DP (Del Sorbo e Albanese, 2008). Portanto, a pesquisa ativa de novos medicamentos ou métodos de tratamento visando a proteção dos neurônios dopaminérgicos é crucial para o tratamento da DP.

Em estudos anteriores, a aplicação da rotulagem terminal dUTP mediada por desoxinucleotidil transferase indicou que 0,6 por cento -4,8 por cento dos neurônios dopaminérgicos no SN de pacientes com DP mostraram apoptose (Mochizuki et al., 1996). A microscopia eletrônica mostrou características apoptóticas, incluindo condensação cromática e corpos apoptóticos em células dopaminérgicas (Anglade et al., 1997). Tompkins et ai. (1997) realizaram uma análise ultraestrutural de autópsias de tecido cerebral de pacientes com DP, DA e doença difusa de corpos de Lewy (DLBD). Eles encontraram corpos apoptóticos na camada densa do SN em pacientes com DP e DLBD, fornecendo evidências conclusivas de apoptose neuronal na DP e doenças relacionadas. Portanto, a redução ou supressão da apoptose nos neurônios dopaminérgicos é fundamental para o tratamento da DP.

Estudos anteriores mostraram que o MPTP induziu sintomas semelhantes aos da DP. O MPTP atravessa a barreira hematoencefálica e é metabolizado pelas monoamina oxidases do tipo B nos astrócitos. Posteriormente, é convertido em MPP plus tóxico, que se acumula nas mitocôndrias dos neurônios dopaminérgicos por meio da ingestão de proteínas do transportador DA. Assim, gera radicais livres de oxigênio em excesso que inibem a atividade do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial e a síntese de ATP. Esses eventos promovem ainda mais a formação de radicais livres e reações de estresse oxidativo e, eventualmente, levam à degeneração e morte de neurônios dopaminérgicos.

Portanto, este estudo usou MPP plus para estabelecer um veículo in vitro em neurônios dopaminérgicos MES23.5 e MPTP para induzir um camundongo veículo para verificação mútua. De acordo com os resultados do ensaio MTT, o MPP plus reduziu significativamente a viabilidade das células MES23.5, sugerindo que o MPP plus foi citotóxico para os neurônios dopaminérgicos. Os resultados também demonstraram quecistanchetubulosa melhorou efetivamente a expressão de proteínas anti-apoptóticas e inibiu o aumento da apoptose induzida por MPP plus.

D e GDNF

GDNF é um fator neurotrófico, que foi isolado pela primeira vez por Lin et al. (1993). Lin et ai. (1993) também mostraram que GDNF teve efeitos nutricionais específicos em neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo de ratos. GDNF, neurturina (NTN), percepção (PSP) e artemina (ART) constituem a família GDNF. São proteínas secretoras estruturalmente semelhantes e funcionalmente relacionadas (Kotzbauer et al., 1996; Baloh et al., 1998; Milbrandt et al., 1998; Woodbury et al., 1998).

O receptor GDNF consiste em dois componentes. O primeiro componente, GFR , é fixado à membrana externa do glicosilfosfatidilinositol (GPI) e ancorado à superfície da conexina. O segundo componente é a proteína Ret. A pesquisa mostrou que existem quatro tipos diferentes de GFR: GFR 1, GFR 2, GFR 3 e GFR 4. GFR 1 é um receptor de alta afinidade de GDNF (Onochie et al., 2000; Chen et al., 2001; Lindahl e outros, 2001). A proteína Ret é um receptor funcional de GDNF. A molécula homodímera de GDNF liga-se diretamente a GFR 1 para formar complexos e interagir com Ret, resultando na dimerização e ativação de Ret. Devido à autofosforilação do Ret, o Ret ativa várias vias comuns de sinalização do TH. Na ausência da proteína Ret, GDNF causa fosforilação de proteínas de MAPK, PI-3 e PLC- , além da expressão de mRNA e atividade funcional de C-fos por meio de sua proteína receptora, GFR 1 (He et al., 2008).

Estudos demonstraram que o GDNF teve o efeito protetor mais forte nos neurônios dopaminérgicos (Rangasamy et al., 2010; Campos et al., 2012). Em veículos que usam MPTP e 6-hidroxidopamina (6-OHDA) para induzir dano em neurônios dopaminérgicos, o GDNF protege os neurônios dopaminérgicos reduzindo a apoptose e promovendo o crescimento axonal para induzir a diferenciação de células-tronco (Lucas et al., 2012; Littrell et al., 2013). Lin et ai. (1993) mostraram que o GDNF promoveu especificamente a viabilidade, diferenciação e crescimento axonal de neurônios dopaminérgicos para promover a captação de DA em neurônios. O estudo também mostrou que o GDNF não apenas preveniu a toxicidade aguda, mas também aliviou a toxicidade a longo prazo de MPP plus ou 6-OHDA em neurônios dopaminérgicos, além de prevenir a morte celular em células estressadas ou danificadas (Yu et al., 2010). Além disso, o GDNF promoveu a proliferação e diferenciação de células-tronco neurais em direção a neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo (Lindsay, 1995) para resgatar neurônios dopaminérgicos da degeneração retrógrada (Hong-Juan et al., 2011).

Estudos demonstraram que a expressão de GDNF no SN foi significativamente reduzida em veículos animais (Yang et al., 2010). Isso sugere que pode ser um dos mecanismos de patogênese em ratos com DP. A injeção de 5–15 ug/d de GDNF no ventrículo lateral ou estriado de um animal veículo induzido por MPTP por três meses consecutivos promoveu o reparo nigroestriatal do sistema dopaminérgico no animal veículo (Grondin et al., 2002). Estudos de tratamento com GDNF para DP em veículos animais mostraram que a injeção intracerebral de GDNF em diferentes regiões do cérebro, como o SN, núcleo caudado e ventrículo lateral, melhorou os distúrbios de movimento associados a modelos animais de DP, incluindo diminuição da atividade motora, rigidez muscular e tremor (Grondin et al., 2002).

No entanto, o GDNF não pode passar diretamente pela barreira hematoencefálica. Portanto, a injeção cerebral local de GDNF envolve riscos substanciais e dificuldades na aplicação clínica. Aplicações para introduzir GDNF exógeno por meio de microesferas de liberação controlada, cápsulas de liberação sustentada e genes virais ainda estão sendo estudadas (Liang et al., 2010; Yang et al., 2010; Qiao et al., 2012). Dadas as limitações de várias técnicas para introduzir GDNF exógeno no cérebro, os agentes neuroprotetores que promovem a liberação de GDNF endógeno são significativos para aplicação clínica.

DP ecistanchetubulosa Nanopowder

A DP é mais comum em adultos de meia-idade e idosos. A teoria da MTC considera que a DP está localizada principalmente no cérebro e se deve principalmente à deficiência hepática e renal, além de energia vital e insuficiência sanguínea. De acordo com essa teoria, o tratamento da DP deve, portanto, se concentrar em revigorar o rim e a medula óssea. Yang e outros. (2010) usaram ensaios clínicos randomizados, duplo-cegos e controlados por placebo e descobriram que a terapia combinada usando Madopar e receitas tonificantes renais aliviou as disfunções motoras de pacientes com DP. O resultado do tratamento foi melhor do que uma única terapia com Madopar. A eficácia do tratamento da monoterapia com TCM ou prescrição de compostos na DP foi confirmada em modelos animais de DP e aplicações clínicas. As aplicações de TCM para tonificar os rins e promover a circulação sanguínea reduziram a dosagem de monoterapia para DP usando Madopar. Alguns estudos sugeriram que o TCM melhorou os sintomas da DP e protegeu os neurônios dopaminérgicos, o que pode estar intimamente relacionado à promoção da expressão endógena de GDNF (Hong-Juan et al., 2011; Qiao et al., 2012).

O composto tonificante do rim usado neste estudo,cistanchenanopowder tubulosa, continha Cistanche, epimedium e Rhizoma polygonal. Pesquisas modernas sugerem que a composição química do Cistanche é ECH, que protege os neurônios dopaminérgicos no SN nos camundongos com DP induzida por MPTP e inibe a redução de DA e do transportador de DA (Zhao et al., 2010). Além disso, previne a redução de DA induzida por 6-OHDA e protege os neurônios dopaminérgicos estriatais (Chen et al., 2007). O Epimedium inibe a ativação da caspase-3 e exerce funções neuroprotetoras (Liu et al., 2011). Os flavonoides Epimedium promovem efetivamente a proliferação e diferenciação de células-tronco neurais (Yao et al., 2010).

Neste estudo,cistanchetubulosa nanopowder antagonizou o aumento da apoptose induzida por MPP plus de maneira dose-dependente. Melhorou significativamente a expressão de TH no veículo in vitro e teve efeitos anti-apoptóticos significativos em neurônios dopaminérgicos. Os camundongos com veículo induzido por MPTP mostraram distúrbios comportamentais e reduziram significativamente a expressão de TH nos tecidos do mesencéfalo e os níveis de DA, que são características patológicas típicas da DP. Diferentes dosagens decistanchetubulosa nanopowder encurtou a duração estacionária, melhorou as atividades autônomas, melhorou os distúrbios comportamentais, elevou os níveis de DA no cérebro e aumentou a expressão de TH em veículos. Esses resultados sugeriram quecistanchetubulosa nanopowder exerceu efeitos protetores nos neurônios dopaminérgicos, melhorando assim os distúrbios comportamentais dos veículos. Diferentes dosagens decistanchetubulosa nanopowder aumentou a expressão da proteína GDNF e suas proteínas receptoras no cérebro de camundongos veículos. O tratamento com altas doses de cistanche tubulosa aumentou significativamente a expressão de Bcl2 e reduziu a expressão de Bax, o que sugeriu que o nanopó de cistanche tubulosa pode promover a expressão e secreção de GDNF no cérebro de camundongos danificados por MPTP. Além disso, pode exercer efeitos neuroprotetores em neurônios dopaminérgicos e minimizar a apoptose neuronal através das funções de suporte neurotrófico do GDNF.

Este estudo demonstrou quecistanchetubulosa nanopowder exerceu efeitos protetores em neurônios dopaminérgicos in vitro e in vivo e aumentou a expressão de TH para melhorar o conteúdo de DA. Também melhorou distúrbios comportamentais em camundongos veículos induzidos por MPTP, regulou a expressão de proteínas de GDNF e suas proteínas receptoras no SN e teve efeitos anti-apoptóticos em camundongos com DP. O mecanismo subjacente aos efeitos clínicos dacistanchetubulosa nanopowder na DP pode envolver o aumento do conteúdo de GDNF endógeno no cérebro e, assim, reduzir o dano aos neurônios dopaminérgicos.

Contribuições do autor

QX e WF são os co-primeiros autores do trabalho, S-FY, Y-BC, WQ e S-YC participaram do trabalho experimental, e JC projetou e orientou o trabalho.

Declaração de conflito de interesse

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado pela Natural Science Foundation of Fujian Province Grants (projeto 2015J01686), o Fundo de Pesquisa Científica da Comissão Nacional de Saúde e Planejamento Familiar da República Popular da China (projeto WKJ-FJ-38), Chen Keji fundo para o desenvolvimento da Medicina Integrativa (projeto CKJ2014012) e a disciplina principal da Universidade Fujian de medicina tradicional chinesa (projeto X2014010-assunto).

For more information:1950477648nn@gmail.com