Cistanche Tubulosa induz apoptose mediada por espécies reativas de oxigênio de células de câncer de cólon humano primário e metastático

INTRODUÇÃO

O câncer colorretal é um dos cânceres mais comuns em todo o mundo (Brennere outros., 2014), e a sua incidência está aumentando constantemente, com uma estimativa de 2,4 milhões de casos em 2035, devido à dieta e estilo de vida modernos, juntamente com a redução da atividade física. Os esforços actuais não são suficientes para combater a actual epidemia de cancro colorrectal e, portanto, são necessárias novas abordagens para uma prevenção e tratamento eficazes, incluindo mudanças no estilo de vida em combinação com intervenções alternativas mais seguras, tais comoFitoterápicos (Weidnere outros., 2015). A fitoterapia, o uso de plantas medicinais para tratar doenças, tem sido uma parte inevitável da história humana antiga. As plantas medicinais têm sido utilizadas há muito tempo como fontes alternativas de tratamento para o cancro, representando mais de sessenta por cento dos agentes anticancerígenos utilizados na medicina convencional (Balunas e Kinghorn, 2005; Saibue outros., 2015). Alguns dos exemplos mais conhecidos incluem extratos deCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) e Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg e Newman, 2005; da Rochae outros., 2001). Foi demonstrado que vários extratos de ervas e fitoquímicos exercem efeitos antitumorais no câncer colorretal atribuídos à indução da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e à apoptose associada de células cancerígenas, como no caso de extratos deMelissa officinalis(Weidnere outros., 2015)

Entre os candidatos fitoterápicos,Cistanche tubulosa, uma planta parasita do deserto de Orobanchaceae (Jiang et al., 2009) que é amplamente distribuída em regiões áridas e semiáridas da África, Ásia e região do Mediterrâneo, demonstrou ter propriedades medicinais valiosas. Cistanche tubulosa tem sido amplamente utilizada na medicina tradicional e sugere-se que tenha efeitos curativos na deficiência renal, leucorreia mórbida, metrorragia, infertilidade feminina e constipação senil (Jiang et al., 2009). as propriedades da Cistanche Tubulosa foram intensamente estudadas durante a última década, incluindo efeitos vasorrelaxantes (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotetores (Morikawa et al, 2010), anti-hiperglicêmicos e hipolipemiantes (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa também foi sugerida como um potente potenciador do sistema imunológico, um promotor da formação óssea e um agente anti-envelhecimento e anti-fadiga (Xu et al., 2014). Além disso, foi demonstrado que o extrato de Cistanche tubulosa bloqueia a deposição de amilóide no modelo da doença de Alzheimer (Wu et al., 2015). Apesar dos seus vários usos terapêuticos, o efeito da Cistanche Tubulosa como potencial agente anticancerígeno ainda não foi estudado.

No presente trabalho, investigamos o efeito anticancerígeno de Cistanche Tubulosa em duas linhagens celulares de câncer de cólon primário e duas metastáticas e os mecanismos potenciais subjacentes a esse efeito.

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MATERIAIS E MÉTODOS

Coleta e preparação de extrato vegetal

As amostras de Cistanche tubulosa foram coletadas em áreas desérticas do Catar em 2014 e a autenticidade da planta foi confirmada pelo herbatologista. As amostras dos vouchers estão arquivadas no Departamento de Toxicologia e Polivalente da ADLQ. As amostras de plantas secas ao sol foram moídas com Retsch Knife Mill Grindomix GM300 em pó fino. Vinte gramas de pó foram extraídos com 200 mL de água ultrapura durante a noite a 37 graus em um agitador rotativo a 200 rpm. O brutoExtratos de Cistanche tubulosa (CTE)foram centrifugados por 30 min a 8.000 rpm para sedimentar compostos não solúveis, o sobrenadante foi coletado e liofilizado usando um secador Labconco Freezone 6 plus Freeze. O extrato seco foi reconstituído em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, SIGMA, Alemanha) até uma concentração de 20 mg/mL e filtrado estéril através de um filtro de membrana de 0,2-mícron.

Linhas celulares e manutenção celular

As linhas celulares de carcinoma do cólon humano CaCo2, SW620 e LoVo foram obtidas do Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Alemanha), enquanto a linha celular HCT 116 foi um gentil presente do Departamento de Ciências Biológicas e Ambientais da Universidade do Qatar. CaCo2 e HCT11 foram derivados do sítio primário do carcinoma do cólon, enquanto SW620 e LoVo foram derivados do sítio metastático. As células SW620, HCT116 e LoVo foram cultivadas e mantidas em meio DME enquanto as células CaCo2 foram mantidas em meio essencial mínimo de Eagle (EMEM, SIGMA, Alemanha). As células foram cultivadas em monocamada cultivadas a 37 graus no respectivo meio suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, SIGMA, Alemanha) e 1% de Penicilina/Estreptomicina (SIGMA, Alemanha) numa atmosfera humidificada contendo 5% de dióxido de carbono.

Ensaio de viabilidade celular

O ensaio de {{0}}[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi utilizado para avaliar a atividade citotóxica de CTE semelhante ao descrito anteriormente (Jaganjac et al., 2010). A densidade de semeadura de células CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo cultivadas em placas de 96-poços foi de 104 células por poço. As células foram plaqueadas no respectivo meio suplementado com 10% de FBS 24 horas antes do tratamento. Após 24 horas, o meio foi removido e as células foram tratadas com 0, 0,25, 0,5, 1 e 2 mg/mL de CTE por 24, 48 e 72 horas a 37 graus em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Após o tratamento com CTE, o meio foi removido e 40 µL de solução MTT (0,5 mg/mL) foram adicionados a cada poço.

Após 3 h de incubação, a solução de MTT foi removida, o produto formazan dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO, SIGMA, Alemanha) e a absorbância foi medida a 590 nm com um leitor de microplacas (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Suíça) .

Ensaio de apoptose

A apoptose em células CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo foi detectada usando PE Anexo V Apoptosis Detection Kit I com 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD) como um corante vital (Becton Dickinson International, Bélgica) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 24-poços a uma densidade de 5×104 células/poço em um respectivo meio suplementado com 10% de FBS por 24 h antes da adição de CTE (0, 0,5 , ou 1 mg/mL). Após 24 CTE de incubação, as células foram colhidas, lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato fria e coradas com Ficoeritrina (PE) Anexina V e 7-AAD durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. As células coradas foram analisadas dentro de 1 hora por citometria de fluxo utilizando FACS. Citômetro de fluxo Aria III e software FACSDiva (Becton Dickinson) com baixa taxa de fluxo com um mínimo de 104 células. O tratamento das células durante 4 horas com camptotecina 6 µM (SIGMA) foi utilizado como controlo positivo para o ensaio.

Produção intracelular de ROS

A produção intracelular de ROS foi examinada usando 2,{1}} diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA, SIGMA, Alemanha). DCFH-DA é uma sonda não fluorescente, que é oxidada com ROS intracelulares no composto fluorescente 2,7- diclorofluoresceína (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). O ensaio DCFH DA foi realizado de forma semelhante ao descrito anteriormente (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Resumidamente, a densidade de semeadura de células CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo cultivadas em placas pretas de 96-poços foi de 104 células por poço. As células foram plaqueadas no respectivo meio suplementado com 10% de FBS durante 24 horas. Antes do tratamento, as células foram incubadas com 10 µM de DCFH-DA a 37 graus durante 30 min em 5% de CO2/95% de ar. As células foram então lavadas e tratadas com 0, 0,5 e 1 mg/mL de CTE no meio sem fenol vermelho. A formação intracelular de ERO foi monitorada continuamente ao longo de 25 horas a 37 graus e 5% de CO2 usando um leitor de microplacas com módulo de controle de gás e fluorescência superior (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Suíça). A intensidade de fluorescência foi medida com comprimento de onda de excitação de 500 nm e detecção de emissão em 529 nm. As unidades arbitrárias, unidades de fluorescência relativa (RFU), basearam-se diretamente na intensidade de fluorescência.

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Geração de superóxido mitocondrial

A capacidade do CTE de induzir a geração de superóxido pelas mitocôndrias foi estimada usando a sonda MitoSOX Red permeável às células, direcionada às mitocôndrias (Life Technologies) e Hoechst 33342 para coloração nuclear (Life Technologies). Células CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo foram semeadas em placas de 96-poços a uma densidade de 104 células por poço em um respectivo meio suplementado com 10% de FBS por 24 horas . As células foram então carregadas com 4 µM de MitoSOX e 2 µM de Hoechst 33342 por 20 min, o excesso de corante foi lavado e os poços tratados com 0, 0,5 e 1 mg/mL de CTE por 24 horas a 37 graus e 5% de CO2. A intensidade de fluorescência foi medida com um comprimento de onda de excitação de 510 nm e detecção de emissão a 580 nm para MitoSOX e um comprimento de onda de excitação de 350 nm e detecção de emissão a 461 nm para Hoechst 33342 usando um leitor de microplacas com fluorescência superior (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Suíça)

Análise estatística

As estatísticas descritivas foram mostradas como a média +/− DP. A significância das diferenças entre os grupos foi avaliada por meio do teste t de Student e do qui-quadrado. Quando mais de dois grupos foram comparados, usamos ANOVA unilateral com testes post hoc apropriados. O SPSS 11.{6}}1 para Mircosoft Windows foi usado. Diferenças com P menor que 0,05 foram consideradas estatisticamente significativas.

RESULTADOS

O efeito do CTE na proliferação de linhas celulares de cancro do cólon humano é mostrado na Figura 1. Todas as concentrações de CTE testadas mostraram um forte efeito inibitório na linha celular CaCo2 de uma forma dependente da concentração e do tempo (Figura 1A). Setenta e duas horas de tratamento com CTE inibiram o crescimento de células CaCo2 em mais de 60% em comparação ao controle (p < 0.05 para todas as concentrações). Um impacto significativo do tratamento com CTE no crescimento de células HCT116 também foi detectado em todos os momentos nas duas concentrações mais altas (1 mg/mL e 2 mg/mL), atingindo uma redução superior a 70% na última concentração (Figura 1B, p < 0,05). Embora as duas concentrações mais baixas de CTE (0,25 e 0,5 mg/mL) tenham reduzido significativamente o crescimento de células HCT116 após 24 horas (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). A inibição da proliferação dependente do tempo e da concentração com CTE foi ainda confirmada em células LoVo em mais de 60% na concentração mais alta (p < 0.05) (Figura 1C), e todas as quatro concentrações de CTE testadas reduziram o crescimento de células SW62 0 após 48 horas (Figura 1D, p < 0,05 para todos). Após 72 horas de tratamento, o mesmo efeito foi observado apenas para as duas concentrações mais altas (p < 0,05), enquanto as concentrações de 0,25 e 0,5 mg/mL não apresentaram efeito significativo em comparação ao controle (p > 0,05). O impacto do tratamento com CTE de 0,5 e 1 mg/mL na indução de apoptose foi testado posteriormente em todas as quatro linhagens celulares (Figura 2). Um número aumentado de células na apoptose precoce foi detectado em HCT116 e LoVo após 24-horas de tratamento com 0,5 mg/mL (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Figura 1:Efeito deCistanche tubulosasobre a viabilidade de linhagens celulares de câncer de cólon. A viabilidade celular medida pelo ensaio MTT de células (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 é apresentada como uma percentagem da linha celular de cancro do cólon não tratada de controlo. Valores médios (±DP) para 5 réplicas do experimento representativo são dados: (*) significância p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 2: Extrato aquoso de Cistanche tubulosa induz apoptose em células de câncer de cólon humano. Análises de citometria de fluxo de anexina-V-FITC de células (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 são apresentadas como porcentagem da linha celular de câncer de cólon não tratada de controle. Valores médios (±DP) para 3 réplicas do experimento representativo são dados: (*) significância p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

3: O extrato aquoso de Cistanche tubulosa induz a produção intracelular de ERO de forma dependente do tempo e da dose. A produção de ROS medida pelo ensaio DCFH-DA em células (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 é apresentada como valores médios de RFU (±SD) para as respectivas 5-réplicas de um experimento representativo. (*) Significância p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

4: O extrato aquoso de Cistanche tubulosa induz a produção de superóxido mitocondrial em células de câncer de cólon humano. A intensidade de fluorescência da sonda MitoSOX Red direcionada às mitocôndrias em A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) células SW620 são apresentadas como uma porcentagem da linha celular de câncer de cólon não tratada de controle. Valores médios (±DP) para 5 réplicas do experimento representativo são dados: (*) significância p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISCUSSÃO

Embora estudos anteriores tenham relatado inúmeras propriedades medicinais da Cistanche tubulosa, este é o primeiro relato do seu efeito antiproliferativo em células malignas. Os compostos bioativos de Cistanche tubulosa extraídos com água, um solvente altamente polar, apresentaram forte bioatividade anticancerígena. Anteriormente comparamos a eficiência da Cistanche tubulosa solubilizada em água com outros solventes como metanol e acetato de etila, mas os extratos aquosos exibiram as atividades anticancerígenas mais promissoras (dados não mostrados).

Nós demonstramos a capacidade do CTE a 1 mg/mL e 2 mg/mL de inibir 60% do crescimento de linhas celulares de câncer de cólon primário e metastático, revelando um papel potencialmente importante doCistanche tubulosacomo tratamento para câncer de cólon. Em comparação com as células normais, as células cancerosas são geralmente caracterizadas por uma perturbação na homeostase redox e uma estratégia comum das atuais terapias anticâncer é aumentar o estresse oxidativo celular (Yang et al, 2013). Embora níveis fisiologicamente baixos de ERO tenham um papel importante como moléculas sinalizadoras, a produção excessiva de ERO pode contribuir para a instabilidade e malignidade do câncer (Liou e Storz, 2010). Paradoxalmente, este desequilíbrio na homeostase redox celular torna as células cancerígenas mais vulneráveis ​​à morte celular induzida por ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira e Hay, 2013). O efeito antiproliferativo da CTE relatado neste estudo pode ser mediado por vários mecanismos extra e intracelulares de compostos conhecidos e desconhecidos dentro do extrato, visando múltiplas vias que desempenham papéis essenciais na apoptose. Para diferenciar entre os diferentes modos de morte celular, investigamos o potencial mecanismo responsável pela citotoxicidade induzida por CTE observada.

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Nossos dados indicam que o CTE aumenta a produção intracelular de ERO e, consequentemente, a morte celular induzida por ERO. O estado Redox da célula também desempenha um papel crucial na regulação da apoptose e a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial é um dos principais locais de geração de EROs celulares (Trachootham et al., 2008). Além disso, as ERO intracelulares poderiam causar apoptose celular através de vias dependentes e independentes de mitocôndrias (Sinha et al., 2013). De facto, os nossos dados também indicam que a externalização da fosfatidilserina induzida por CTE é um efeito comum na apoptose, tanto em linhas celulares de cancro primário como metastático, sugerindo que o mecanismo de morte induzida por CTE é mediado por apoptose e não por necrose. A ativação da apoptose nas células cancerígenas é uma estratégia corretiva e muitos medicamentos anticâncer podem exercer efeitos apoptóticos nas células cancerígenas.

Compostos ou extratos com atividades pró-apoptóticas em células cancerígenas são, portanto, potencialmente úteis na pesquisa de medicamentos anticâncer (Wong, 2011). Para determinar se o efeito pró-apoptótico induzido por CTE é mediado pelo mecanismo ROS induzido por mitocôndrias, medimos a produção de superóxido usando uma sonda fluorescente direcionada a mitocôndrias em células tratadas com CTE. Nossos dados mostram claramente que o CTE estimula a produção de superóxido mitocondrial, sugerindo que a atividade anticancerígena de Cistanche tubulosa é, pelo menos em parte, mediada pelo mecanismo de ERO induzido por mitocôndrias.

CONCLUSÕES

Em conclusão, os nossos dados sugerem que o extrato aquoso da planta do deserto Cistanche tubulosa pode representar um candidato promissor para uma abordagem anticancerígena em combinação com outras terapias convencionais para a prevenção e tratamento do cancro do cólon. Demonstramos também que a toxicidade do extrato vegetal contra células cancerígenas é mediada pelo aumento da produção intracelular de ERO e, pelo menos em parte, pela apoptose dependente da mitocôndria. Mais estudos estão em andamento para isolar e caracterizar os constituintes biologicamente ativos individuais responsáveis ​​pela atividade anticancerígena.

Mais pesquisas são necessárias para avaliar o uso potencial deste extrato como um agente quimiopreventivo eficaz e para compreender os mecanismos de ação nas células do câncer de cólon em nível molecular. São também necessários mais estudos pré-clínicos e clínicos para confirmar os efeitos benéficos para a saúde observados.Cistanche tubulosa para prevenção do câncer.

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