Clonagem genética, identificação funcional, análise estrutural e de expressão da sacarose sintase de Cistanche Tubulosa Ⅱ

Resultados e análises

1 Mineração e clonagem de genes da sacarose sintase em Cistanche tubulosa

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>parte aérea.

Portanto, os valores do nível de expressão FPKM dos dois genes candidatos à sacarose sintase obtidos na triagem inicial nos dados do transcriptoma de diferentes partes da Cistanche tubulosa foram normalizados pelo Z-Score e a análise diferencial foi realizada (Figura 1A). Os resultados mostraram que o gene CtSus teve o maior nível de expressão no haustório e o nível de expressão na parte subterrânea foi maior que na parte aérea o que foi consistente com o padrão de acumulação de compostos glicosídicos em diferentes partes de Cistanche tubulosa enquanto o nível de expressão do gene CtSus1 no haustório foi baixo. Portanto, com base nos resultados acima, o gene CtSus foi selecionado para posterior amplificação da sequência, expressão exógena e identificação funcional. Utilizando cDNA de Cistanche tubulosa como modelo, um produto de banda única foi obtido a ~2500 pb após amplificação por PCR (Figura 1B). O produto de PCR foi recuperado do gel e ligado ao vetor de clonagem, e a região codificadora completa do gene alvo foi obtida por sequenciamento. O comprimento da sequência CtSus foi de 2.418 pb.

Figura 1 Exploração gênica e clonagem de CtSus de C. tubulosa e análise bioinformática de sua proteína codificada. A: Níveis de expressão dos genes CtSus e CtSus1 em diferentes partes de C. tubulosanormalizados como Z-Scores com base em seus valores de FPKM; B: Amplificação gênica de CtSus; M: marcador de DNA; C: domínio conservador da proteína CtSus previsto pelo SMART; D: Alinhamento de sequências múltiplas de CtSus e sacarose sintases identificadas em outras plantas, incluindo Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum e Albuca bracteata. O domínio de síntese de sacarose e o domínio de transferência de açúcar são representados por caixas vermelhas e azuis, respectivamente; E: Análise filogenética de CtSus e sacarosesintases de outras plantas; F: Análise SDS-PAGE da expressão heteróloga de CtSus usando o vetor pCold™ I em E. coli. Pista 1: Marcador de proteína; Pista 2: Fração sobrenadante; Pista 3: Fração de precipitado. A seta vermelha mostra a proteína CtSus. G: PCR de colônia de um único clone contendo dois plasmídeos recombinantes. M: marcador de DNA; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

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2 Análise bioinformática do gene CtSus e sua proteína codificada

2.1 Análise das propriedades físico-químicas do CtSus e previsão da estrutura do domínio transmembrana

As propriedades físico-químicas da proteína codificada por CtSus foram analisadas utilizando o software online ProtParam. A proteína contém 805 aminoácidos, com fórmula molecular C4189H6548N1104O1187S28 e massa molecular relativa de 92.266,44; o ponto isoelétrico teórico é 6.00; o coeficiente de instabilidade II é 35,45, que é uma proteína estável; a hidrofilicidade média geral (GRAVY) é −0,187, que é uma proteína hidrofílica. O MHMM 2.0 foi usado para prever o domínio transmembrana da sacarose sintase CtSus, e os resultados mostraram que a proteína codificada por este gene não possui domínio transmembrana.

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2.2 Predição da estrutura conservadora do CtSus e alinhamento de sequência

O software online SMART foi utilizado para prever os domínios conservadores da proteína CtSus (Figura 1C). A proteína contém dois domínios conservadores. O terminal N (aminoácidos 8 a 553) é o domínio da sacarose sintase, que pode catalisar a reação reversível de UDP e sacarose para gerar UDP-glicose e D-frutose; o terminal C (aminoácidos 557 a 739) pertence ao domínio glicosiltransferase (Figura 1D). O software DNAMAN foi utilizado para alinhar a sequência da proteína CtSus com a sequência de aminoácidos da sacarose sintase no banco de dados NCBI (Tabela 2). Os resultados mostraram que a sequência de aminoácidos CtSus apresentou alta similaridade com sequências de sacarose sintase de outras plantas. A maior similaridade entre CtSus e a sequência de sacarose sintase do gergelim (Sesamum indicum) foi de 94,78%, e a similaridade com as sequências de sacarose sintase de outras plantas também foi acima de 65%, indicando que a sacarose sintase de plantas possui um alto grau de sequência. conservação.

Tabela 2 Semelhanças de sequência de aminoácidos entre CtSus e sacarose sintases identificadas em outras plantas

2.3 Análise filogenética

A árvore filogenética construída pelo software MEGA foi utilizada para analisar a relação filogenética entre a sacarose sintase CtSus de Cistanche tubulosa e sacarose sintase de outras plantas. Os resultados são mostrados na Figura 1E. As sacarose sintases de plantas apresentam ramos evolutivos distintos em dicotiledôneas (regiões I e II) e monocotiledôneas (região III). CtSus está no ramo dicotiledônea, e as sequências que estão intimamente relacionadas a CtSus são todas de plantas Lamiaceae (Cistanche tubulosa é uma planta Lamiaceae Orobanchaceae), enquanto o outro ramo é composto principalmente por plantas Solanales, o que indica ainda a alta conservação e homologia de genes de sacarose sintase derivados de plantas na evolução das plantas na mesma ordem. Entre eles, a sacarose sintase PrSus (AEN79500.1) de Phelipanche ramosa da planta Orobanchaceae é a mais próxima do CtSus.

3 Expressão exógena e análise de atividade de CtSus

3.1 Expressão exógena do gene CtSus

Os plasmídeos pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus e pCold™ I-CtSus verificados por sequenciamento foram transferidos para a expressão competente E. coli Transetta (DE3), e os clones positivos foram triados por PCR de colônia para verificação de sequenciamento. As cepas de expressão recombinantes obtidas foram induzidas por baixa temperatura de IPTG para expressão proteica, e as bactérias foram coletadas por centrifugação. O tampão de lise foi adicionado para quebrar as bactérias para obter o sobrenadante e o precipitado, e SDS-PAGE foi realizado para detecção. Os resultados mostraram que quando pET-28a e pET-24b foram usados ​​como vetores de expressão, CtSus não foi expresso em E. coli, enquanto quando pCold™ I foi usado como vetor de expressão, um CtSus claro banda de proteína recombinante foi detectada na região de ~100 kDa, o que foi consistente com sua massa molecular relativa teoricamente prevista de 92,2 kDa (Figura 1F).

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3.2 Transformação de células inteiras

Para verificar preliminarmente a função catalítica do CtSus, foi construída uma cepa de coexpressão de CtSus e do gene da glicosiltransferase UGT71BD1. UGT71BD1 foi clonado e identificado de Cistanche tubulosa e é uma UDP-glicosiltransferase que pode aceitar amplamente compostos aromáticos como glicosídeos feniletanóides, diferentes tipos de flavonóides, estilbeno e cumarina como receptores e catalisar a reação de glicosilação do grupo hidroxila fenólico do substrato usando UDP-glicose como doador de açúcar[18]. A introdução de CtSus pode, teoricamente, fornecer UDP-glicose doadora de glicosil mais suficiente para a reação de glicosilação catalisada por UGT71BD1, promovendo assim o equilíbrio da reação para avançar em direção à formação de produtos de glicosilação, aumentando assim o rendimento de produtos de glicosilação. O plasmídeo pCold™ I-CtSus e o plasmídeo pET-28a-UGT71BD1 foram simultaneamente transformados na expressão competente E. coli Transetta (DE3). Clones únicos contendo ambos os plasmídeos recombinantes foram selecionados por PCR de colônia, e cepas de expressão recombinante positiva foram obtidas por verificação de sequenciamento (Figura 1G). A coexpressão gênica dupla foi induzida in vitro, e a cepa de expressão gênica única pET-28aUGT71BD1 foi usada como grupo controle. A atividade do CtSus na catalisação da geração de doador de UDP-glicose foi verificada preliminarmente pela transformação de células inteiras. Os resultados de HPLC e espectrometria de massa de alta resolução mostraram que quando a reação de transformação de células inteiras foi realizada com aesculetina 1 e resveratrol 2 como substratos, a geração de produtos de glicosilação óbvios foi detectada após 24 horas de transformação, como mostrado na Figura 2.

Figura 2 Biotransformação de células inteiras do substrato 1 ou 2 por cepa recombinante contendo UGT71BD1 ou cepa recombinante contendo acoplamento de UGT71BD1 com CtSus, respectivamente. A: Cromatogramas HPLC da biotransformação de células inteiras do substrato 1. O comprimento de onda de detecção foi de 360 ​​nm; B: Espectros HRESI-MS e MS2 do produto 1a; C: Cromatogramas de HPLC da biotransformação de células inteiras do substrato 2; O comprimento de onda de detecção foi de 330 nm. D: espectros HRESI-MS dos produtos 2a e 2b

Quando 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, fórmula molecular C9H6O4) foi usado como substrato, o pico cromatográfico do produto 1a (m/z 41.087 2 [M+H] +, fórmula molecular prevista C15H16O9) foi detectada aos 5,39 min, o que foi consistente com a absorção de UV do substrato e do produto de controle. Ao mesmo tempo, o pico do fragmento de m/z 179.033 4 [M+H]+ foi detectado no espectro MS2 de 1a, que foi produzido pela perda de uma molécula de glicose (162 Da) por 1a, indicando que 1a era o produto do substrato 1 conectado a uma molécula de glicose. A taxa de conversão foi calculada integrando a área do pico. Verificou-se que a taxa de conversão de células inteiras UGT71BD1 catalisando o substrato 1 para gerar o produto glicosilado 1a foi de 71,87%, enquanto a adição de CtSus aumentou a taxa de conversão da reação para 95,84%, que foi 1,3 vezes maior que a do grupo controle. Quando o substrato era o composto 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, fórmula molecular C14H12O3), os picos cromatográficos do produto 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, valor molecular previsto fórmula C20H22O8) e 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, fórmula molecular prevista 26H32O13) foram detectados aos 10,32 e 6,52 min, respectivamente, o que foi consistente com a absorção UV característica do substrato e o produto controle. Um pico de fragmento foi detectado em 227.071 3 [MH]-, que foi produzido pela perda de uma molécula de glicose (162 Da), indicando que 2a era o produto do substrato 2 conectado a uma molécula de glicose. Comparando com os dados da literatura [18] e as informações de previsão da espectrometria de massa, foi determinado que o produto 2b era o produto do substrato 2 conectado a duas moléculas de glicose. A taxa de conversão foi calculada usando a área de pico integrada. Verificou-se que a adição de CtSus poderia aumentar a taxa de conversão da reação de glicosilação do substrato 2 de 64,01% para 78,51%, entre os quais o rendimento do produto monossacarídeo 2a aumentou de 45,09% para 63,58%, e o rendimento do produto dissacarídeo 2b passou de 18,92% para 14,93%.

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3.3 CtSus

Purificação de proteínas recombinantes e identificação da atividade catalítica enzimática in vitro Os resultados do experimento de conversão de células inteiras sugeriram que o CtSus tem a atividade de catalisar a produção de UDP-glicose doadora de glicose ativa. Para verificar ainda mais a atividade catalítica através da catálise enzimática in vitro, a proteína de fusão do gene CtSus no sistema de expressão pCold™ foi separada e purificada por cromatografia de afinidade. Os resultados mostraram que quando pCold™ I foi utilizado como vetor de expressão, a proteína recombinante foi expressa em grandes quantidades, mas principalmente no precipitado. Quando pCold™ TF foi utilizado como vetor de expressão, o gene CtSus foi expresso em grandes quantidades em E. coli (Figura 3A). A proteína de fusão foi purificada por cromatografia de afinidade HisTrap FF para reação enzimática in vitro. Os resultados são mostrados na Figura 3B. Quando sacarose e UDP foram utilizados como substratos, em comparação com o grupo controle negativo, um novo pico de produto foi detectado aos 10,32 min. Seu tempo de retenção e absorção de UV foram consistentes com a UDP-glicose. O produto provou ser UDP-glicose em comparação com o padrão. No entanto, uma vez que a proteína de fusão expressa pelo vetor de expressão pCold™ TF contém um marcador solúvel de fator desencadeante grande (o tamanho da proteína marcador é 48 kDa), ela terá um grande impacto na atividade catalítica da proteína. Portanto, o marcador da proteína de fusão foi ainda cortado pela enzima Fator Xa, e a proteína CtSus sem marcadores exógenos foi purificada (Figura 3A). A proteína foi submetida à catálise enzimática in vitro e os resultados mostraram que o rendimento de UDP-glicose aumentou de 3,53% para 10,66% (Figura 3B). Os resultados acima confirmaram a atividade de CtSus na catalisação da produção de UDP-glicose através de catálise enzimática in vitro, e também mostraram que a presença de um grande marcador de afinidade conduz à expressão solúvel de CtSus, mas também afetará significativamente a atividade catalítica in vitro da enzima.

Figura 3 Expressão heteróloga e identificação funcional de CtSus. A: Análise SDS-PAGE de proteínas CtSus. Pista 1: Marcador de proteína; Pista 2: CtSus recombinante com fator desencadeante; Pista 3: Clivagem da etiqueta Trigger13factor usando protease do Fator Xa para fornecer a proteína CtSus marcada pela seta vermelha. B: Ensaios enzimáticos invitro utilizando proteína de fusão e proteínas CtSus livres de fator desencadeante para catalisar a síntese de UDP-glicose na presença de sacarose e UDP, respectivamente, com padrão de referência UDP-glicose. A proteína fervida foi utilizada como grupo controle nas mesmas condições. O comprimento de onda de detecção foi de 260 nm