Funções Cistanche para Rim e Diabetes

A disfunção do relógio circadiano no túbulo renal leva ao aumento da gliconeogênese renal e hiperglicemia exacerbada no diabetes

para mais informações:ali.ma@wecistanche.com

Camille Ansermet1,6, Gabriel Centeno1,6, Yohan Bignon1,6, Daniel Ortiz2,6, Sylvain Pradervand3,Andy Garcia1, Laure Menin2, Fre´de´ric Gachon1,4, Hikari AI. Yoshihara5 e Dmitri Firsov1

¹Departamento de Ciências Biomédicas, Universidade de Lausanne, Lausanne, Suíça;²Serviço de Espectrometria de Massa, Instituto de Ciências Químicas e Engenharia, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Suíça;³Genomic Technologies Facility, Universidade de Lausanne, Lausanne, Suíça;⁴Instituto de Biociência Molecular, Universidade de Queensland, Queensland, Austrália; e ⁵Instituto de Física, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Suíça

oRelógio circadianoé um mecanismo de manutenção de tempo molecular onipresente que sincroniza funções biológicas celulares, teciduais e sistêmicas com 24-ciclos ambientais de hora. Os relógios circadianos locais conduzem ritmos específicos do tipo celular e do tecido e sua desregulação tem sido implicada na patogênese e/ou progressão de um amplo espectro de doenças. No entanto, o papel fisiopatológico da intrínsecarelógios circadianosno rim de diabéticos permanece desconhecido. Para responder a esta questão, induzimos o tipo Idiabetescom estreptozotocina em camundongos desprovidos do regulador transcricional circadiano BMAL1 em ​​podócitos (camundongos cKOp) ou norimtúbulo (camundongos cKOt). Não houve associação entre disfunção do relógio circadiano e desenvolvimento de nefropatia diabética em camundongos cKOp e cKOt com diabetes. No entanto, camundongos cKOt comdiabetesexibiram hiperglicemia exacerbada, excreção fracionária aumentada de glicose na urina, poliúria aumentada e hipertrofia renal mais pronunciada em comparação com camundongos controle tratados com estreptozotocina. As análises de expressão de mRNA e proteína revelaram um aumento substancial da via gliconeogênica emrinsde camundongos cKOt com diabetes em comparação com camundongos controle diabéticos. Análise transcritômica juntamente com análise funcional de camundongos cKot comdiabetesidentificaram alterações em múltiplos mecanismos que afetam direta ou indiretamente a via gliconeogênica. Assim, demonstramos que a disfunção do sistema intrínsecorimtúbuloRelógio circadianoagrava a hiperglicemia diabética via aumento da gliconeogênese norimtúbulo proximal e ainda destacar a importância do comportamento circadiano em pacientes comdiabetes.

PALAVRAS-CHAVE: oRelógio circadiano; diabetes; gliconeogênese; Túbulo proximal

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Declaração de Transição

Dentrodiabetes, arimcontribui para o desenvolvimento da hiperglicemia diabética aumentando a reabsorção de glicose da urina primária e regulando positivamente a gliconeogênese no túbulo proximal. No entanto, esses2 processos também são controlados peloRelógio circadiano, um mecanismo que sincroniza uma variedade de funções renais específicas com ciclos diários de claro-escuro. Aqui, demonstramos que a disfunção do relógio circadiano intrínseco no túbulo renal pode agravar a hiperglicemia diabética via aumento da gliconeogênese renal. Esses resultados destacam a importância dos efeitos circadianos em pacientes diabéticos, com potenciais implicações para o controle da glicose

Diabetesé uma doença sistêmica na qual o rim desempenha um papel particular. Na diabetes, arimcontribui para o desenvolvimento da hiperglicemia diabética aumentando a reabsorção de glicose da urina primária1 e aumentando a produção de glicose via gliconeogênese.2,3 Entretanto, a elevação a longo prazo dos níveis de glicose no sangue pode, por sua vez, causar nefropatia diabética (ND), uma das complicações mais graves de diabetes, caracterizada por danos glomerulares, tubulares e vasculares no rim. Embora o estresse metabólico seja o principal fator envolvido na patogênese e progressão da ND, a hiperglicemia por si só não leva à insuficiência renal na maioria dos pacientes diabéticos. e/ou progressão acelerada da DN. Pesquisas recentes sugeriram que o mecanismo do relógio circadiano está na interseção de vários processos (pato) fisiológicos norim.5 Condicionar oRelógio circadianoem diferentes tipos de células renais em modelos animais resulta na interrupção dos ritmos circadianos da taxa de filtração glomerular (TFG),6 perda parcial do controle da pressão arterial,7,8 alterações substanciais nas vias metabólicas renais9,10 e progressão acelerada de doenças crônicasdoenca renal.11 Em humanos, o desalinhamento circadiano relacionado ao trabalho por turnos entre o relógio biológico e os ritmos de alimentação e atividade está associado à diminuição da TFG,12 aumento da excreção urinária de albumina,13 noctúria e aumento da produção renal de urina14 e aumento do risco de doença renal crônica.15

Curiosamente, oRelógio circadianonorimcontrola ou está interconectado com muitas vias celulares que estão envolvidas na patogênese dadiabetese/ou DN. Por exemplo, o nocaute específico do túbulo renal do ativador transcricional BMAL1 (também chamado ARNTL), um elemento central da maquinaria do relógio circadiano, resulta em um aumento acentuado nos níveis de expressão de mRNAs que codificam proteínas envolvidas na gliconeogênese renal de glutamina, incluindo o transportador de glutamina SNAT3 (SLC38A3), glutaminase (GLS) e glutamato desidrogenase 1 (GLUD1).9 Mais importante, essas alterações de expressão ocorrem em animais nocaute normoglicêmicos. Slominskiet ai. demonstraram que a proteína do relógio circadiano PER1 está envolvida na regulação transcricional do transportador de glicose Sglt1 (Slc5a1) nas células do túbulo proximal,16 e Ansermet al. demonstraram que o relógio circadiano em podócitos controla a expressão do gene Arhgap24 associado à predisposição a DN tanto no diabetes tipo 1 quanto no tipo 2.6 Demonstrou-se que altos níveis de glicose e deficiência tubular de BMAL1 induzem fortemente a expressão do inibidor de quinase dependente de ciclina p21CIP1 (Cdkn1a ), um fator crítico no desencadeamento da senescência celular no rim diabético.9,17 A nicotinamidaadenina dinucleotídeo-dependente deacetilase sirtuína 1 (SIRT1), um dos principais reguladores de danos podócitos em DN,18 foi identificado como um regulador mestre do circuito de feedback de energia dentro da rede de clock central.19 Outro mecanismo celular que liga o DN com oRelógio circadianoé o alvo mamífero da rapamicina, uma quinase que coordena o metabolismo celular com a manutenção do tempo circadiano.20 O alvo mamífero alterado da sinalização da rapamicina também foi reconhecido como um importante fator patogênico no dano induzido pelo diabetes às células tubulares renais,21 podócitos,22 e células endoteliais glomerulares23 e mesangiais24 . Coletivamente, essas observações sugerem que as perturbações do relógio circadiano norimpode influenciar o desenvolvimento da hiperglicemia diabética por estimular a gliconeogênese tubular renal e/ou reabsorção de glicose, ou por atuar como um "second hit" contribuindo para a patogênese da ND. Para abordar essas hipóteses, geramos e caracterizamos camundongos com estreptozotocina (STZ) tipo I induzidadiabetese eliminação específica doRelógio circadianocoordenador Bmal1 em podócitos glomerulares ou no túbulo renal.

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MÉTODOS

Os animais foram mantidos ad libitum na dieta padrão de ração de laboratório (dieta KLIBA NAFAG 3800). Todos os experimentos foram realizados em camundongos machos.

Modelos de mouse

A inativação do gene Bmal1 (Arntl) foi induzida por 2-tratamento semanal com doxiciclina (DOX; 2 mg/ml na água potável) de8-Bmal1lox/lox/Nphs2-rtTA de uma semana de idade camundongos /LC1 (camundongos cKOp) ou de camundongos 8-Bmal1lox/lox/Pax8-rtTA/LC1 de uma semana de idade (camundongos cKOt). Seus controles de ninhada (camundongos Bmal1lox/lox) receberam o mesmo tratamento com DOX. Ambos os modelos foram previamente descritos e validados.6,9 Uma semana após o término do tratamento com DOX, tipo Idiabetesfoi induzida por injeções ip de STZ (50 mg/kg de peso corporal [BW]; diariamente por 5 dias). Camundongos tratados com veículo receberam injeções de veículo de solução salina tamponada com fosfato. Todos os experimentos foram realizados 8 semanas após a última injeção de STZ ou veículo. Em todos os experimentos, a coleta de tecido e sangue foi realizada de camundongos sacrificados em ZT9 (ZT indica unidades de tempo Zeitgeber; ZT0 é o tempo de luz acesa e ZT12 é o tempo de luz apagada).

Gaiolas metabólicas

Os camundongos foram alojados em gaiolas metabólicas individuais (Tecniplast). A coleta de urina foi realizada em 24 horas após um período de adaptação de 4-dia.

Química do plasma e da urina

As concentrações urinárias e plasmáticas de Na+, K+, Ca2+, Mg2+, fosfato, creatinina, glicose, urato e uréia e osmolalidade foram medidas pelo Laboratoire de prestations de Chimie Clinique do Centre Hospitalier Universitaire Vaudois. O pH urinário foi avaliado com um medidor de pH (Metrohm). O pH do sangue e os gases sanguíneos foram medidos em sangue arterial-venoso misto usando um analisador de sangue épico (Siemens Healthcare). O amônio urinário foi medido pelo método de Berthelot. O ácido titulável urinário foi medido usando o método de Chan.25 Os níveis plasmáticos de aldosterona foram medidos por radioimunoensaio (DPC). A insulina plasmática foi determinada usando um kit da Mercodia

TFG

A TFG foi medida em animais anestesiados com isotiocianato de insulina-fluoresceína, conforme descrito anteriormente.26

Teste de tolerância à glicose IP

Após 15 horas de jejum, controle tratado com veículo ou STZ e cKotmice foram injetados ip com glicose (1 g/kg de PC). A glicemia foi medida com um leitor de glicemia em uma gota de sangue da cauda (Contour NextOne; Bayer) antes (tempo ¼ 0) e 15, 30, 60, 90, 120 e 180 minutos após a injeção de glicose.

Teste de tolerância à insulina

Após 4 horas de restrição alimentar, camundongos controle e cKot tratados com veículo ou STZ foram injetados ip com 0,5 U de insulina (insulina recombinante humana; Sigma) por kg de peso corporal. A glicemia foi medida antes da injeção de insulina (tempo ¼ 0) e 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos após a injeção de insulina. Se a glicemia diminuísse abaixo de 2 mM, os camundongos eram resgatados por injeção ip de 30 mg de glicose e eram excluídos da análise.

Sequenciamento de RNA

O sequenciamento de RNA foi realizado conforme descrito em Ansermet et al.6 A anotação do gene Musmusculus GRCm38.92 foi usada. As contagens de genes foram escalonadas usando a normalização de TMM e log-transformadas em contagens por milhão (CPM) usando a função "CPM" do pacote limma R.27 A expressão diferencial entre animais nocaute e controle foi calculada para os não tratados (solução salina tamponada com fosfato) e tratados ( STZ) e a interação entre as 2. Para cada uma das 3 comparações, genes com uma taxa de falsa descoberta (FDR) < 5="" por="" cento="" foram="" selecionados="" para="" uma="" análise="" de="" enriquecimento="" de="" ontologia="" genética="" "processo="" biológico"="" com="" "perfil="" de="" cluster".28="" termos="" com="" um="" valor="">< 0.01="" were="" considered="" as="" significant="" and="" further="" processed="" with="" the="" function="" "simplify"="" with="" default="" parameters="" to="" remove="">

Análise estatística

Todos os dados são expressos como média±SEM. Os testes estatísticos estão descritos nas legendas das figuras e na Tabela Complementar S10. P < 0,05="" foi="" considerado="" significativo.="" a="" análise="" estatística="" foi="" realizada="" com="" o="" software="" graphpad="" prism="" (versão="">

Western blot capilares

Western blots capilares foram realizados na University of Lausanne Protein Analysis Facility (https://www.unil.ch/paf/home/menuinst/technologies/western-in-capillaries.html). Sua quantificação foi realizada de forma cega por um técnico desta unidade.

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RESULTADOS

A inativação de Bmal1 em podócitos não leva à indução de DN em camundongos tratados com STZ

A inativação específica de podócitos de Bmal1 (Arntl) foi induzida por 2-tratamento de semanas com DOX (2 mg/ml em água potável) de 8-Bmal1lox/lox/Nphs2-rtTA/ de uma semana de idade Camundongos LC1 (doravante denominados camundongos cKOp).6 Seus controles da mesma ninhada (camundongos Bmal1lox/lox; doravante denominados camundongos de controle) receberam o mesmo tratamento com DOX. Conforme mostrado na Figura 1a, o tratamento com STZ (ver Métodos) levou à hiperglicemia, que não foi diferente entre os camundongos controle e cKOp. O PC foi menor nos animais tratados com STZ, mas esse efeito foi semelhante em camundongos de ambos os genótipos (Figura 1b). A TFG, medida usando a depuração de isotiocianato de insulina-fluoresceína, não foi diferente entre o controle tratado com STZ e os camundongos cKOp (Figura 1c). Os animais diabéticos apresentaram glicosúria (Figura 1d), poliúria (Figura 1e), proteinúria de baixo peso molecular (Figura 1f) e albuminúria leve (Figura 1f). No entanto, não houve diferença nesses parâmetros entre o controle tratado com STZ e os camundongos cKOp

Camundongos desprovidos de BMAL1 no túbulo renal exibem hiperglicemia exacerbada com diabetes

Conforme mostrado na Figura 2a, o peso corporal não foi diferente em camundongos de controle diabético e camundongos desprovidos de BMAL1 no túbulo renal (camundongos Bmal1lox/lox/Pax8-rtTA/LC19 tratados com DOX; doravante referidos como camundongos cKot). A análise do plasma sanguíneo revelou que a hiperglicemia induzida por STZ é exacerbada em camundongos cKOt em condições alimentadas e em jejum (Figura 2b e c, respectivamente). Nenhum dos outros parâmetros plasmáticos medidos, incluindo osmolalidade e sódio, potássio, fosfato, cálcio, magnésio, creatinina, concentrações de urato e aldosterona, foi diferente entre o controle tratado com STZ e camundongos c Kot, exceto pelo aumento dos níveis plasmáticos de uréia em camundongos cKOt (Tabela Suplementar S1). Os níveis de insulina no plasma não foram diferentes entre o controle tratado com STZ e os camundongos em jejum cKot (Figura 2d). Testes de tolerância à glicose e à insulina avaliados como a inclinação da concentração de glicose em declínio não revelaram diferenças significativas entre camundongos de qualquer genótipo em ambas as condições de tratamento (Figura 2e ef, respectivamente).Diabetes-induzidorimhipertrofia foi mais pronunciada em camundongos cKOt diabéticos do que em controles diabéticos (Figura 2g). A TFG não foi diferente entre camundongos tratados com STZ de ambos os genótipos (Figura 2h). O aumento induzido por STZ na ingestão de água e no volume de urina foi mais pronunciado em camundongos c Kot (Figura 3a eb, respectivamente), enquanto a osmolalidade da urina não foi diferente entre camundongos diabéticos de ambos os genótipos (Figura 3c). A excreção fracionada de glicose foi maior e a excreção fracionada de sódio foi menor em camundongos cKOt tratados com STZ em comparação com controles tratados com STZ (Figura 3d e e, respectivamente), enquanto os valores de excreção fracionada de fosfato (Figura 3f), magnésio (Figura 3g) e cálcio (Figura 3h) não foram diferentes entre os camundongos diabéticos de ambos os genótipos. Tanto os camundongos controle quanto os cKot tratados com STZ apresentaram proteinúria de baixo peso molecular semelhante, mas nenhuma albuminúria (Figura S1 complementar). Não foram encontradas grandes diferenças histológicas entre rins de controle tratado com veículo ou STZ e camundongos cKot (Figura S2 suplementar).

Figura 1|Características gerais do controle tratado com veículo ou estreptozotocina (STZ) e camundongos cKOp. (a) Glicemia sem jejum. (b) Peso corporal (PC). (c) Taxa de filtração glomerular (TFG) (clearance de insulina). (d) Glicose na urina. (e) Volume de urina. (f) Coloração com azul de Coomassie de proteínas urinárias. Para todos os camundongos, 0,3 por cento (vol) de 24-hora de urina foi carregado em um gel de eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida. A média ± SEM é fornecida. n=9 em cada grupo, exceto para medições de TFG, onde n=6 e n=9 camundongos foram usados ​​em grupos de controle e cKOp tratados com STZ, respectivamente. Todos os resultados foram obtidos de 19-animais de uma semana. Foi utilizada uma análise de variância de duas vias com o teste de comparações múltiplas Sidak. *P < 0.05,="" †p="">< 0,01,="" ‡p="">< 0,001.="" alb,="" albumina="" (65="" kda);="" lmwp,="" proteína="" de="" baixo="" peso="">

Figura 2|Características gerais do controle tratado com veículo ou estreptozotocina (STZ) e camundongos c Kot. (a) Peso corporal. n=8 para controle tratado com veículo e camundongos c Kot, e n=9 para controle tratado com STZ e camundongos c Kot. (b) Glicemia sem jejum. n ¼ 8 e n=9 para controle tratado com veículo e STZ e camundongos c Kot, respectivamente. (c) Glicemia em jejum (16 horas de jejum). n=9 para controle tratado com veículo e camundongos c Kot, e n=7 e n=6 para controle tratado com STZ e camundongos c Kot, respectivamente. (d) Níveis de insulina no controle tratado com veículo ou STZ e camundongos c Kot. n=9 en=6 para controle tratado com veículo e camundongos c Kot, respectivamente, e n=10 e n=7 para controle injetado com STZ e camundongos c Kot, respectivamente. Os níveis de insulina no plasma foram medidos em ZT18, no meio da fase inativa. (e) Os níveis de glicose no sangue foram medidos ao longo do teste de tolerância à glicose em veículo ou controle tratado com STZ e camundongos c Kot. n=9 para controle tratado com veículo e camundongos c Kot, e n=7 e n=6 para controle tratado com STZ e camundongos c Kot, respectivamente. (f) Os níveis de glicose no sangue foram medidos ao longo do teste de tolerância à insulina em veículo ou controle tratado com STZ e camundongos c Kot. n=5 para camundongos de controle tratados com veículo ou STZ, e n=6 para um veículo ou camundongos cKO tratados com STZ. (g)Diabetes-induzidorimhipertrofia. n{{0}} em cada grupo. A hipertrofia renal foi avaliada dividindo-se o peso do rim (KW) pelo peso corporal (BW). Os valores de KW/BW relativos para animais de controle injetado com STZ e c Kot foram calculados atribuindo 1{{10}}0 por cento a o grupo de veículo injetado correspondente. (h) Taxa de filtração glomerular (TFG) (clearance de insulina). n ¼ 5 e n ​​¼ 6 para controle tratado com STZ e camundongos c Kot, respectivamente. A média ± SEM é fornecida. Foi utilizada uma análise de variância de duas vias com o teste de comparações múltiplas Sidak. *P < 0,05,="" †p="">< 0,01,="" ‡p=""><>

Hiperglicemia exacerbada em camundongos cKOt correlaciona-se com o aumento da expressão de enzimas gliconeogênicas no rim

Para identificar as vias moleculares associadas à hiperglicemia exacerbada em camundongos cKOt tratados com STZ, realizamos análise de sequenciamento de RNA derimtranscriptomas seguidos de análise de enriquecimento da via do transcriptoma total e análises específicas de RNAs que codificam proteínas envolvidas na gliconeogênese renal e reabsorção renal de glicose. A comparação de transcriptomas revelou 1.833 transcritos expressos diferencialmente entre controles tratados com veículo e STZ (Tabela Suplementar S2; FDR < 5="" por="" cento),="" 1.784="" transcritos="" expressos="" diferencialmente="" entre="" camundongos="" ckot="" tratados="" com="" veículo="" e="" stz="" (tabela="" complementar="" s3;="" fdr="">< 5="" por="" cento),="" 3.107="" transcritos="" expressos="" diferencialmente="" entre="" o="" controle="" tratado="" com="" veículo="" e="" camundongos="" c="" kot="" (tabela="" complementar="" s4;="">< 5%),="" and="" 2667="" transcripts="" differentially="" expressed="" between="" stz-treated="" control="" and="" c="" kot="" mice="" (supplementary="" table="" s5;="" fdr="" <="" 5%).="" gene="" ontology="" analysis="" of="" differentially="" expressed="" transcripts="" revealed="" enrichment="" of="" pathways="" related="" to="" lipid,="" amino="" acid,="" and="" carboxylic="" acid="" metabolism,="" and="" organic="" anion="" transport="" between="" control="" and="" cko="" mice="" in="" both="" vehicle="" and="" stz="" treatment="" groups="" (figure="" 4a="" and="" b,="" respectively,="" and="" supplementary="" tables="" s6="" and="" s7,="" respectively).="" a="" total="" of="" 284="" transcripts="" exhibited="" genotype-by="" treatment="" interaction="" effects="" (supplementary="" table="" s8;="" fdr="" <="" 5%),="" including="" glud1="" and="" g6pc="" transcripts="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" renal="" gluconeogenesis="" (see="" below).="" gene="" ontology="" analysis="" of="" transcripts="" with="" significant="" interaction="" showed="" enrichment="" of="" only="" a="" limited="" number="" of="" pathways,="" mainly="" related="" to="" lipid="" metabolism="" and="" organic="" anion="" transport="" (figure="" 4c="" and="" supplementary="" table="" s9).="" among="" the="" genes="" encoding="" transporters="" involved="" in="" glucose="" reabsorption="" in="" the="" proximal="" tubule="" (sglt1,="" sglt2,="" glut1,="" and="" glut2),="" only="" glut1="" (slc2a1)="" displayed="" higher="" expression="" in="">rinsde camundongos cKOt diabéticos em comparação com controles diabéticos (Tabela Suplementar S5).

Figura 3|Ingestão de água e características da urina de controle tratado com veículo ou estreptozotocina (STZ) e camundongos c Kot. (a) A 24-hora de ingestão de água. n=8 para controle tratado com veículo ou camundongos cKOt, e n=9 para controle tratado com STZ ou camundongos cKOt. (b) O volume de urina de 24-horas. n=8 para controle tratado com veículo ou camundongos cKOt, e n=9 para controle tratado com STZ ou camundongos cKOt. (c) Osmolalidade da urina. n=8 para camundongos de controle tratados com veículo, n=7 para camundongos c Kot tratados com veículo e n=9 para camundongos de controle ou cKOt tratados com STZ. (d) Excreção fracionada (Fe) de glicose. n=8 para controle tratado com veículo ou camundongos cKOt, e n=9 para controle tratado com STZ ou camundongos cKOt. (e) Fe de sódio. n=8 para camundongos de controle tratados com veículo, n=7 para camundongos c Kot tratados com veículo e n=9 para camundongos de controle ou cKOt tratados com STZ. (f) Fe de fosfato. n=8 para camundongos de controle tratados com veículo, n=7 para camundongos cKOt tratados com veículo, n=8 para camundongos de controle tratados com STZ e n=9 para camundongos tratados com STZ camundongos cKOt. (g) Fe de magnésio. n=8 para camundongos de controle tratados com veículo, n=7 para camundongos c Kot tratados com veículo e n=9 para camundongos de controle ou cKOt tratados com STZ. (h) Fe de cálcio. n=8 para camundongos de controle tratados com veículo, n=7 para camundongos c Kot tratados com veículo e n=9 para camundongos de controle ou cKOt tratados com STZ. Significa SEM é dado. Foi utilizada uma análise de variância de duas vias com o teste de comparações múltiplas Sidak. *P < {{50}}.05,="" †p="">< 0,01,="" ‡p="">< 0,001.="" pc,="" peso="">

Os 2 principais precursores gliconeogênicos norimarelactato e glutamina.29 Conforme mostrado na Figura 4d ee e na Tabela Suplementar S5, os níveis de expressão de proteínas codificadoras de transcrições envolvidas na gliconeogênese renal de glutamina (Snat3, Gls e Glud1) foram aumentados nos rins de camundongos cKOt tratados com STZ em comparação com controles tratados com STZ .Por outro lado, a expressão do mRNA que codifica a glutamato amônia ligase (Gull), que reverte a etapa inicial da glutaminolise, conduzida por GLS, foi diminuída. Da mesma forma, os níveis de expressão de mRNAs que codificam 2 enzimas na parte comum da via gliconeogênica (a saber, fosfoenolpiruvato carboxiquinase [Pck1] e glicose-6-fosfatase [G6pc]), foram maiores em camundongos cKOt tratados com STZ. A maior expressão de GLUD1 e PCK1 em rins de camundongos cKOt diabéticos foi confirmada no nível de proteína por Western blot capilar (Figura 4f e Figura Suplementar S3). No fígado de camundongos diabéticos, o nível de expressão de GLUD1 não foi diferente entre o controle e os camundongos c Kot, e a expressão de PCK1 foi menor nos camundongos c Kot (Figura complementar S4). É importante notar que os níveis de expressão de Glud1, Snat3, frutose-1,6-bifosfato 2 (Fbp2) e Glut1 foram maiores e os níveis de expressão de Glul, Fbp1 e Glut2 foram menores emrinsde camundongos cKOt tratados com veículo em comparação com controles tratados com veículo.

Figura 4|Análise de enriquecimento de ontologia gênica (GO) "Processos Biológicos". (a) Análise GO de transcritos diferencialmente expressos emrinsde controle tratado com veículo e camundongos c Kot. (b) Análise GO de transcritos diferencialmente expressos em rins de camundongos controle e Kot tratados com estreptozotocina (STZ). (c) Análise GO de transcritos exibindo efeito de interação genótipo por tratamento. Gráficos de pontos para os 20 termos mais significativos (valor Q < 0.01).="" os="" termos="" redundantes="" foram="" filtrados.="" geração="" representa="" a="" fração="" de="" genes="" significativos="" anotados="" com="" o="" termo="" exibido.="" o="" tamanho="" do="" ponto="" representa="" o="" número="" de="" genes="" significativos="" anotados="" com="" o="" termo="" exibido.="" n="6" por="" condição.="" (d)="" gráficos="" de="" mudança="" de="" dobras="" para="" enzimas="" codificadoras="" de="" transcritos="" e="" transcritos="" envolvidos="" na="" gliconeogênese="" renal.="" os="" valores="" do="" nível="" de="" expressão="" foram="" extraídos="" das="" tabelas="" suplementares="" s2,="" s3,="" s4="" e="" s5.="" *p=""><0,05, †p="">< 0,01,="" ‡p="">< 0,001.="" (e)="" representação="" esquemática="" das="" células="" do="" túbulo="" proximal="" com="" as="" principais="" proteínas/enzimas="" envolvidas="" no="" processo="" de="" gliconeogênese="" renal.="" em="" vermelho:="" valores="" de="" p="" para="" expressão="" diferencial="" entre="" controle="" tratado="" com="" stz="" e="" camundongos="" c="" kot.="" em="" azul:="" valores="" de="" p="" para="" expressão="" diferencial="" entre="" controle="" tratado="" com="" veículo="" e="" camundongos="" c="" kot.="" as="" setas="" vermelhas="" e="" azuis="" indicam="" expressão="" aumentada="" ([)="" ou="" diminuída="" (y)="" em="" camundongos="" ckot.="" (f)="" análise="" quantitativa="" de="" western="" blots="" capilares="" para="" glutamato="" desidrogenase="" (glud1)="" e="" fosfoenolpiruvato="" carboxiquinase="" (pck1;="" figuras="" suplementares="" s2="" e="" s3,="" respectivamente)="">rinsde controle tratado com solução salina tamponada com fosfato ou STZ e camundongos c Kot (n=6 condição). Foi utilizada uma análise de variância de duas vias com o teste de comparações múltiplas Sidak. *P < 0.05,="" †p="">< 0,01,="" ‡p="">< 0,001.="" au,="" unidade="" arbitrária;fbp1/2,="" frutose-1,6-bifosfatase="" 1/2;="" g6pc,="" glicose-6-fosfatase;="" gls,="" glutaminase;="" glul,="" glutamina="" sintetase;="" glut2,="" transportador="" de="" glicose2;="" nhe3,="" trocador="" de="" sódio-hidrogênio="" 3;="" p="" ajustado,="" p="" ajustado;="" pc,="" piruvato="" carboxilase;="" snat3,="" transportador="" de="" glutamina;="" tca,="">

Múltiplos mecanismos que afetam direta ou indiretamente a via gliconeogênica são alterados em rins de camundongos diabéticos cKOt

A via gliconeogênica norimpode ser influenciado peloRelógio circadianoseja diretamente, por meio do controle transcricional, traducional ou pós-traducional de proteínas envolvidas na gliconeogênese renal, ou indiretamente, por afetar outros mecanismos renais que estão intrinsecamente ligados à produção de glicose no túbulo proximal. Fatores transcricionais, coativadores e correpressores que governam a transcrição de enzimas gliconeogênicas foram parcialmente caracterizados no fígado, rim e outros tecidos. As Figuras 5a e b resumem as alterações nos níveis de expressão de transcritos que codificam reguladores transcricionais conhecidos da gliconeogênese emrinsde camundongos de controle e cKOt (ver também Tabelas Suplementares S4 e S5). Entre os transcritos analisados, aqueles que codificam o receptor d ativado por proliferador de peroxissoma (PPARd) e os criptocromos 1 e 2 mostraram um aumento substancial, enquanto o receptor nuclear NR1D1 (também conhecido como REV-Erba) foi substancialmente diminuído nos rins de camundongos cKOt em ambos os veículos- e STZ- animais tratados em comparação com controles com o mesmo tratamento. A expressão do coativador g do receptor ativado por proliferador de peroxissoma 1-a (Pgc1a, Ppargc1a) foi aumentada em camundongos cKOt tratados com STZ em comparação com controles tratados com STZ, e a expressão do receptor de glicocorticóide (Gr, Nr3c1) foi diminuída em camundongos cKOt tratados com veículo comparado com controles tratados com veículo. Expressão de proteína O box forkhead (Foxo1), fator nuclear de hepatócitos 4a (Hnf4a), proteína de ligação ao elemento responsivo a monofosfato de adenosina cíclico (Creb1), Para, Sirt1, proteína de ligação a CREB (Cbp, Crebbp), coativador transcricional 2 regulado por CREB (Crtc2), e a histona deacetilase 3 (Hdac3) não foi afetada pelo tratamento ou genótipo

Figura 5|(a) Gráficos de mudança de dobra para transcritos que codificam fatores de transcrição, coativadores e correpressores que governam a transcrição de enzimas gliconeogênicas em camundongos controle e cKOt tratados com veículo e estreptozotocina (STZ). Os valores do nível de expressão foram extraídos das Tabelas Suplementares S2, S3, S4 e S5. *P < 0.{{10}}5,="" †p="">< 0,01,="" ‡p="">< 0,001.="" (b)="" representação="" esquemática="" dos="" dados="" apresentados="" na="" figura="" 5a.="" em="" vermelho:="" valores="" de="" p="" para="" expressão="" diferencial="" entre="" controle="" tratado="" com="" stz="" e="" camundongos="" ckot.="" em="" azul:="" valores="" de="" p="" para="" expressão="" diferencial="" entre="" controle="" tratado="" com="" veículo="" e="" camundongos="" ckot.="" as="" setas="" vermelhas="" e="" azuis="" indicam="" expressão="" aumentada="" ([)="" ou="" diminuída="" (y)="" em="" camundongos="" ckot.="" ua,="" unidade="" arbitrária;="" cbp,="" xxx;="" creb1,="" xxx;="" crtc2,="" xxx;="" cry1,="" xxx;="" cry2,="" xxx;="" foxo1,="" xxx;="" g6pc,="" xxx;="" gr,="" xxx;="" hdac3,="" xxx;="" hnf4a,="" xxx;="" nrld1,="" xxx;="" pck1,="" xxx;ppara,="" xxx;="" pparg,="" xxx;="" sirt1,="">

Como a acidose é o principal estímulo indireto para a gliconeogênese renal, medimos o pH sanguíneo e urinário, gases sanguíneos, excreção urinária de amônia (NH3/NH4+) e acidez titulável. Conforme mostrado na Figura 6, o pH do sangue foi maior em camundongos cKOt tratados com veículo em comparação com controles tratados com veículo, mas não foi diferente entre camundongos diabéticos de ambos os genótipos. O bicarbonato plasmático foi menor em controles diabéticos em comparação com controles tratados com veículo; entretanto, não foi encontrada diferença no bicarbonato plasmático entre camundongos controle diabético e cKOt. O excesso de base plasmática e o pH urinário não foram afetados pelo tratamento ou genótipo. No entanto, os camundongos cKOt tratados com STZ excretaram quantidades aumentadas de amônia e acidez titulável em comparação com os controles tratados com STZ. A análise dos transcritos que codificam proteínas envolvidas no manuseio ácido-base revelou diminuição da expressão do trocador de hidrogênio de sódio NHE3 (Slc9a3; ver Figura 4d e e) e do trocador aniônico AE1 (Slc4a1) e aumento da expressão da anidrase carbônica II (Car2) e da subunidade b1 da H+-ATPase (Atp6v1b1). No entanto, não foi observada diferença nos níveis de expressão do antiportador cloreto-próton Clcn5, subunidade b2 de H+-ATPase (Atp6v1b2), transportador de amônia Rhcg, cotransportador de bicarbonato de sódio NBCE1 (Slc4a4), trocador de cloreto-bicarbonato dependente de sódio NDCBE (Slc4a8) e troca aniônica pendrina (Pds, Slc26a4) camundongos cKOt diabéticos comparados com controles diabéticos (Tabela Suplementar S5). É importante notar que os níveis de expressão de Nhe3 foram mais baixos nos rins de camundongos cKOt tratados com veículo em comparação com controles tratados com veículo (Figura 4d e Tabela Suplementar S4).

DISCUSSÃO

Está bem estabelecido que a disfunção doRelógio circadianomecanismo ou um desalinhamento entre o relógio biológico e os sinais sociais e ambientais causados ​​(por exemplo, pelo trabalho em turnos) dependência de computador/internet, jetlag frequente ou distúrbios do sono são os principais fatores de risco para a patogênese e/ou progressão de uma variedade de doenças crônicas. No entanto, a contribuição dos relógios circadianos locais intrínsecos ao tecido versus sinais circadianos sistêmicos para processos fisiopatológicos específicos não foi amplamente investigada. Nós hipotetizamos que as perturbações nos relógios circadianos renais intrínsecos podem contribuir para o desenvolvimento de ND e/ou hiperglicemia diabética. Para testar essas hipóteses, usamos 2 modelos de camundongos (ou seja, camundongos cKOp e cKOt) desenvolvidos em um fundo genético C57BL/6 conhecido por ser relativamente resistente a DN. Em ambos os modelos, a deficiência de BMAL1 em ​​condições diabéticas não resultou em albuminúria adicional ou diferença na TFG, 2 principais características da doença. Isso sugere que camundongos transgênicos em um fundo C57BL/6 podem não ser um modelo apropriado para estudar a hipótese de "segundo-hit" no DN ou que a patogênese e/ou progressão do DN são mais afetadas por perturbações circadianas sistêmicas do que por relógios circadianos renais intrínsecos. Testando a hipótese de interação entre hiperglicemia diabética e insuficiência renal intrínsecarelógios circadianosrevelaram via gliconeogênica tubular renal aumentada e hiperglicemia exacerbada em camundongos cKOt diabéticos. As análises de expressão de mRNA e proteína indicaram que tanto a gliconeogênese da glutamina quanto a parte comum da via gliconeogênica são aumentadas em camundongos cKOt diabéticos em comparação com controles diabéticos. Esta observação sugeriu que ambos os principais substratos gliconeogênicos norim(ie, glutamina e lactato) poderiam contribuir para o agravamento da hiperglicemia em camundongos cKOt.

Figura 6|pH plasmático, bicarbonato plasmático, excesso de base plasmática, pH urinário, 24-hora de acidez titulável na urina (AT) e excreção de amônio em controle tratado com veículo ou estreptozotocina (STZ) e camundongos cKOt. n ¼ 6–9. Foi utilizada uma análise de variância de duas vias com o teste de comparações múltiplas Sidak. *P < 0.05,="" †p="">< 0,01,="" ‡p=""><>

Rima gliconeogênese ganhou maior interesse nos últimos anos devido ao papel potencialmente importante da glicose produzida no túbulo renal tanto no equilíbrio metabólico sistêmico quanto na doença renal (revisado anteriormente2,30). O rim é responsável por 40% da produção total de glicose de novo do corpo em humanos em jejum noturno.29 Emdiabetes, tanto o fígado quanto o rim aumentam a síntese de glicose, mas o aumento relativo na gliconeogênese renal é muito mais forte do que no fígado. Estudos no fígado mostraram que aRelógio circadianopode influenciar a gliconeogênese hepática através de múltiplosRelógio circadianomecanismos celulares controlados. Zhang et ai. demonstraram que os repressores circadianos criptocromos 1 e 2 inibem a expressão de enzimas gliconeogênicas bloqueando a ativação dependente de monofosfato de adenosina cíclica de CREB1.31Li et al. demonstraram que NR1D1, que forma um membro negativo crítico no relógio circadiano central, suprime a transcrição de Pck1 e G6pc.32 Como esperado para genes do relógio circadiano em camundongos knockout Bmal1,33 nossos resultados demonstraram uma forte regulação positiva de transcritos Cry1/Cry2 e uma forte regulação negativa de Transcrição Nr1d1 emrinsde camundongos cKOt diabéticos em comparação com controles diabéticos. Esses resultados contraditórios podem sugerir especificidade tecidual da regulação da gliconeogênese pelos elementos centrais do relógio. Interessantemente,rinsde camundongos cKOt diabéticos exibiram uma forte indução de Ppard, que demonstrou estimular dramaticamente a expressão de Pck1 no músculo.34 Finalmente, a expressão do mRNA que codifica PGC1a, um coativador crítico de FoxO1, um fator de transcrição que controla a expressão de enzimas gliconeogênicas no rim e no fígado, foi aumentada nos rins de camundongos cKOt diabéticos. Coletivamente, a análise dos transcriptomas renais revelou que camundongos cKOt diabéticos apresentam alterações substanciais em várias vias celulares envolvidas no controle da gliconeogênese norime/ou outros tecidos.

Avaliação de potenciais mecanismos através dos quais ocircadianorelógiopode influenciar a via gliconeogênica no diabéticorimrevelou várias características do estado ácido-básico do sangue compensado, incluindo aumento da excreção urinária de amônio e acidez titulável. Essas observações compararam dados transcriptômicos que demonstraram uma redução nos níveis de expressão do transcrito que codifica o NHE3, um transportador que desempenha um papel fundamental no manuseio ácido-base do túbulo proximal, juntamente com um aumento potencialmente compensatório na expressão do gene que codifica a subunidade Atp6v1b1 da HþATPase envolvida na secreção de H+ em o néfron distal. O controle direto da expressão de Nhe3 pelo relógio circadiano tem sido demonstrado tanto em nível transcricional16 quanto de expressão proteica.35 Assim, a acidificação intracelular devido à redução da expressão de NHE3 pode ser considerada uma possível causa do aumento da gliconeogênese nas células do túbulo proximal de camundongos cKOt. Esses resultados são paralelos aos achados de Onishi et al.,36 que demonstraram que o knockout tubular específico do NHE3 resulta no aumento da expressão de enzimas gliconeogênicas no rim. O aumento da parte comum limitante da via gliconeogênica (Pck1 e G6pc) em camundongos cKOt diabéticos pode agravar ainda mais a acidificação intracelular através do aumento da gliconeogênese da glutamina, um processo metabólico que gera íons hidrogênio. Curiosamente, a expressão de Nhe3, Glul, Glud1 e Snat3, bem como de vários fatores de transcrição codificadores de transcrição, coativadores ou correpressores que governam a transcrição de enzimas gliconeogênicas (Gr, Ppard, Nr1d1, Cry1 e Cry2) foi modificada de maneira semelhante em STZ- e camundongos cKOt tratados com veículo. Isso sugere que a gliconeogênese renal também é aumentada em camundongos cKOt tratados com veículo.rim.

Qual é a relevância desses achados para a patogênese dadiabetesem humanos? Está bem estabelecido que o ritmo de alimentação desempenha um papel importante no arrastamento dos relógios circadianos periféricos.37 Componentes alimentares (por exemplo, alto teor de sal,38 dietas com baixo teor de carboidratos e alta proteína39 e dieta cetogênica40) e fatores parácrinos/autócrinos impulsionados pela ingestão de alimentos (por exemplo, , corticosteróides41) demonstraram ter um forte impacto nos ritmos circadianos norim. Vários grandes grupos populacionais são periodicamente ou constantemente expostos à ingestão alimentar alterada ou desordenada. Por exemplo, até 20% a 25% dos funcionários norte-americanos e europeus realizam trabalho por turnos, o que está associado a um padrão de alimentação alterado.42 O segundo grupo de rápido crescimento com comportamento alimentar afetado é o de viciados graves em internet, que representam, de acordo com estimativas atuais, 6 por cento a 8 por cento da população geral.43 Distúrbios do sono,44 doença renal crônica45 e alguns medicamentos (por exemplo, cisplatina46) também demonstraram prejudicar significativamente os ritmos circadianos renais. Assim, pode-se especular que em uma fração substancial de pacientes diabéticos, a hiperglicemia pode ser ainda pior devido à desregulação dos relógios circadianos em tecidos periféricos, incluindo intrínseca renalrelógios circadianos. Nessa linha, um grande número de estudos demonstrou uma forte associação entre o trabalho em turnos e o risco de desenvolver diabetes (revisado anteriormente47). Coletivamente, nossos resultados fornecem uma nova ligação molecular entre o sistema circadiano e a fisiopatologia da doença.diabetes.

Cistanche pode prevenir doenças renais

DIVULGAÇÃO

Todos os autores declararam não haver interesses conflitantes.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi financiado pela bolsa de pesquisa da Swiss National Science Foundation 310030-188499 (para DF) Uma parte deste trabalho foi submetida como um resumo à Reunião Anual de 2021 da Sociedade Americana de Nefrologia.

CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR

HAIRY, FG e DF desenharam o estudo; CA, GC, DO, YB e AG realizaram experimentos; CA, GC, DO, SP, LM e HAIY analisaram os dados; CA e HAIY fizeram os números; DF e HAIY escreveram o manuscrito. Todos os autores aprovaram a versão final do manuscrito.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Arquivo Complementar (PDF)

Figura S1. Coloração com azul de Coomassie de proteínas de urina de controle tratado com veículo ou estreptozotocina (STZ) e camundongos cKOt.

Figura S2. (A) Coloração tricrômica de Masson derimseções de controle tratado com veículo ou estreptozotocina (STZ) e camundongos cKOt. (B) Coloração com ácido periódico de Schiff (PAS) de seções renais de camundongos controle e cKOt tratados com veículo ou estreptozotocina (STZ).

Figura S3. Análise de Western blot capilar da expressão de glutamatodesidrogenase 1 (GLUD1; A) e fosfoenolpiruvatecarboxiquinase (PCK1; B) emrinsde controle tratado com veículo ou estreptozotocina (STZ) e camundongos cKOt.

Figura S4. Análise capilar de Western blot da expressão de glutamatodesidrogenase 1 (GLUD1; A) e fosfoenolpiruvatecarboxiquinase (PCK1; B) no fígado de camundongos controle e cKOt tratados com veículo ou estreptozotocina (STZ).

Tabela S1. Química do plasma em controle injetado com veículo ou estreptozotocina (STZ) e camundongos cKOt.Arquivos Suplementares (Excel)

Tabela S2. Transcrição: controle estreptozotocina (STZ) versus controle solução salina tamponada com fosfato (PBS).

Tabela S3. Transcrição: nocaute (KO) estreptozotocina (STZ) versus KO solução salina tamponada com fosfato (PBS).

Tabela S4. Transcrição: solução salina tamponada com fosfato (PBS) nocaute (KO) versus PBS de controle.

Tabela S5. Transcrição: nocaute (KO) estreptozotocina (STZ) versus controle STZ.

Tabela S6. Enriquecimento de ontologia gênica (GO) para solução salina tamponada com fosfato (PBS) nocaute (KO) versus PBS de controle.

Tabela S7. Enriquecimento de ontologia gênica (GO) para nocaute (KO)estreptozotocina (STZ) versus STZ controle.

Tabela S8. Transcrição: interação genótipo por tratamento.

Tabela S9. Enriquecimento de ontologia gênica (GO) para interação.

Tabela S10. Estatisticas.

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