Polissacarídeos Cistanche Deserticola Têm Efeito Neuroprotetor

para mais informações:Ali.ma@wecistanche.com

Yue Liu, e outros

Abstrato:

O AVC isquêmico é uma doença com alta morbidade e mortalidade.Cistanchedeserticolapolissacarídeos(CDP) possuem uma ampla gama de efeitos benéficos, incluindo hepatoproteção e homeostase imunológica. Até onde sabemos, o efeito protetor da CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)em neurônios lesados ​​por privação/reperfusão de oxigênio-glicose (OGD/RP) não foi investigado. Neste estudo, OGD/RP lesionou um modelo de célula PC12. Resumidamente, CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)({{0}},05, 0,5 e 5 ug/ml) foi administrado antes da reperfusão. O efeito protetor do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)foi então avaliado com base na viabilidade celular, vazamento de lactato desidrogenase (LDH), [Ca2 mais] I, potencial de membrana mitocondrial (MMP) e apoptose celular, estado de andredox após a reperfusão foi avaliado por meio do ensaio de espécies reativas de oxigênio (ROS), catalase ( CAT), glutationa peroxidase (GSH-Px) e capacidade antioxidante total. Com base no fato de que a proteína DJ associada à doença de Parkinson-1 participa da antioxidação endógena e realizaneuroprotetorefeitos após isquemia, investigamos a interação entre CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)e DJ{{0}}. A expressão de DJ-1 foi detectada por ELISA e análise de Western blot, e a translocação de DJ-1 foi avaliada por imunofluorescência. Os resultados mostraram que a CDP (0,05, 0,5 e 5 ug/ml) atenuou a morte celular PC12, preservou MMP e homeostase do cálcio; inibiu o estresse oxidativo e diminuiu a apoptose celular. Além disso, CDP (5 ug/ml) estimulou marcadamente a secreção e expressão de DJ{10}}. No geral, os resultados sugeriram que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)exerce umneuroprotetorefeito contra lesões induzidas por OGD/RP, inibindo o estresse oxidativo e regulando a via DJ-1

Palavras-chave:Cistanche deserticola, Polissacarídeos, Neuroprotetor, Privação/reperfusão de glicose de oxigênio, Estresse oxidativoDJ-1

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1. Introdução

O AVC isquêmico é a segunda principal causa de mortalidade e a principal causa de incapacidade de longo prazo em todo o mundo [1]. Espera-se que a morte por acidente vascular cerebral aumente para 7,8 milhões em 2030 [2]. Na China, 58 a 142 por 100,000 pessoas morrem de derrame a cada ano. Assim, estratégias eficazes que revertam a lesão de isquemia-reperfusão devem ser desenvolvidas. Extensas evidências sustentam que o estresse oxidativo é o principal fator que promove o desenvolvimento e progressão do infarto cerebral durante a reperfusão[3,4]. Portanto, descobrir a eficácianeuroprotetoragentes capazes de reduzir EROs e suprimir o estresse oxidativo tem despertado considerável interesse em pesquisas. A proteína DJ associada à doença de Parkinson-1 medeia a neuroproteção ao estimular a expressão de genes antiapoptóticos e antioxidantes [4,5]. DJ-1 pode ser translocado para a mitocôndria por estresse oxidativo e estimulação de mitógenos e pode ser secretado para a matriz extracelular em condições patológicas, como câncer de mama, melanoma e lesão de OGD/RP [6]. Além disso, DJ-1 é útil no direcionamento terapêutico para neurodegeneração isquêmica devido ao seu papel crítico na anti-oxidação [4,7]. Nos últimos 10 anos, vários grupos confirmaram que DJ-1neuroprotetorefeitos em modelos de isquemia cerebral focal in vivo e modelos de OGD/RP in vitro [6-9]. Enquanto isso, algumas drogas, incluindo ciclosporina A e fenilbutirato de sódio, anulam a morte celular neuronal via DJ-1 upregulation inischemia acidente vascular cerebral [9,10 ].

Cistanchedeserticola, a planta seca integral deCistanchedeserticolaYCMa e Cistanche tubulosa Wight, é produzido principalmente nas áreas desérticas do norte e noroeste da China [11]. C. deserticola é comestível e foi homenageado como o 'Ginseng dos desertos'. Na prescrição de pontos de acupuntura, é usado como tratamento para doença renal crônica, impotência sexual, infertilidade feminina, leucorréia, metrorragia e constipação senil [12].C. deserticola polissacarídeos, um importante componente ativo isolado deCistanche deserticola. CDP, modula a função imunológica e o equilíbrio lipídico e fornece proteção contra envelhecimento, oxidação e danos no fígado. Além disso, CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)previne lesão de isquemia-reperfusão no coração e fígado [13,14]. Estudos recentes relataram que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)são não tóxicos[12,15,16], e outros fitoquímicos extraídos de C. Deserticola, incluindo echinacoside, isoacteoside, acteside e salidroside, exibemneuroprotetorefeitos [11,12]. No entanto, o uso potencial de CDP para a melhoria dos danos do acidente vascular cerebral isquêmico não foi relatado até agora.

No presente estudo, levantamos a hipótese de que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)inibe o estresse oxidativo para neuroproteção. Os potenciais efeitos protetores do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)danos de acidente vascular cerebral de inisquemia foram examinados usando células PC12 danificadas por OGD/RP. As interações subjacentes associadas ao DJ-1 foram então exploradas.

2. Métodos

2.1. Cultura celular e modelo OGD/RP

As células PC12 foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10 por cento de FBS a 37 graus em uma incubadora normóxica contendo 5 por cento de CO2. O meio foi substituído a cada 48 h. O modelo OGD/RP foi preparado. As células PC12 foram lavadas e expostas à solução salina balanceada de Earle. Em seguida, as células foram transferidas para uma câmara anaeróbica contendo 5 por cento de CO2 e 95 por cento de N2 a 37 graus por 4 h e, em seguida, reoxigenadas. Nessa etapa, o mesmo volume de meio de cultura foi adicionado às células. Após a reoxigenação, as células foram colocadas em uma incubadora normóxica por 24 h.

2.2. Administração de Drogas

CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)foi adquirido da Yuanye Biological Technology Co., Xangai, China (C23J7Y18405, > 98 por cento de pureza). Nimodipina, um fármaco preventivo de primeira linha para acidente vascular cerebral isquêmico, foi usado como um composto de controle positivo [17-19]. A injeção de nimodipina foi da Bayer Company. As células foram divididas aleatoriamente em seis grupos, a saber, o controle, veículo (OGD/RP), Nimo (5 ug/ml), CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)(0,05 ug/ml), CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)(0,5 ug/ml) e CDP (5 ug/ml). Nimodipina e CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)foram adicionados antes da reperfusão. O grupo controle foi cultivado em meio normal e incubado em condições normóxicas.

2.3. Viabilidade celular: ensaios MTT e NRU

Células PC12 (6 × 103 por poço) foram semeadas em 96-placa de cultura de poço. As células foram tratadas de acordo com a necessidade de cada grupo. MTT (Solarbio, China) foi adicionado às células a uma concentração de 5 mg/ml e incubado por 4 h a 37 graus. Formazan é o produto de redução da succinato desidrogenase em células vivas [20]. DMSO foi adicionado para a dissolução do formazan azul gerado. A absorbância em um comprimento de onda de 490 nm foi detectada com Microplate Reader (Thermo, EUA) após as células serem agitadas por 10 min a 25 graus. Os resultados de viabilidade celular se manifestaram como uma porcentagem do grupo controle [21].

O ensaio de captação de vermelho neutro (NRU) foi realizado de acordo com um protocolo publicado anteriormente [22]. Quando os períodos de reperfusão foram completados, vermelho neutro (Solarbio, China) foi adicionado às células na concentração de 50 ug/ml. A mistura foi incubada por 3 h. Em seguida, as células foram lavadas rapidamente com uma solução contendo 0,5% de formaldeído e 1% de cloreto de cálcio. As células foram subsequentemente adicionadas a uma mistura contendo 1 por cento de ácido etílico e 50 por cento de etanol anidro. As placas foram lidas em absorbância de 540 nm após as células terem sido agitadas por 20 min a 37 graus. Os resultados de viabilidade celular manifestaram-se como porcentagem do grupo controle.

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2.4. Avaliação da citotoxicidade

A LDH é uma enzima citoplasmática que catalisa a oxidação do lactato topiruvato. A LDH é rapidamente liberada no líquido extracelular quando a membrana celular é danificada. Portanto, a detecção de LDH é geralmente realizada para avaliação de citotoxicidade. [23]. O procedimento experimental seguiu as instruções do kit comercial fornecido pelo kit de ensaio LDH (Jiancheng, China). A absorbância de cada amostra foi detectada em 440 nm com um leitor de microplacas. A porcentagem de morte celular foi calculada usando a seguinte fórmula: Viabilidade ( por cento )=(Tratamento OD − ODT em branco)/(OD Max atividade LDH − OD Max atividade LDH em branco) × 100 por cento .

2.5. Detecção de concentração intracelular de Ca2 mais

A concentração intracelular de Ca2 plus foi medida com Fluo-3/AM [15]. As células PC12 foram lavadas com PBS três vezes e depois incubadas com 2 μM Fluo-3/AM (Beyotime, China) por 30 min a 37 graus no escuro. As células foram então lavadas com PBS três vezes para a purga do corante extracelular. A intensidade de fluorescência do Fluo-3/AM foi determinada em um microscópio confocal de varredura a laser (Olympus, Japão). Pacote de software Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer e ImageJforam usados ​​para o cálculo dos valores de escala de cinza

2.6. Medição de MMP

JC-1 (5,5',6,6'-Tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilimidacarbocianina;Beyotime, China) é uma sonda sensível à voltagem conveniente geralmente usada para coloração células e avaliação de MMP [24]. As células PC12 foram lavadas duas vezes com PBS frio e depois incubadas com uma mistura contendo 50 por cento de meio e 50 por cento de líquido de trabalho por 15 min a 37 graus no escuro. Em seguida, a mistura foi descartada e substituída por um meio fresco. As imagens de fluorescência vermelha e verde foram capturadas através de microscopia confocal de varredura a laser. A proporção relativa de sinais de fluorescência vermelho e verde foi usada para medição de MMP [25]. Pacote de softwareOlympus FV10-ASW 4.1 Viewer e ImageJ foram usados ​​para o cálculo dos valores de escala de cinza.

2.7. Ensaio de detecção de apoptose, Hoeches33342 e análise de citometria de fluxo

Hoechst33342, um corante de ligação ao DNA, foi usado para o exame de apoptose celular [26]. Após reperfusão, as células PC12 foram lavadas três vezes com PBS e incubadas com Hoechst33342 (Beyotime, China) na concentração de 5 µg/ml por 15 min a 37 graus no escuro. Em seguida, as células foram observadas em microscópio confocal de varredura a laser. As células apoptóticas exibiram intensa fluorescência azul e condensação do núcleo. Para cada experimento de coloração, três campos aleatórios foram capturados e quantificados. Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer e ImageJforam usados ​​para o cálculo dos valores de escala de cinza. As porcentagens das células apoptóticas foram calculadas através da seguinte fórmula: quantidade apoptótica/quantidade total × 100 por cento [27].

2.8. Medição da geração de ROS

A sonda fluorescente 2',7'-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA; Jiancheng, China) pode penetrar nas membranas celulares e pode ser hidrolisada para DCFH não fluorescente. DCFH é oxidado por ROS intracelular para DCF fluorescente [29]. Após a reperfusão, as células foram lavadas duas vezes com PBS e depois incubadas com DCFH-DA a uma concentração final de 10 μM por 45 min a 37 graus no escuro. A fluorescência foi observada por espectrofotômetro de afluorescência com comprimento de onda de excitação de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 535 nm.

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2.9. Determinação de indicadores de estresse oxidativo: níveis de CAT, GSH-Px e T-AOC

As células foram raspadas e ressuspensas em PBS. As suspensões de células obtidas foram sonicadas 45 vezes em gelo e centrifugadas a 1000r/min por 10 min a 4 graus. Os sobrenadantes foram retidos e usados ​​para detecção [24]. O teor de proteína total do sobrenadante celular foi medido com um kit de reagente de ensaio de proteína BCA (KeyGEN, China). As atividades dos níveis de CAT, GSH-Px e T-AOC foram medidas de acordo com as instruções dos fabricantes (Jiancheng, China). A absorbância de cada amostra foi detectada com um leitor de microplacas.

2.10. Medição da concentração extracelular de DJ-1

As células PC12 (6 × 103 por poço) foram semeadas em 96-placas de cultura de poços. Após a reperfusão, o sobrenadante celular foi coletado e analisado pelo kit DJ-1/PARK-7 ELISA (Raybio, EUA ) de acordo com as instruções do fabricante [9]. A absorbância de cada amostra foi detectada com o Microplate Reader em um comprimento de onda duplo de 450 nm ou 540 nm.

2.11. Análise de Western Blot

As proteínas celulares foram extraídas com tampão de lise gelado de acordo com as instruções dos fabricantes (KeyGEN, China). A concentração de proteína foi determinada com um kit reagente de ensaio de proteína BCA. Quantidades iguais de lisados ​​de proteína (20 ug) de cada grupo foram resolvidas em 12 por cento de eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida e subsequentemente transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi incubada com PBS contendo 5 por cento de leite desnatado por 2 h à temperatura ambiente e depois sondada com anticorpos anti-PARK7/DJ-1 (ab76008, Abcam; diluição 1:1000) durante a noite a 4 graus. Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com PBST e incubada com anticorpo secundário IgG anti-coelho de cabra (SA00001-2, Proteintech Group; diluição 1:5000) em temperatura ambiente por 2 h. O anticorpo anti- -Tubulin(10759-1-AP, Proteintech Group; diluição 1:1000) foi considerado como controle. As bandas de proteína foram visualizadas por reagentes de reação de quimioluminescência aprimorada (ECL). As densidades de banda foram medidas com o software QuantityOne Analysis v.4.6.9.

2.12. Análise imunocitoquímica

As células PC12 foram fixadas em paraformaldeído a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente após o tratamento de reperfusão [9]. Após a remoção do excesso de paraformaldeído, as células foram incubadas em PBS contendo 0,3 por cento Triton X-100 por 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas com PBS três vezes antes de serem incubadas com 5% de soro normal de cabra por 1 h. As células foram então incubadas com cadeia monoclonal anti-ATP sintase de rato de coelho (MABS1304, EMD Millipore, diluição 1:200) para a coloração de mitocôndrias e subsequentemente incubadas com anticorpo anti-PARK7/DJ-1 (diluição 1: 100) para a sondagem da proteína DJ-1. As células foram lavadas e incubadas com IgG-Alexa 488 anti-coelho de cabra (verde; A11034, Invitrogen; diluição 1:1000) e IgG-Alexa 594 anti-camundongo de cabra (vermelho; A11032; Invitrogen; diluição 1:1000) por 90 min. Finalmente, as células foram lavadas três vezes com PBS e montadas em lâminas de vidro com um meio de montagem contendo DAPI. As imagens imunofluorescentes foram visualizadas usando um Microscópio Confocal de Varredura a Laser.

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2.13. Análise de dados/estatística

Todos os valores foram apresentados como média ± DP. A significância foi determinada por uma análise de variância One-Way (ANOVA), seguida pelo teste multi-comparação de Dunnett. p < .05="" foi="" considerado="" como="" significância="" estatística.="" os="" dados="" experimentais="" foram="" analisados="" ​​usando="" o="" software="" estatístico="" spss="">

3. Resultados

3.1. CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)inibiu o dano celular induzido por OGD/RP

As células PC12 expostas a OGD/RP exibiram uma diminuição significativa no número. A forma da célula foi alterada e a membrana celular foi quebrada. No ensaio MTT, as viabilidades celulares no CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)grupos ({{0}},05, 0,5 e 5 ug/ml) foram 58,91 por cento ± 5,40 por cento, 61,13 por cento ± 3,81 por cento e 68,57 por cento ± 3,24 por cento, respectivamente, p <0,05 (fig.="" 1a)="" ,="" e="" que="" com="" veículo="" teve="" 51,68="" por="" cento="" ±="" 3,89="" por="" cento="" .="" esses="" valores="" indicaram="" que="" o="">(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)protegeu as células contra a lesão de OGD/RP e diminuiu a morte celular. Além disso, a viabilidade celular no grupo Nimo foi de 77,02 por cento ± 5,22 por cento, que é quase igual à do CDP de 5 ug/ml(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)grupo tratado.

No ensaio NRU, as viabilidades celulares no CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)grupos ({{0}},05, 0,5 e 5 ug/ml) foram 52,03 por cento ± 4,72 por cento, 58,49 por cento ± 2,50 por cento e 69,17 por cento ± 3,91 por cento, respectivamente, (Fig. 1B) e que com veículo teve 47,14 por cento ± 2,88 por cento . Os valores indicaram o efeito protetor da CDP dependente da concentração.

Em contraste com um veículo (44,73 por cento ± 3,30 por cento), a liberação de LDH foi significativamente reduzida no CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)grupos. No CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)grupos ({{0}},05, 0,5 e 5 ug/ml), as taxas de vazamento de LDH foram 32,41 por cento ± 3,70 por cento, 27,13 ± 2,79 por cento e 23,13 por cento ± 4,59 por cento, respectivamente, p < 0,01="" (fig="" .="" 1c).="" além="" disso,="" as="" taxas="" de="" vazamento="" de="" ldh="" no="" grupo="" nimo="" foram="" de="" 21,99="" por="" cento="" ±="" 4,02="" por="" cento,="" o="" que="" foi="" quase="" igual="" ao="" do="" grupo="" tratado="" com="" 5="" ug/ml="" de="">

3.2. CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)aumento atenuado induzido por OGD/RP de [Ca2 mais ]i

Os níveis intracelulares de Ca2 plus nas células PC12 foram aumentados para 4146,60 ± 195,97 após lesão de OGD/RP em contraste com o grupo controle (373,62 ± 75,69). O CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)grupos ({{0}},05, 0,5 e 5ug/ml) poderiam diminuir de forma dose-dependente o nível de Ca2 mais intracelular para 2921,25 ± 222,19, 2015,85 ± 230,53 e 1768,43 ± 426,12, respectivamente (Fig. 2A e C ). Além disso, o nível de Ca2 plus no grupo tratado com 5 ug/ml de CDP diminuiu para um nível comparável ao do grupo Nimo (1591,19 ± 213,21).

3.3. CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)dissipação atenuada de MMP induzida por OGD/RP

Comparado com o grupo controle (1,67 ± 0,89), o grupo de veículos (0,48 ± 0,10) exibiu mais fluorescência FL verde do que FL vermelho fluorescência (Fig. 2B e D). As razões entre a fluorescência FL vermelha e verde foram reduzidas para 1,11 ± 0,26 e 1,18 ± 0,16 no CDP de 0,5 e 5 ug/ml(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)grupos tratados respectivamente, p < 0,01.="" a="" fluorescência="" do="" fl="" verde="" foi="" significativamente="">

3.4. CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)preveniu a apoptose celular induzida por OGD/RP

As células exibindo cromatinas condensadas ou núcleos fragmentados foram classificadas como células apoptóticas [30]. Os resultados do ensaio Hoechst33342 revelaram o aparecimento de núcleos condensados ​​após OGD/RP (Fig. 3A e C). Uma alta intensidade de fluorescência FL foi observada nos núcleos do grupo veículo. A intensidade de fluorescência FL dos núcleos foi enfraquecida no CDP de 5 ug/ml(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)grupo tratado. Analisamos a taxa de apoptose nas células PC12 por citometria colega usando coloração dupla FITC-Anexina V/PI (Fig. 3B e D). O grupo de controle teve uma taxa de apoptose celular de 4,16 por cento ± 0,24 por cento, enquanto o grupo de veículo teve 22,98 por cento ± 0,66 por cento. No grupo tratado com 5 ug/ml de CDP, a taxa de apoptose celular foi de 7,86 por cento ± 1,16 por cento.

3.5. CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)acumulação de ROS intracelular induzida por OGD/RP atenuada e estado redox preservado

Efeitos do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)sobre o estresse oxidativo foram demonstrados com base na geração de ROS, GSH-Px, atividades CAT e níveis de T-AOC. Os níveis de ROS nas células PC12 lesadas por OGD/RP aumentaram e tornaram-se significativamente maiores do que no grupo controle (p < 0,01).="" enquanto="" isso,="" os="" níveis="" de="" ros="" no="">(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)grupos ({{0}},05, 0,5 e 5 ug/ml) diminuíram de maneira dependente da dose (p < 0,01;="" fig.="" 4a).="" além="" disso,="" o="" cdp="" também="" aumentou="" significativamente="" os="" níveis="" de="" t-aoc="" (p="">< 0,05;="" fig.="" 4b),="" cat="" (p="">< 0,05;="" fig.="" 4c)="" e="" gsh-px="" (p="">< 0,05;="" fig.="" 4d)="" em="" comparação="" com="" o="" veículo="" grupo.="" as="" atividades="" de="" antioxidantes="" endógenos="" em="">(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)grupos aumentaram.

3.6. CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)estimulou a secreção de DJ-1 e melhorou a expressão de DJ-1

Alterações de concentração de DJ-1 no sobrenadante celular foram detectadas e revelaram a possível relação entre DJ-1 e CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos). A liberação de DJ-1 foi observada nas células PC12 danificadas por OGD/RP (Fig. 5). DJ-1 foi consideravelmente regulado positivamente no CDP de 5 ug/ml(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)-grupo tratado (38,66 ± 8,44 pg/ml) e aumentou significativamente do que no grupo veículo (18,33 ± 3,80 pg/ml, p < 0,01) e grupo controle (9,67 ± 3,96 pg/ml, p < 0,01) .

Para investigar os efeitos do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)na expressão intracelular de DJ-1, medimos os níveis de proteína DJ-1 por Western blotting. Os níveis de expressão da proteína DJ-1 aumentaram significativamente 24 h após a reperfusão. Por outro lado, o pós-tratamento de CDP de 5 ug/ml aumentou significativamente a superexpressão de DJ-1 em comparação com o grupo de veículo (p <0,01, fig.="">

3.7. CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)translocação aprimorada de DJ-1 para as mitocôndrias

As células PC12 foram coradas com anticorpos anti-PARK7/DJ-1 e anti-ATP sintase-cadeia (Figs. 7 e 8). O anticorpo de cadeia anti-ATP sintase liga-se ao complexo mitocondrial I, e o antígeno de ligação foi localizado na membrana interna mitocondrial. Os resultados revelaram que DJ{10}} translocou para a membrana interna mitocondrial após insulto OGD/RP (Fig. 8). Enquanto isso, os resultados da dupla coloração de DJ-1 e mitocôndrias revelaram que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)facilitou a translocação e co-localização mitocondrial DJ- 1 (Fig. 8). Esses resultados indicaram interação direta entre DJ-1 eneuroprotetorefeito do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)(Fig. 9).

4. Discussão

Neste estudo, relatamos em primeira mão que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)reduz efetivamente o dano celular PC12 induzido por OGD/RP através da regulação positiva da proteína DJ-1. CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)viabilidade celular melhorada, danos à membrana celular reduzidos, Ca2 intracelular mantido mais homeostase, perda de MMP prevenida, apoptose celular diminuída, estresse oxidativo suprimido, expressão promovida de DJ-1 e translocação de DJ-1 aprimorada para as mitocôndrias. DJ-1 foi recentemente implicado na regulamentação deneuroprotetorefeito e integridade mitocondrial. Esses resultados forneceram evidências convincentes daneuroprotetorefeitos do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)contra a isquemia. Além disso, a interação entre CDP e DJ-1 desempenha um papelneuroprotetorpapel no dano celular PC12 induzido por OGD/RP. Os resultados acima podem desenvolver nossa compreensão do efeito benéfico da CDP e podem fornecer informações úteis para a terapia de acidente vascular cerebral no futuro.

O AVC isquêmico tem sido atribuído a uma série complexa de mecanismos bioquímicos e moleculares, incluindo excitotoxicidade, sobrecarga de cálcio e estresse oxidativo. A OGD/RP é amplamente utilizada como modelo in vitro de isquemia-reperfusão e é utilizada para a exploração de alterações neurológicas e bioquímicas. A linhagem celular PC12 é sensível à lesão de OGD/RP [2]. Exibe uma série de propriedades e características dos neurônios simpáticos [32] e, portanto, linhagens de células neuronais amplamente utilizadas para pesquisas relacionadas aos mecanismos de dano neurológico devido ao acidente vascular cerebral [33,34]. Numerosos estudos indicaram que o estresse oxidativo desempenha um papel vital no acidente vascular cerebral e nos danos de isquemia cerebral [35-37]. A proteína DJ associada à doença de Parkinson{10}} pode inibir a neurodegeneração isquêmica e a disfunção comportamental, reduzindo a lesão neuronal mediada por ROS [7]. Portanto, usamos o modelo de célula PC12 com lesão de OGD/RP para investigar aneuroprotetorefeito do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos).

O grau de lesão em células PC12 induzida por OGD/RP foi avaliado por ensaios de liberação de MTT, NRU e LDH. Administração do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)({{0}},05, 0,5 e 5 ug/ml) melhorou a sobrevivência celular e diminuiu a liberação de LDH. Os efeitos benéficos do tratamento com CDP também incluíram uma diminuição da sobrecarga de cálcio intracelular e preservação de MMP. Anormalidades da concentração intracelular de Ca2 mais, especialmente sobrecarga de cálcio mitocondrial, têm sido associadas à apoptose neuronal e morte induzida por acidente vascular cerebral isquêmico [38]. A MMP pode refletir a eficiência da cadeia de transporte de elétrons e tem sido indicada como um índice de desordem patológica deste sistema [39]. Tanto a elevação da concentração intracelular de Ca2+ quanto a perda de MMP podem levar à desestabilização da estrutura do neurônio e, eventualmente, resultar em dano celular ou morte celular [21,40]. Neste estudo, os resultados demonstraram que a CDP inibiu significativamente a sobrecarga intracelular de Ca2 mais e aumentou os níveis de MMP em células PC12 com lesão de OGD/RP. A apoptose desempenha um papel vital na fisiopatologia complexa da lesão de isquemia-reperfusão cerebral. Dados crescentes sugeriram que a apoptose tem sido implicada na disfunção mitocondrial; a dissipação de MMP é um evento precoce resultando em apoptose celular [8,39]. A apoptose é um processo de morte celular programada dependente de energia para eliminar células redundantes. Muitos neurônios no acidente vascular cerebral isquêmico sofrerão apoptose [41]. Neste estudo, realizamos coloração Hoechst33342 e Anexina V-FITC/PI para examinar o efeito da CDP na apoptose [23,28]. Os resultados mostraram que a CDP mantém a integridade do núcleo e diminui a taxa de apoptose celular. Todos esses resultados indicaram que a atividade antiapoptótica da CDP contribuiu para o efeito benéfico na lesão neuronal em células PC12.

Células submetidas a danos de isquemia causados ​​pelo acúmulo excessivo de EROs, que podem levar à peroxidação lipídica, danos à membrana celular, sobrecarga de cálcio e disfunção mitocondrial, resultando em apoptose e morte celular. O consumo de antioxidantes endógenos, como SOD, CAT e GSH-Px, também indicou a ocorrência Fig. 9. Possíveis mecanismos para os efeitos protetores da CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)contra o dano celular PC12 induzido por OGD/RP. O tratamento de CDP suprime o estresse oxidativo, estabiliza a concentração de Ca2 plus e MMP, aumenta a expressão e localização de DJ-1 nas mitocôndrias. Y. Liu et ai. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 678de estresse oxidativo durante isquemia-reperfusão. Neste estudo, o grupo OGD/RP apresentou um aumento significativo de ROS e uma diminuição de CAT, GSH-Px e T-AOC em comparação com o grupo tratado com 5 ug/ml de CDP. No entanto, observamos diminuições substanciais nas taxas de geração de ROS e consumo de antioxidantes endógenos (CAT, GSH-Px e T-AOC) nos grupos CDP. Os efeitos benéficos no grupo CDP de 5 ug/ml foram próximos aos do grupo Nimo. Os resultados sugeriram que a CDP inibe a geração de ROS e restaura a defesa antioxidante enzimática.

DJ-1 é uma chave reativa redoxneuroprotetorproteína implicada na regulação do estresse oxidativo no acidente vascular cerebral. Os efeitos benéficos da superexpressão de DJ-1 incluem a sobrevivência celular de isquemia-reperfusão e preservação da função e morfologia mitocondrial, como a abertura de poros de transição de permeabilidade de mitocôndria precipitada [39,43]. Estudos anteriores indicaram que o efeito protetor de DJ-1 em células expostas a OGD/RP está relacionado às suas propriedades antioxidantes e translocação mitocondrial [43-45]. DJ-1 realiza neuroproteção endógena eficiente na mitigação de defeitos mitocondriais via translocação [46]. Vários estudos indicaram que a translocação de DJ{10}} pode afetar o movimento mitocondrial, melhorar a interação célula-célula e promover outros processos de pró-sobrevivência celular.

DJ-1 afeta vários processos, como migração e adesão celular, quimiotaxia, proliferação e apoptose, tanto em modelos in vitro quanto in vivo [6,9,47,48]. Usando o modelo de acidente vascular cerebral de células PC12 lesionadas por OGD/RP, exploramos uma relação potencial entre CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)e DJ-1. A superexpressão de DJ- 1 foi identificada por ELISA e Western blotting. Junto com esta função, uma descoberta importante nos experimentos demonstrou que a superexpressão significativa de DJ-1 ocorreu quando CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)(5 ug/ml) foi administrado antes da reperfusão. Isso sugeriu uma possívelneuroprotetorefeito na relação de CDP e DJ-1. Além disso, observamos que DJ-1 localizado na mitocôndria sob condições de OGD/RP e expressão abundante de DJ-1 diminuiu a sensibilidade celular a ROS e inibiu o estresse oxidativo [45]. Os resultados implicaram que o CDP regula e aumenta o DJ-1, que atua como um elo molecular entre a disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo e fornece uma progressão da morte celular secundária inerente ao acidente vascular cerebral [5,47,49-51]. Em conjunto com a estabilização de DJ-1 nas mitocôndrias, CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)o tratamento aumentou a sobrevida celular, estabilizou Ca2 mais a homeostase, melhorou a dissipação de MMP e previne a apoptose relacionada às mitocôndrias [43]. No geral, nossos resultados indicaram que o CDP exerce um novoneuroprotetormecanismo no tratamento do acidente vascular cerebral isquêmico.

5. Conclusão

Nossos resultados indicaram que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)protege as células PC12 contra lesões induzidas por OGD/RP por meio de seus efeitos antioxidantes, que são parcialmente atribuídos à via mediada por DJ-1. Esses efeitos incluem uma diminuição na taxa de dano à membrana celular, preservação da homeostase de [Ca2 mais] I, melhora da dissipação de MMP, inibição da apoptose celular, atenuação de ROS intracelular e modulação dos níveis de DJ-1. Os resultados também indicaram que as interações entre CDP e DJ-1 amplificam a neuroproteção e mantêm a integridade mitocondrial. Portanto, neurônios vulneráveis ​​podem ser protegidos por CDP(Cistanchedeserticolapolissacarídeos)através do aprimoramento da expressão DJ-1 durante o acidente vascular cerebral de isquemia.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (doação 81360649), o Programa Nacional de Ciência e Tecnologia (doação 2015BAK45B01) e o Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Região Autônoma de Ningxia Hui (doação 2016BZ07).

Polissacarídeos Cistanche Deserticolatenha um Efeito neuroprotetor

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