Abstrato

Introdução: A própolis é uma substância natural resinosa coletada pelas abelhas de brotos e exsudatos de várias árvores e plantas; é amplamente aceito que a composição da própolis depende das características fitogeográficas do local de coleta.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e pode eliminar espécies reativas de oxigênio, prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Objetivos: Este estudo teve como objetivo determinar a composição fitoquímica de extratos etanólicos de oito lotes de própolis coletados em diferentes regiões do Benin (norte, centro e sul) e Congo, na África.

Material e métodos:A caracterização das amostras de própolis foi realizada usando diferentes métodos cromatográficos hifenizados combinados com desreplicação por ressonância magnética nuclear de carbono-13 (13C NMR) com o software MixONat. Sua atividade antioxidante ou anti-produto final de glicação avançada (anti-AGE) foi então avaliada usando ensaios de difenilpicrilhidrazil e albumina de soro bovino, respectivamente.

Resultados: As análises cromatográficas combinadas com a desreplicação de 13C NMR mostraram que duas amostras do centro de Benin exibiam, além de uma grande quantidade de triterpenos pentacíclicos, estilbenóides metoxilados ou fenantrenos, responsáveis ​​pela atividade antioxidante do extrato da primeira. Entre eles, a combretastatina pode ser citotóxica. Para o segundo, as flavanonas preniladas conhecidas na própolis tipo Macaranga foram responsáveis ​​por sua significativa atividade anti-AGE. A amostra do Congo era composta por muitos derivados triterpênicos pertencentes à espécie Mangifera indica.

Conclusão: Portanto, a própolis do centro de Benin parece ser de particular interesse, devido às suas propriedades antioxidantes e anti-AGE. No entanto, como a padronização da própolis é difícil em zonas tropicais devido à sua grande diversidade química, é necessária uma análise fitoquímica sistemática antes de promover o uso da própolis em alimentos e produtos de saúde na África.

PALAVRAS-CHAVE

Desreplicação 13C NMR, estilbenoides ou fenantrenos metoxilados, triterpenos pentacíclicos, flavanonas preniladas, própolis

1. INTRODUÇÃO

A própolis é uma substância resinosa natural coletada pelas abelhas dos brotos e exsudatos de várias árvores e plantas, misturada com cera de abelha e enzimas salivares.1 É utilizada pelas abelhas para proteger a entrada de intrusos, tapar buracos, alisar paredes internas, mumificar animais mortos (pequenos insetos) no interior da colmeia, e equilibram condições extremas de umidade ou seca.2,3 A própolis tem sido amplamente utilizada na medicina popular desde a antiguidade devido a sua ampla gama de propriedades terapêuticas.4 A própolis é geralmente composta de resina (50 por cento ) , cera (30 por cento), óleos (10 por cento), pólen (5 por cento) e compostos fenólicos adicionais, como flavonoides.5,6 A composição química da própolis é conhecida por ser complexa e varia de acordo com as espécies de plantas que crescem ao redor da colméia , de onde as abelhas coletam exsudatos.7 É aceito que vários fatores, como a composição florística da área, o local e época de coleta, a estação do ano, o tipo de coletor, a disponibilidade e altitude e a atividade alimentar desenvolvida durante a exploração da própolis tem impacto na composição química da própolis.8,9 Existem diferentes tipos de própolis, dependendo da área geográfica de produção, origem botânica e composição química. Os tipos mais comuns de própolis são os temperados, de bétula, tropicais, mediterrâneos e pacíficos.10 A própolis de zonas de clima temperado, como Europa, América do Norte ou regiões não tropicais da Ásia, provém principalmente de exsudatos de brotos de espécies de Populus ( Salicaceae) e por isso é rico em flavonoides e ácidos fenólicos e seus ésteres; no entanto, a própolis tropical, originária de regiões onde nem choupo nem bétula crescem, é rica em derivados prenilados de ácidos p-cumáricos, benzofenonas ou terpenóides.11 A própolis do Pacífico, tipicamente rica em flavanonas preniladas, é outro tipo importante de própolis encontrado em Taiwan , Japão e Ilhas Salomão, e a própolis de bétula é encontrada especificamente na Rússia.12 O estudo da própolis da Ásia tropical levou à descoberta de Macaranga denarius L. e Mangifera indica L. como fontes vegetais de própolis indonésia.13 Sobre o por outro lado, espécies de coníferas da família Cupressaceae são a principal fonte botânica de própolis nas regiões mediterrâneas.14 Análises químicas revelaram que a própolis contém mais de 300 produtos naturais diferentes (NPs), incluindo derivados de ácido fenólico, cumarinas, flavonóides, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, esteróides, lignanas ou benzofenonas preniladas.15 Os efeitos biológicos da própolis foram descritos principalmente não apenas sobre seu antioxidante,16–18 anti-AGE (isto é, inibição da formação de produto final de glicação avançada [AGE]),19 anti - efeitos inflamatórios20 e antitumorais21–23, mas também suas atividades antibacteriana,24–26 antifúngica,15 antiviral27 e antiparasitária28. A própolis também é conhecida por estimular a produção de anticorpos, sugerindo seu uso potencial como adjuvante em vacinas.29 O uso crescente dessa substância natural de composição diversificada e, portanto, atividades biológicas variadas nas indústrias farmacêutica, cosmética e alimentícia despertam particular interesse na pesquisa científica, especialmente quando se trata de definir sua composição química. A maioria dos estudos foi realizada em amostras da Europa19,30–33 e da América Latina, mais especificamente do Brasil,20,23,34–36 enquanto poucos estudos foram conduzidos na África.37–41 As informações sobre a própolis beninense e congolesa42 permanecem escassas.

Assim, este estudo teve como objetivo caracterizar compostos majoritários de amostras de própolis coletadas em várias zonas fitogeográficas de Benin e Congo (África) usando desreplicação por ressonância magnética nuclear (NMR) 13C com o software MixONat.43,44 Um estudo preliminar usando um banco de dados (DB) contendo NPs previamente relatados da própolis juntamente com seus deslocamentos químicos previstos de 13C (δC) não produziram nenhum dado utilizável em comparação com os resultados satisfatórios geralmente obtidos com extratos de plantas.43-45 Isso pode ser explicado pela composição química da própolis, que é altamente dependente sobre a flora local, impossibilitando a construção de um DB quimiotaxonômico. Assim, para decifrar os principais compostos da própolis beninense e congolesa, no presente trabalho realizamos cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas com detecção por espalhamento de luz ultravioleta e evaporativa (HPLC-UV-ELSD-MS) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas ( GC-MS) em extratos brutos de própolis para identificar suas principais características estruturais e construir bancos de dados correspondentes de NPs adequados para o software MixONat.46 Em seguida, após um fracionamento grosseiro das amostras de própolis selecionadas de acordo com seu perfil químico, a desreplicação baseada em 13C NMR permitiu a identificação dos principais NPs sem purificação adicional. Ensaios antioxidantes e anti-AGE também foram realizados.

2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

2.1 Produtos Químicos

1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), reagente Folin-Ciocalteu, ácido fórmico e ácido gálico, todos de grau analítico, foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, França). 6-Hidroxi-2,- 5,7,8-tetrametilcroman-2-ácido carboxílico (Trolox®) e 50 - ácido cafeoilquínico (ácido clorogênico) foram obtido da Acros Organics (Geel, Bélgica).

2.2 Amostras de Própolis

Oito amostras de própolis beninense foram coletadas por raspagem de colméias em três zonas fitogeográficas (Tabela 1 e Figura SI-1). Uma amostra de própolis congolesa foi coletada na floresta artificial de acácias no planalto de Bateke, no centro da República do Congo (Tabela 1).

2.3 Extração de Própolis

Os extratos etanólicos de própolis (EEPs) foram inicialmente preparados usando o seguinte protocolo de extração.19 A própolis bruta foi primeiro pulverizada homogeneamente na presença de nitrogênio líquido. Para todas as amostras, 1 g de própolis em pó foi macerado em 20 ml de EtOH 95 por cento. Após agitação por 2 horas à temperatura ambiente, a mistura foi filtrada usando um filtro de funil de disco de vidro sinterizado (16-40 μm de tamanho de poro). O resíduo foi reextraído duas vezes usando as mesmas etapas. Em seguida, os três filtrados reunidos foram mantidos a 18 C durante a noite, filtrados para remover ceras e evaporados sob pressão reduzida (40 C, 10 bar) para fornecer os EEPs.

Quantidades de 8,0 g de própolis em pó de BC1 (1) e BC2 (2) ou 10,3 g de CG (3) foram extraídas novamente com EtOH 95 por cento (UAE, 4 80 ml, 15 min) para posterior cromatografia flash.

2.4 Determinação do teor de fenólicos totais

O teor de fenólicos totais foi determinado pelo método colorimétrico de Folin–Ciocalteu, conforme descrito anteriormente,19 e recentemente adaptado para uso direto em microplacas. Resumidamente, 10 ul de cada extrato de própolis em MeOH (3,5 mg/ml para BC1, 5 mg/ml para BN2, BC2 e CG, 7,5 mg/ml para BN1, BS1a, BS1b e BS2, e 10 mg/ml para BS3) foi misturado com 20 ul de água destilada e 10 ul de reagente Folin–Ciocalteu em uma microplaca de 96-poços. Após 3 min, 120 µl de água destilada e 40 µl de carbonato de sódio aquoso a 20 por cento foram adicionados. A absorbância foi medida em um espectrofotômetro de microplacas TECAN® (V6.5) a 760 nm após 30 min no escuro à temperatura ambiente. Um branco foi preparado da mesma forma usando MeOH em vez da solução de extrato e ácido gálico foi usado para calcular a curva de calibração (0,04–0,328 mg/ml; y=2,7241x 0,0039; r2=0 .9982). Cada amostra foi analisada em triplicado. O conteúdo fenólico total foi expresso em equivalentes de ácido gálico (mg) por grama de extrato (mg GAE/g).

2.5 Análises cromatográficas preliminares

2.5.1 TLC Analítico

A cromatografia analítica em camada fina (TLC) foi realizada em um TLC Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha), usando uma mistura de ciclohexano: AcOEt como eluente. Os pontos no cromatograma foram visualizados primeiro sob luz UV (254 nm) e depois por pulverização com reagente vanilina-ácido sulfúrico (2 ml de ácido sulfúrico concentrado em 98 ml de uma solução de vanilina 1:99 p/v: etanol a 95 por cento) e aquecer os cromatogramas a 110 graus C por 5 min.

2.5.2 Procedimento GC-MS

A análise GC-MS foi realizada em amostras não derivadas usando um Shimadzu Gas Chromatograph GCMS-QP2010 SE (Noisiel, França) com uma tensão de ionização de 70 eV (Electronic Impacto). As amostras foram preparadas em diclorometano (DCM) a 2 mg/ml para extratos e 1 mg/ml para frações. As separações foram realizadas usando uma coluna Phenomenex ZB5 (30 m * 0,250 mm de diâmetro interno com espessura de filme de 0,25 mm; Phenomenex, Le Pecq, França). A temperatura foi programada da seguinte forma: 180°C (3 min), 180-280°C a uma taxa de 10°C/min e 280°C (27 min). O hélio foi usado como gás de arraste a uma taxa de fluxo de 2,0 ml/min. As temperaturas do injetor e do detector foram definidas em 250 graus C e 280 graus C, respectivamente. Os metabólitos foram identificados comparando seus tempos de retenção (Rt), massa nominal e/ou padrões de fragmentação com amostras autênticas e/ou contidas nas bibliotecas de padrões de fragmentação do equipamento (NIST11, NIST11s e FFNSC2).

2.5.3 Procedimento HPLC-DAD-ELSD

As análises cromatográficas foram realizadas usando um cromatógrafo líquido Shimadzu 2030C 3D (Noisiel, França) equipado com um arranjo de diodosdetector (DAD) e um ELSD (Sedere®) com uma coluna Lichrospher® 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm id, 5 μm, Merck, Darmstadt, Alemanha ) protegido com um cartucho de proteção Lichrocart® 4–4 (4 mm x 4 mm di), usando uma taxa de fluxo de 1 ml/min. A fase móvel consistia de 0,1 por cento de ácido fórmico em água (solvente A) e metanol (solvente B), e a separação foi realizada pelo seguinte gradiente linear: 25-100 por cento B (0-40 min), 100 por cento (40-45 min). Os espectros UV-vis foram registrados na faixa de 190-600 nm e os cromatogramas foram adquiridos em 254 e 280 nm. ELSD foi aquecido a 30grauC, e um ganho de 4 foi aplicado ao sinal. As amostras foram preparadas em uma concentração de 10 mg/ml em MeOH e centrifugadas a 13,000 g por 10 min antes da injeção (10 ul) para remover vestígios de materiais suspensos.

2.5.4 Procedimento HPLC-UV-MS

As análises HPLC-UV-MS foram realizadas usando um módulo de separação 2795 Waters (Guyancourt, França) equipado com um detector Dual λ 2487 Waters. A coluna, as fases móveis e o gradiente foram os mesmos descritos acima para HPLC-DAD-ELSD. Os cromatogramas foram adquiridos em 254 e 280 nm. As análises de massa foram realizadas em um Bruker (Bremen, Alemanha) ionização por eletropulverização/ ionização química à pressão atmosférica (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 plus nos modos positivo e negativo como segue: gás de colisão, He; amplitude da energia de colisão, 1,3 V; nebulizador e gás de secagem, N2, 7 L/min; a pressão do gás nebulizador, 30 psi; temperatura seca, 340 C; taxa de fluxo, 1,0 ml/min; razão de divisão do solvente, 1:9; faixa de varredura, m/z 100–1,000. As amostras foram preparadas em uma concentração de 10 mg/ml em MeOH, centrifugadas a 13.000 g por 10 min e filtradas através de um filtro de seringa de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) de 0,45-μm antes da injeção (20 ul) para remover vestígios de materiais suspensos.

2.6 Fracionamento de EEP por cromatografia flash

Primeiro, 3,8 g de BC1 (1), 3,5 g de BC2 (2) ou 4.0 g de CG (3) EEPs foram dissolvidos em um volume mínimo de DCM e acetona e misturados com sílica gel (sílica relação gel:extrato, 2:1). Para todos eles, o solvente foi deixado evaporar até a obtenção de um pó fino e seco. Para cada EEP, o fracionamento foi então realizado usando um aparelho CombiFlash Teledyne ISCO (Lincoln, NE, EUA) com uma coluna de sílica gel (Chromabond® Flash RS 4{{2{52}}}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, França) a uma taxa de fluxo de 25 ml/min com ciclohexano (solvente A) e acetato de etila (EtOAc) (solvente B) usando o seguinte gradiente de eluição: (1) para BC1 EEP, 5 por cento B (0-10 min), 5-20 por cento B (10-30 min), 20-30 por cento B (30-60 min), 30-50 por cento B (60-85 min) e 50-100 por cento B (85–110 min); 160 tubos de 20 ml foram coletados e combinados em 14 frações (BC1_F1 a BC1_F14) com base em seus perfis cromatográficos TLC (relação ciclohexano:EtOAc, 90:10 a 50:50 ); (2) para BC2 EEP, 5 por cento B (0–10 min), 5–10 por cento B (10–20 min), 10–30 por cento B (20–40 min), 30–40 por cento B (40–55 min) e 40–100% B (55–70 min); 100 tubos de 20 ml foram coletados e combinados em 8 frações (BC2_F1 a BC2_F8) com base em seus perfis cromatográficos TLC (relação ciclohexano:EtOAc, 90:10 a 60:40 ); (3) para CG EEP, 5 por cento B (0–10 min), 5–10 por cento B (10–30 min), 10–20 por cento B (30–50 min), 20–40 por cento B (50–70 min), 40–60 por cento B (70–80 min) e 60–100 por cento B (80–90 min); 135 tubos de 20 ml foram coletados e combinados em 23 frações (CG_F1 a CG_F23) com base em seus perfis cromatográficos TLC (relação ciclohexano:EtOAc, 80:20 a 60:40 ).

Uma etapa adicional de fracionamento foi realizada na fração BC{{0}}F7: 200 mg foram dissolvidos em um volume mínimo de MeOH e misturados com C18-sílica gel (C18-sílica relação gel:extrato, 2:1). A separação foi realizada em uma coluna C18 (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, França) a uma taxa de fluxo de 15 ml/min com água (solvente A) e MeOH (solvente B) usando o seguinte gradiente de eluição: 50– 70 por cento B (0–30 min) e 70–100 por cento B (30–40 min); 80 tubos de 8 ml foram coletados e combinados em 5 frações (BC2_F7-1 a BC2_F7-5) com base em seus perfis de HPLC-UV (280 nm) .

2.7 1 Análises H e 13C NMR

Espectros de RMN (1D e 2D) de frações de própolis (7–58 mg) ou às vezes NPs foram registrados em clorofórmio deuterado (CDCl3) ou metanol deuterado (CD3OD) (500 ul) em um espectrômetro JEOL NMR a 400 MHz por 1 H e 100 MHz para 13C. Experimentos de NMR (1H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT-90 e 2D NMR) em frações e NPs puros foram realizados a 298 K em um espectrômetro JEOL 400 MHz H (JEOL Europe, Croissy -sur-Seine, França) equipado com uma sonda inversa 5-mm (ROYAL RO5). Os desvios químicos (δH e δC) são expressos em ppm e os valores de J em Hz.

Para espectros de 13C NMR (100 MHz), uma sequência de desacoplamento WALTZ-16 foi usada com um tempo de aquisição de 1,04 s (32.768 pontos de dados complexos) e um atraso de relaxamento de 2 s. Entre 1.500 e 11,000 varreduras foram coletadas para obter uma relação S/R satisfatória. Um filtro de ampliação de linha exponencial de 1 Hz foi aplicado a cada decaimento de indução livre (FID) antes da transformação de Fourier. Os espectros foram faseados manualmente e corrigidos pela linha de base usando o software MestReNova (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Espanha) e referenciados na ressonância central do solvente deuterado a δC 77,16 ppm (CDCl3) e δC 49,00 ppm (CD3OD). Para experimentos de aprimoramento sem distorção por transferência de polarização (DEPT), entre 512 e 5.500 varreduras foram necessárias e os alinhamentos com os espectros 13C foram feitos usando um determinado δC. Um limiar de intensidade mínima foi então usado para coletar manualmente sinais 13C NMR e DEPT-90 positivos e sinais DEPT-135 positivos e negativos, evitando possíveis artefatos de ruído.

O Própolis DB1 foi construído pela primeira vez através da busca de compostos descritos na própolis no SciFindern, 47 resultando em um DB de 1.471 NPs; Os valores de δC foram previstos usando preditores de RMN de Desenvolvimento Químico Avançado (ACD) (C, H). A partir desses bancos de dados contendo NPs juntamente com seus valores δC-SDF, a rotina CTypeGen incluída no MixONat criou um banco de dados adequado: ele lia o arquivo de dados espaciais (SDF) e classificava os deslocamentos químicos por tipo de carbono. O SDF do tipo c necessário foi então criado, ou seja, própolis tipo c DB1.43,44

Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 foi criado. Uma busca de substâncias usando as palavras-chave stilbenoids e phenantrenes no LOTUS DB contendo 276.518 NPs48 (LOTUS, 2022) permitiu obter um Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 de 2.681 NPs como um SDF. Flavanones DB3 foi então criado: Uma pesquisa no SciFindern47 usando a subestrutura 2-fenilcromano-4-permitiu selecionar de 56.679 moléculas. Eles foram ainda reduzidos para 2.893 referentes à "Ocorrência de produtos naturais" usando uma análise das substâncias com o filtro "Papel de referência" proposto pelo SciFindern. Após refino adicional por uma etapa de filtragem com base no peso molecular esperado (MW) (ou seja, 340 a 424 Da), todas as flavanonas relevantes foram subsequentemente exportadas como um SDF para obter as NPs de Flavanonas DB3 (684 NPs). Para cada NPs de DB2 e DB3, os valores de δC-SDF foram previstos usando o software ACD NMR predictors (C, H), bem como a metodologia previamente descrita por Nuzillard46 para obter diretamente o tipo c SDF pronto para uso por MixONat. O último contém para cada composto do DB os valores δC previstos organizados como metil, metileno, metino ou carbonos quaternários.

Triterpenos DB4 foi construído a partir do PNMRNP3 DB49,50 importado como um SDF no software de preditores ACD NMR (C, H) pesquisando triterpenos com MW entre 100 e 500 Da (ou seja, Dados de pesquisa: triterpenos; Pesquisa MW: 100 a 500) para obter diretamente um DB de 6.623 triterpenos no formato de arquivo do tipo c necessário.

Alk(en)il resorcinol e derivados de fenol DB5 foram construídos a partir do PNMRNP3 DB49,50 importado como um SDF no software ACD NMR preditores (C, H) pesquisando NPs com um scaffold de m-alk(en)il fenol e classificados como fenóis (ou seja, pesquisa de subestrutura 3-(hexadec-8-en-1-il)fenol; classe Classyfire de pesquisa: fenol) para obter diretamente um banco de dados de 44 NPs no formato de arquivo tipo c necessário.

2.8 13Desreplicação baseada em C NMR usando o software MixONat

A lista de picos e os dados de intensidade obtidos de cada espectro experimental (13C NMR, DEPT-135 e DEPT-90) foram exportados como um arquivo . csv usando o software Microsoft Excel (Microsoft 16.45) e usado como arquivo de entrada no software MixONat. Tais arquivos consistem em uma lista de valores de δC ordenados em ordem decrescente associados às suas intensidades na mesma linha, separados por vírgula.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. Em seguida, os dados experimentais dos NPs com as melhores pontuações foram comparados com a literatura.

2.9 Purificação

2.9.1 HPLC preparativa

A purificação das frações BC{{0}}F6 e BC1_F8 (40 mg em 2 ml de MeOH) foi realizada usando um preparativo Shimadzu LC-20AP cromatógrafo líquido equipado com um detector UV–vis SPD-40 (Noisiel, França), um loop de injeção de 2 ml e um coletor de frações FRC-10A, usando uma coluna preparativa C18 (25{{39 }} mm 21,2 mm id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, França) a uma taxa de fluxo de 21,24 ml/min. A fase móvel consistia em 0,1 por cento de ácido fórmico em água (solvente A) e metanol (solvente B) e a separação foi realizada usando o seguinte gradiente: (1) para BC1_F6, 40 por cento B (0–5 min), 40–70 por cento B (5–20 min) e 70–90 por cento (20–30 min); (2) para BC1_F8, 40–70 por cento B (0– 15 min) e 70–90 por cento (15-25 min). Os cromatogramas foram adquiridos em 254 e 280 nm.

2.9.2 Extração em fase sólida (SPE)

Para obter a fração mais polar de BC2-EPP (200 mg em 5 ml de MeOH misturado com 350 mg de C18-sílica gel após a evaporação), a purificação foi realizada usando uma coluna de extração em fase sólida C18 (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, França) com água: MeOH 7:3 (10 ml) e água: MeOH 6:4 (10 ml). Os tubos 4–10 foram combinados para formar a fração polar de BC2 (BC2_SPE) com base em seus perfis de HPLC-UV (330 nm).

2.10 Ensaios antioxidantes e anti-AGE

2.10.1 Sequestro de radicais DPPH

A avaliação de eliminação de radicais DPPH de EEPs beninenses foi realizada conforme descrito anteriormente.51 Resumidamente, as amostras testadas foram diluídas em EtOH absoluto a 0.02 mg/ml de soluções padrão a 1 mg/ml em dimetilsulfóxido (DMSO). Alíquotas (100 ul) dessas soluções diluídas foram colocadas em 96-placas de poços em triplicata. Cerca de 25 ul de solução de DPPH recém preparada (1 mM) foram adicionados a 75 ul de EtOH absoluto usando o injetor do leitor de microplacas (Infinite® 200, Tecan, França) para obter um volume final de 200 ul por poço. Após 30 minutos no escuro à temperatura ambiente, a absorbância foi determinada em 517 nm. O EtOH foi usado como branco, enquanto as soluções 10, 25, 50 e 75 μM de Trolox (um análogo hidrofílico do -tocoferol) foram usadas para a curva de calibração. Uma amostra de solução etanólica de ácido clorogênico (0,02 mg/ml) foi utilizada como padrão de controle de qualidade. Os resultados foram expressos em equivalentes de Trolox (micromoles de TE por g de extrato).

2.10.2 Ensaio anti-AGE

Os efeitos dos extratos de própolis e dos cinco principais derivados isolados de naringenina na formação de AGE foram determinados conforme descrito anteriormente.51 Resumidamente, albumina sérica bovina (BSA) (10 mg/ml) foi incubada com D-ribose ({{ 13}},5 M) juntamente com o composto testado (3 μM a 3 mM) ou extrato (1 ug a 1 mg) em tampão fosfato 50 mM a pH 7,4 (NaN3, 0,02 por cento). As soluções foram incubadas em placas de microtitulação 96-poços a 37 graus C por 24 h em um sistema fechado antes da medição de fluorescência de AGE. A fluorescência da amostra incubada em condições idênticas sem D-ribose foi subtraída para cada medição. A fluorescência de AGE semelhante à pentosidina (excitação a 335 nm, emissão a 385 nm) foi medida por fluorometria.52 Os valores de IC50 foram definidos como a quantidade de extrato (ug/ml) ou controle positivo (μM) necessária para reduzir a formação de AGE em 50 por cento relação ao controle negativo. De acordo com o ensaio de validação estatística,53 uma única análise é suficiente para uma determinação precisa do IC50.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Perfil cromatográfico

O perfil geral de LC dos oito EPP beninenses e congoleses usando o detector ELSD quase universal mostrou que todas as amostras continham compostos apolares, eluídos no final dos cromatogramas (Figura 1). BC1 também apresentou uma grande quantidade de compostos mais polares, e BC2 exibiu alguns compostos polares médios em quantidades menores. Compostos apolares em CG EEP parecem ser bem diferentes dos beninenses.

Assim, o perfil ELSD levou a três amostras diferentes e originais cuja composição foi investigada mais a fundo: BC1, BC2 e CG.

Primeiramente, foram realizadas análises de GC-MS, comparando a fragmentação do MS com o NIST DB, para caracterizar as classes químicas e, quando possível, identificar os constituintes. A identificação putativa (com base na porcentagem de correspondência com o NIST DB) e as classes químicas de compostos são apresentadas na Tabela 2 (os dados de perfil de corrente iônica total [TIC] GC são mostrados na Figura SI-2).

Todos os EEPs beninenses apresentaram os mesmos perfis de compostos apolares, rotulados como letra A a F, mas suas quantidades podem variar. Eles foram supostamente identificados como - ou -amrinona (A), -amirina (B), lupenona (C), -amirina (D), - ou acetato de -amirina (E) e acetato de lupeol (F) (cf. Figura SI -3), já descritos como os principais NPs da própolis mexicana.54 Zhang et al. (2014) e Tamfu et al. (2020) também descreveram triterpenóides como amirina/lupeol e acetatos de amirina/lupeol em várias amostras de própolis africanas.41,55 Apenas BC1 apresentou NPs adicionais eluídas entre Rt 10 e 15 min sugeridos como estilbenóides metoxilados ou fenantrenos de acordo com seus padrões de fragmentação. O EEP congolês exibiu um perfil diferente dos beninenses, com ésteres etílicos de ácido C16 e C18 como compostos mais voláteis associados com uma boa pontuação de correspondência de 94 por cento, um derivado de fenol em Rt 13,1 min, três derivados de resorcinol na faixa de 14– 17 min, e diferentes tipos de derivados triterpênicos após Rt 21 min.

Além disso, EPPs foram analisados ​​por HPLC-DAD-MS para visualizar NPs não voláteis (cf. Figura SI-4). Os diferentes perfis mostraram que BC1 EEP exibiu uma grande quantidade de compostos polares médios com cromóforos absorvendo em 280 nm, assim como BC2 em proporções menores, e CG possuía um perfil UV muito pobre em 280 nm.

3.2 Composição química de BC1 e BC2

Para identificar seus principais NPs usando desreplicação de 13C NMR com base em MixONat e DBs adequados, um fracionamento grosseiro de BC1 e BC2 EEP foi então obtido por cromatografia flash. De fato, para BC1, a análise GC-MS revelou a presença de estilbenóides metoxilados ou fenantrenos, o que nos guiou para construir os Stilbenoids _Phenanthrenoids DB2 específicos. Para BC2, exceto para os compostos mais polares em Rt 3,8 min, todos os compostos apresentaram espectros de UV de flavanonas-diidro flavonóis, o que sugeriu a criação das Flavanonas DB3.

Conforme ilustrado na Tabela 3, os diidrofenantrenos 1 e 3–5, os fenantrenos 2 e 6 e o ​​diidro estilbeno 7 (Figura 2) foram sugeridos no BC1 EEP por MixONat e validados por comparação com dados da literatura (cf. informações de suporte). Quando necessário, um filtro MW foi usado com base nos dados de HPLC-MS.

Mais precisamente, entre 9,10-derivados de diidrofenantreno de 2.681 NPs no DB2, MixONat sugeriu 6-metoxicelonin (2,7-dihidroxi-3,5-dimetoxi{ {10}},10-dihidrofenantreno; 3, classificação 1, pontuação 00,75, Figuras SI-13 e SI-14) em BC{{ 18}}F5 e sua presença foi confirmada por comparação com dados de NMR publicados. Já foi identificada em espécies de Combretaceae56 e na orquídea Bulbophyllum vaginatum; 57 e 2,7-diidroxi-3,4,6-trimetoxi- 9,10-dihidrofenantreno (4, classificação 1, pontuação 0,88, Figuras SI{{33 }} e SI-16) foi hipotetizado em BC1_F2. O composto 4 já foi descrito na própolis senegalesa58 e sua presença foi validada com base nos dados relatados por Pettit et al. da árvore africana Combretum caffrum59 e por Lu et al. de Dioscorea nipponica Makino.60

O processo de desreplicação baseado em 13C NMR também previu 2,6-dihidroxi-3,4,7-trimetoxi-9,10-dihidrofenantreno (5, classificação 8, pontuação 0.76, Figuras SI-15 e SI-16) em BC1_F2 e 2,6,7-trihidroxi{{20 }},4-dimetoxi-9,10-dihidrofenantreno (1, classificação 2, pontuação 0,5, figuras SI-5 e SI-6 ) em BC{{30}}F6-1 quando um filtro molecular em MW 288 Da foi usado. Para 1, a pontuação foi bastante baixa (0,5); portanto, experimentos adicionais de NMR 2D (correlações quânticas múltiplas heteronucleares [HMQC], conectividade de ligação múltipla heteronuclear [HMBC], espectroscopia de efeito de Overhauser nuclear [NOESY], cf. Figuras SI-7–SI-10) foram realizada para confirmar a estrutura; para 5, o escore foi de 0,76, ou seja, superior a 0,70. Esses dois PNs (1 e 5) foram mencionados pela primeira vez por Letcher et al. na espécie Combretum61,62 e 1 já foi encontrado na própolis senegalesa.58

Entre os derivados de fenantreno, MixONat hipotetizou 2,6,7-trihidroxi-3,4-dimetoxifenantreno (2, classificação 1, pontuação 00,88, Figuras SI-11 e SI{{10}}) em BC1_F8-1, o que foi confirmado por comparação com seus dados espectrais descritos por Letcher et al. em Combretum apiculatum. 61 2,7-Dihidroxi-3,4,6-trimetoxifenantreno (6, classificação 5, pontuação 0,94, Figuras SI-17 e SI-18) previamente isolado de Photolida Chinensis63 foi sugerido em BC1_F4.

Combretastatina B{{0}} (7), um dihidroestilbeno, foi sugerido por MixONat em primeiro lugar (pontuação 1,0, Figuras SI-17 e SI-19) em BC1 EPP ao usar um filtro MW (MW 304 Da) e validado por comparação com dados de RMN descritos por Pettit et al. em Combretum caffrum. 59

Os compostos 2, 6 e 7 já foram identificados na própolis senegalesa.58

Os dados de 1 H e 13C NMR de 1–7 estão disponíveis nas informações de suporte.

Para BC2, foram identificados sete compostos pertencentes a duas classes estruturais de polifenóis, cromona-C-glicosídeo e derivados de prenilflavanona (8-14), alguns dos quais foram descritos pela primeira vez na própolis (Figura 3).

O processo baseado em 13C NMR usando MixONat e DB1 para DB5 não deu resultados relevantes sugerindo NPs originais. Dois produtos principais (8–9) foram totalmente caracterizados como uma mistura usando espectros de massa e dados de NMR 1D e 2D (1 H, 13C, HMQC, HMBC, cf. Figura SI-20–SI-23) e identificados como florina (8) e isobiflorina (9), dois cromanona-Cglicosídeos recém-descritos na própolis, previamente descritos em Pancratium biflorum64 e cravo-da-índia de Eugenia caryophyllata, respectivamente.65

Em relação aos derivados de flavanona, entre 688 NPs no DB3, MixONat propôs 6-prenylnaringenin (10, rank 1, score 0.95, Figuras SI- 24 e SI{{8 }}) já descrito na própolis vermelha nigeriana66 em BC{{10}}F7-1. 6,8-Diprenylaromadendrin (12, rank 1, score 1.0, Figuras SI-28 e SI-29) e 6,8-diprenylnaringenin (lonchocarpol A ) (13, classificação 10, pontuação 0,84, figuras SI-30 e SI-31), encontradas anteriormente em amostras de própolis de Camarões,42 foram validadas em BC2_F{ {30}} e BC2_F5, respectivamente. 6-Geranilnaringenina (14, classificação 1, pontuação 0,84, Figuras SI-32 e SI-33), previamente descrita na própolis das Ilhas Salomão,67 foi hipotetizada e confirmada em BC{{41 }}F7-5. Finalmente, 6-dimetilalil naringenina (11) foi sugerido na segunda posição por MixONat em BC2_F6 (classificação 2, pontuação 0,65, Figuras SI-26 e SI- 27). O isômero da posição 8 foi proposto na primeira posição, mas uma comparação com dados da literatura 68,69 mostrou que é o isômero da posição 6. O composto 11 era novo na própolis, mas já descrito em extratos orgânicos de Monotes africanus. 70 1 Os dados H e 13C NMR de 8–14 estão disponíveis nas informações de suporte.

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