Capítulo 2: Fator 15 semelhante a Krϋppel suprime a proliferação de células mesangiais glomerulares renais através do aprimoramento da conjugação P53 SUMO1

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3. RESULTADOS

3.1|Triagem de genes de ligação KLF15-através de ChIP-Seq em MCs glomerulares renais primários

Para identificar os genes parceiros de ligação direta de KLF15, realizamos a análise ChlP-Seq e, finalmente, selecionamos 2.478 genes. A análise GO desses genes por meio da ferramenta do site www.uniprot.org (Figura 1A, B) revelou termos de função molecular associados a 1941 genes, termos de componentes celulares relacionados a 1662 genes e termos de processo biológico relacionados a 1766 genes. Como nosso objetivo era descobrir como o KLF15 afeta os MCs, nos concentramos nos genes relacionados ao processo celular. Entre os 1.315 genes relacionados ao processo celular, 74 genes participaram dos processos do ciclo celular; especificamente, esses genes participaram do ciclo celular mitótico, da transição de fase do ciclo celular e de outros processos (Figura 1C, D). Além disso, analisamos os genes envolvidos no crescimento e descobrimos que eles estavam relacionados ao crescimento do desenvolvimento, crescimento celular e outros tipos de crescimento (Figura 1E).

3.2|Triagem de genes regulados diferencialmente em KLF15-superexpressando MCs glomerulares renais usando SILAC e LC/MS

A análise de SILAC e LC/MS de HRMCs superexpressando KLF15 em comparação com células parentais levou à identificação de 1357 proteínas. Usamos o DAVID e o IPA para adquirir os domínios GO e as vias enriquecidas das proteínas quantificadas identificadas pelo SILAC. Curiosamente, muitos termos relacionados à função biológica de proteínas estavam entre os 30 principais termos GO significativamente enriquecidos, incluindo a regulação do processo metabólico de aminoácidos celulares, complexo de proteassoma, ligação a proteínas e termos de transcrição e tradução, todos intimamente relacionados a ubiquitinação (Figura 2A). A Figura 2B mostra os 30 principais termos de via significativamente enriquecidos. Vários termos de processos biológicos, incluindo os termos proteassoma e doença neurodegenerativa, também foram relacionados à ubiquitinação.

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3.3|Análise bioinformática de genes de ligação a KLF15-que estão potencialmente associados à proliferação de MC glomerular renal

Para explorar os genes de ligação KLF15-que estão potencialmente associados aglomerular renalproliferação de MC, realizamos uma análise bioinformática dos dados de ChIP-Seq e os dados de SILAC-LC/MS. Cinquenta e dois genes foram selecionados (Tabela 2 e Figura 2C), e cinco desses genes, incluindo SUMO1, fator inibidor de migração de macrófagos (MIF), fator de iniciação eucariótica (EIF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) e reticulolocalbina (RCN ), estavam intimamente relacionadosproliferação celular. Como as análises de GO e de vias das proteínas diferencialmente expressas sugeriram que os genes selecionados estavam relacionados principalmente ao processo de ubiquitinação, concluímos que SUMO1, um membro da família de proteínas ubiquitina-like (UBL), participa de modificações pós-traducionais semelhantes a ubiquitinação como o gene alvo de KLF15.

Quantidades crescentes de evidências indicaram que o HG é um dos principais fatores indutores do desenvolvimento de nefropatia diabética, e promove a proliferação de MC e aumento da síntese de matriz in vitro.25 Um estudo anterior mostrou que PDGF-BB é essencial para a proliferação de MC que precede o desenvolvimento de glomeruloesclerose em glomerulonefrite experimental.26 Após confirmar que MCs foram estimulados por HG ou PDGF-BB in vitro, detectamos alterações na expressão de KLF15 e SUMO1 tanto no RNA quanto na proteína

níveis e descobriu que essas moléculas tinham tendências semelhantes (Figura 2D-l). Finalmente, determinamos que SUMO1 é o gene alvo de KLF15.

3.4|KLF15 regula positivamente a expressão do gene SUMO-1 ligando-se a uma região promotora CACCCA-SUMO-1 de 16 pb e um motivo rico em C mais A

Usamos o conjunto MEME (http://meme-suite.org/tools/meme) para caracterizar os motivos de ligação KLF15-dos 52 genes selecionados a partir dos dados KLF15 ChlP-Seq e identificamos o motivo de ligação KLF (Figura 3A). Além disso, analisamos mais de mil bases a montante do promotor SUMO1 e descobrimos que KLF15 pode reconhecer e se ligar a uma sequência de 16 bp (nucleotídeos -205~-199) incluindo - CACCCA-(Figura 3B).ChIP-PCR confirmou que KLF15 está ligado ao promotor SUMO1, e os resultados mostraram uma expressão significativamente maior de SUMO1 no grupo de anticorpos anti-KLF15 do que no grupo de controle de fundo (Figura 3C).

Além disso, realizamos um ensaio de repórter de luciferase dupla para confirmar a relação de direcionamento entre SUMO1 e KLF15. O grupo promotor SUMO1 de tipo selvagem mostrou maior atividade de luciferase do que o vetor pGL3 e grupos mutantes em HRMCs, e a atividade foi significativamente aumentada pela superexpressão de KLF15. Os aprimoramentos na atividade da luciferase foram revertidos por transfecção com um plasmídeo expressando a região promotora mutante (Figura 3D). Em conjunto, esses dados sugerem que SUMO1 é um alvo transcricional direto de KLF15.

3.5|Triagem de P53 como substrato de SUMOilação de SUMO1

As modificações SUMO são modificações pós-traducionais amplamente expressas em eucariotos. A conjugação reversível dessas modificações com proteínas substrato é também conhecida como SUMOilação, que desempenha papel importante na regulação das funções das proteínas alvo e ainda participa de vários processos biológicos, como transporte nucleocitoplasmático, regulação transcricional, apoptose, estabilização de proteínas, respostas ao estresse e progressão do ciclo celular.27 Para explorar as moléculas de sinalização a jusante conjugadas diretamente por SUMO1, realizamos uma análise de rede de SUMO1 usando o banco de dados IPA, e os dados mostraram que SUMO1 poderia conjugar diretamente a P53, APP, JUN e AKT, entre outros proteínas (Figura 4A-C). Inicialmente, selecionamos P53 como uma molécula a jusante de SUMO1 porque é uma proteína bem conhecida que está intimamente relacionada à proliferação celular. Figura 4D）. Para determinar se P53 é realmente modificado por SUMOilação, transfectamos transitoriamente HRMCs com um plasmídeo de superexpressão de SUMO1 ou SUMO1 siRNA. Ambos os resultados de IP e Western blot revelaram tendências nas alterações de expressão de SUMO1-P53 e P53 que eram consistentes com as alterações em SUMO1 (Figura 4E-J). Estes dados indicam que P53 é um substrato de SUMOilação de SUMO1.

3.6 |KLF15 inibe a proliferação de MC promovendo a expressão de SUMO1 e P53 SUMOilação

Para estabelecer a regulação da P53 SUMOilação e proliferação de MC por KLF15 e SUMO1, intervimos na expressão de KLF15 ou SUMO1 em HRMCs e tratamos HRMCs com PDGF-BB. Entre as HRMCs tratadas com PDGF-BB, as células transfectadas com o plasmídeo de superexpressão de KLF15 exibiram maior expressão de SUMO1-P53, P53, KLF15 e SUMO1 do que as células transfectadas com o plasmídeo de controle KLF15. As mesmas alterações em SUMO1-P53, P53 e SUMO1 foram encontradas nas células transfectadas com plasmídeo de superexpressão de SUMO1, enquanto a expressão de KLF15 permaneceu inalterada nessas células (Figura 5A-F). PDGF-BB é um dos fatores de crescimento mais eficazes de MCs descritos até agora, e foi observada resposta proliferativa de HRMCs a PDGF-BB. Conforme mostrado na Figura 5G, H, a porcentagem de células EdU-positivas foi significativamente aumentada pela administração de PDGF-BB recombinante. Os resultados da coloração EdU indicaram que a superexpressão de KLF15 e SUMO1 inibiu a proliferação celular induzida por PDGF-BB (Figura 5G, H).

Para obter mais informações sobre os papéis de KLF15 e SUMO1 na proliferação de HRMCs, transfectamos células com apenas SUMO1 siRNA ou as cotransfectamos com SUMO1 siRNA e um plasmídeo de superexpressão de KLF15. A regulação negativa de SUMO1 não afetou a expressão de KLF15, mas os níveis de expressão de SUMO1-P53 e P53 foram obviamente diminuídos após a transfecção de siRNA de SUMO1 (Figura 6A-C). Além disso, quando a expressão de SUMO1 foi inibida, os níveis de expressão de SUMO1-P53 e P53 também foram suprimidos mesmo em células que superexpressam KLF15 (Figura 6D-F). Em seguida, a proliferação de MC foi avaliada usando um ensaio de coloração EdU. SUMO1 RNAi aumentou o efeito proliferativo de PDGF-BBon HRMCs, e o grupo cotransfectado com o plasmídeo de superexpressão KLF15 e SUMO1 siRNA teve mais células EdU-positivas do que o grupo cotransfectado com o plasmídeo de superexpressão e o siRNA de controle de sequência híbrida (Figura 6G, H) . Concluímos, portanto, que KLF15 suprime a proliferação de MC aumentando a P53 SUMOilação.

3.7|A expressão global de SUMO1 e P53 em MCs glomerulares está negativamente correlacionada com a proliferação de MC em nefrite Thy-1 de rato

A nefrite anti-Thy1 é um modelo clássico de glomerulonefrite proliferativa mesangial autolimitada com uma fase proliferativa e uma fase de recuperação. Injetamos um anticorpo Thy1 em ratos Wistar para criar este modelo. Tanto o nitrogênio da ureia sérica quanto a creatinina não apresentam alteração significativa entre os ratos de controle e os ratos modelo (Figura S1). Proliferação mesangial marcada e acúmulo de ECM foram observados durante a fase proliferativa (dias 5 e 7) nos ratos modelo, e o número de MCs diminuiu durante a fase de recuperação no dia 10 (Figura 7A). Também detectamos as alterações de expressão no marcador de proliferação celular PCNA por IHC (Figura 7A, B). Os níveis de PCNA aumentaram no dia 5, atingiram o pico no dia 7 e diminuíram no dia 10 (Figura 7F). A análise de Western blot mostrou que a expressão proteica de P53, SUMO1 e KLF15 em glomérulos isolados foi menor nos grupos modelo do que no grupo controle (Figura 7C, D), consistente com os resultados imuno-histoquímicos (Figura 7E, F). Esses resultados indicam que a proliferação anormal de MCs em ratos modelo anti-Thy1 está relacionada à expressão de baixo nível de KLF15 e SUMO1. Espera-se que a interferência na expressão dessas moléculas alivie o fenótipo patológico em ratos.

4. DISCUSSÃO

oglomérulossão as unidades de filtração dorim. A interrupção da função glomerular pode ser causada por patologia glomerular primária ou pode ser secundária a doenças sistêmicas. Alterações mesangiais foram observadas após lesão glomerular, incluindo hiperproliferação de MCs seguida de produção excessiva de ECM (expansão mesangial) e produção de quimioatraente para células inflamatórias. Portanto, a modulação das respostas de MC, especialmente a proliferação anormal, é uma nova abordagem terapêutica. KLF15 é uma proteína que desempenha um papel regulador como fator de transcrição, ligando-se a sequências específicas de DNA. Muitos estudos relataram que o KLF15 está envolvido na regulação da proliferação celular. Por exemplo, descobriu-se que o KLF15 participa da inibição de vias de sinalização relacionadas à proliferação de MC,15,30 mas seu gene alvo direto não foi relatado na literatura. Portanto, este estudo envolveu principalmente a triagem conjunta dos níveis de transcrição e tradução para identificar o gene alvo direto de KLF15.

KLF15 regula diferentes genes em diferentes espécies e em diferentes tecidos e órgãos. No processo de regulação da proliferação de MCs, KLF15 afeta a expressão de múltiplos genes e participa de múltiplas vias.131,32 Para explorar os genes alvo diretos de KLF15, usamos ChIP-Seg.Klein RH e seus colegas usaram ChlP-seq tecnologia para estudar a regulação de KLF7 na diferenciação de células epiteliais da córnea.33 Ying M et al usaram essa técnica para estudar o efeito inibitório de KLF9 na pluripotência do glioblastoma.34Comparado com o chip ChlP, o ChIP-Seq permite uma análise verdadeira do genoma completo com maior resolução, maior sensibilidade de detecção e menor demanda de tamanho de amostra.35 Usamos ChP para obter os fragmentos de DNA diretamente ligados por KLF15 e, após comparação e análise com GenBank, selecionamos 2.478 possíveis genes-alvo. Por meio de análises de GO e vias, identificamos muitos genes-alvo envolvidos no ciclo celular e nos processos de proliferação.

Experimentos ChlP-Seq requerem PCR para amplificação do sinal de detecção, e algum grau de polarização durante o processo de amplificação é inevitável. Além disso, ChIP-Seq obtém apenas os genes que KLF15 pode se ligar e não indica as mudanças que ocorrem na expressão desses genes quando a expressão de KLF15 muda. Usamos a análise proteômica SILAC-LC/MS para compensar essas deficiências. Esta técnica fornece informações sobre todas as proteínas cuja expressão muda sob regulação por KLF15, incluindo as proteínas reguladas diretamente por KLF15 e as proteínas que são reguladas indiretamente ou modificadas pós-tradução. As HRMCs foram cultivadas usando SILAC e KLF15 foi superexpresso nas células por meio de transfecção de plasmídeo. As proteínas foram coletadas para detecção por LC/MS, e 1357 proteínas diferencialmente expressas foram obtidas. As análises de GO e via revelaram que algumas das proteínas diferencialmente expressas estavam envolvidas na ubiquitinação. Os dados de genes e proteínas foram cruzados. Os genes não relacionados ao objetivo da pesquisa e os genes não regulados diretamente pelo KLF15 foram removidos; em última análise, 52 genes foram rastreados. Entre estes, foram selecionados os cinco genes com as diferenças de expressão mais óbvias que estavam mais intimamente relacionadas com a proliferação. Dados os resultados combinados de análise de via, análise de expressão de SUMO1 e KLF15 em HRMCs em proliferação, ChlP-PCR e ensaios repórter de luciferase dupla, a proteína SUMO1 foi selecionada como o gene alvo de KLF15.

Além da ubiquitina, um número crescente de proteínas UBL,3637 incluindo SUMO,38 expresso em células precursoras neurais, 8(NEDD8)3940 regulado negativamente pelo desenvolvimento e o gene 15(ISG15) estimulado por interferon,41 estão sendo identificados. Essas proteínas modificadoras regulam poderosamente uma variedade de processos biológicos. A adição covalente de SUMO a substratos, denominada SUMOilação, é uma modificação pós-traducional envolvida em uma série de processos celulares, incluindo transporte nuclear-citosólico, regulação transcricional, apoptose, controle de estabilidade de proteínas, respostas ao estresse e progressão do ciclo celular. 27 SUMO é tipicamente ligado a resíduos aceitadores de lisina de substratos proteicos que abrigam uma sequência de consenso e contribui para a regulação das interações proteína-proteína, bem como para a compartimentalização subcelular e estabilidade proteica.2 sUMO1, como membro da família SUMOS, pode afetar a proliferação celular modificando o substrato e proteínas reguladoras do ciclo celular estabilizadoras.43 Portanto, combinado com o relatório da literatura e os resultados abrangentes de triagem e análise, focamos em como KLF15 regula o efeito de SUMO1 na proliferação de células mesangiais.

Para identificar os substratos do SUMO1, realizamos uma análise de rede do SUMO1 usando o banco de dados IPA e o software SUMOsp. Combinado com pesquisas publicadas sobre P53, nossos dados de triagem iniciais sugeriram P53 como uma molécula a jusante de SUMO1 com a sequência de SUMOilação YKxD/E. Estudos anteriores mostraram que P53 era um substrato de SUMOilação,45 e a conjugação de P53 SUMO1 aumentada promoveu a estabilidade e atividade de P53 e induziu senescência.46 Em nosso estudo, a interferência com a expressão de SUMO1 em HRMCs produziu as mesmas tendências de mudança em SUMO1-P53 e P53, indicando que P53 era um substrato de SUMOilação de SUMO1.

Evidências emergentes indicaram que a SUMOilação e a desUMOilação desempenham papéis em inúmeras doenças nefropáticas, como disgenesia renal, carcinoma renal, doença glomerular, apoptose podocitária e hipertonicidade da medula renal, lesão renal aguda e nefrolitíase.7-51 Para esclarecer o relação entre KLF15, SUMO1, P53 SUMOilação e proliferação de MC, realizamos uma série de tratamentos de transfecção em células que sofreram proliferação induzida por PDGF-BB. A superexpressão de KLF15 regulou positivamente a expressão de SUMO1, enquanto a superexpressão de SUMO1 não afetou a expressão de KLF15. A superexpressão de KLF15 ou SUMO1 aumentou a SUMOilação de P53 e antagonizou a proliferação celular induzida por PDGF-BB. Quando a expressão de SUMO1 foi inibida, a SUMOilação de P53 também foi inibida e KLF15 perdeu seu efeito antagônico na proliferação celular. Na Vivo. a proliferação de MCs aumentou gradativamente com o agravamento da nefrite proliferativa mesangial, enquanto a expressão de KLF15, SUMO1 e P53 diminuiu significativamente. Considerando as observações integradas em células e tecidos, concluímos preliminarmente que KLF15 regula a SUMOilação de P53 através de SUMO1, inibindo assim a proliferação de MC.

5. CONCLUSÕES

Alguns estudos indicaram que KLF15 desempenha um papel importante na regulação da proliferação de MCs. Neste trabalho, exploramos os mecanismos de supressão da proliferação de MC mediados por este fator de transcrição. Identificamos SUMO1 como o alvo primário de KLF15 em MCs por meio de análises de bioinformática envolvendo ChIP-Seq e SILAC-LC/MS. Além disso, com o auxílio do banco de dados IPA e do software SUMOsp, determinamos que P53 era um substrato direto de SUMO1. Experimentos in vitro e in vivo confirmaram que KLF15 poderia promover a expressão de SUMO1 e a SUMOilação de P53 e então inibir a proliferação de MCs (Figura S2). Esses resultados contribuem para a compreensão do papel regulador do KLF15 na proliferação de MC e fornecem uma base teórica para encontrar novos tratamentos para doenças renais relacionadas à proliferação de MC.