Camundongos knockout condicionais para carboxipeptidase E exibem déficits de aprendizagem e memória e neurodegeneração Parte 1

A carboxipeptidase E (CPE) é uma proteína multifuncional com muitas funções não enzimáticas em vários sistemas. Estudos anteriores usando camundongos knock-out para CPE mostraram que o CPE tem efeitos neuroprotetores contra o estresse e está envolvido no aprendizado e na memória.

A resistência ao estresse e a memória são dois aspectos inseparáveis. Seja no trabalho, no estudo ou na vida, enfrentaremos todo tipo de pressão. Às vezes, esse estresse pode nos deixar deprimidos, ansiosos, cansados ​​e até afetar a memória. Nesse caso, precisamos encontrar algumas maneiras de melhorar nossa resistência ao estresse e nossa memória.

Primeiro, melhorar a tolerância ao estresse pode ser alcançado através de exercícios. A pesquisa mostra que o exercício pode ajudar as pessoas a reduzir a ansiedade e a depressão. Além disso, o exercício adequado também pode promover o metabolismo, melhorar o sono e melhorar a aptidão física. Tudo isso ajuda a melhorar nossa tolerância ao estresse e memória.

Em segundo lugar, o aconselhamento psicológico é também um meio eficaz para melhorar a resistência ao stress. Quando você encontrar dificuldades e contratempos, comunique-se prontamente com a família ou amigos para liberar suas más emoções internas e reduzir sua carga psicológica, para que você possa enfrentar melhor as pressões e os desafios.

Além disso, bons hábitos de sono também são essenciais para melhorar a memória e a resistência ao estresse. O sono insatisfatório pode causar fadiga física, depressão e perda de memória. Portanto, devemos desenvolver bons hábitos de sono, garantir horas de sono adequadas todas as noites e garantir a qualidade do sono.

Finalmente, uma atitude positiva também é crucial. Você deve manter uma boa atitude, continuar aprendendo e aprimorando suas habilidades, enfrentar ativamente os desafios, manter uma atitude otimista ao enfrentar as dificuldades e acreditar que pode superar a pressão e alcançar o sucesso.

Resumindo, a resistência ao estresse e a memória são dois aspectos intimamente relacionados. Através de exercícios, aconselhamento psicológico, bons hábitos de sono e uma atitude positiva, podemos efetivamente melhorar a nossa capacidade de resistir ao estresse e à memória, e enfrentar melhor os vários desafios na vida e no trabalho. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque a Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês que tem muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da carne picada vem dos vários ingredientes ativos que contém, incluindo ácidos, polissacarídeos, flavonóides, etc. Esses ingredientes podem promover a saúde do cérebro de várias maneiras.

Clique em conhecer 10 maneiras de melhorar a memória

No entanto, as funções do CPE nos neurônios ainda são amplamente desconhecidas. Aqui usamos um sistema Camk2a-Cre para nocautear condicionalmente neurônios CPE. Os camundongos do tipo selvagem, CPEflox/- e CPEflox/flox foram desmamados, etiquetados nas orelhas e cortados na cauda para genotipagem às 3 semanas de idade, e foram submetidos a testes de campo aberto, reconhecimento de objetos, labirinto em Y e condicionamento do medo aos 8 anos. semanas de idade.

Os camundongos CPEflox/flox apresentaram peso corporal e metabolismo de glicose normais. Os testes comportamentais mostraram que camundongos CPEflox/flox apresentaram comprometimento de aprendizado e memória em comparação com camundongos selvagens e CPEflox/-. Surpreendentemente, a região do subículo (Sub) de camundongos CPEflox/flox foi completamente degenerada, ao contrário dos camundongos CPE full knockout, que exibem neurodegeneração da região CA3. Além disso, a imunocoloração com duplacortina sugeriu que a neurogênese no giro denteado do hipocampo foi significativamente reduzida em camundongos CPEflox/flox.

Curiosamente, a fosforilação de TrkB no hipocampo foi regulada negativamente em camundongos CPEflox/flox, mas os níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro não foram. Tanto no hipocampo quanto no córtex pré-frontal medial dorsal, observamos redução da expressão de MAP2 e GFAP em camundongos CPEflox/flox. Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram que o nocaute neuronal específico do CPE leva à disfunção do sistema nervoso central em camundongos, incluindo déficits de aprendizagem e memória, subdegeneração do hipocampo e neurogênese prejudicada.

INTRODUÇÃO

A carboxipeptidase E (CPE), também conhecida como fator neurotrófico- 1, é uma proteína multifuncional com muitas funções não enzimáticas essenciais nos sistemas endócrino e nervoso [1]. O CPE é enriquecido em vesículas secretoras maduras e desempenha um papel crítico na biossíntese de hormônios peptídicos e neuropeptídeos [2]. O CPE também atua como receptor de classificação de muitas pró-proteínas, incluindo pró-insulina, pró-encefalina, pró-opiomelanocortina e pró-fator neurotrófico derivado do cérebro (pró-BDNF) [3].

Uma mutação natural do fenótipo da obesidade em camundongos, denominada "gordura", foi mapeada no gene CPE [4]. Um estudo subsequente indicou que camundongos CPEfat/fat e CPE-knockout (KO) apresentaram fenótipos semelhantes, incluindo infertilidade e obesidade adulta [5]. Foi relatado que o gene CPE humano possui mutações, incluindo mutações nulas, mutações que produzem proteínas truncadas e aquelas com resíduos catalíticos importantes eliminados [6].

Indivíduos homozigotos com mutações graves são obesos mórbidos e apresentam hipogonadismo. Além disso, o polimorfismo missense CPE foi encontrado em pacientes com diabetes tipo 2. A mutação altera a atividade da enzima CPE e os pacientes apresentam início precoce de diabetes tipo 2 [7]. Além disso, o CPE desempenha um papel importante no transporte vesicular, como mostrado nos neurônios e sinapses do hipocampo [8].

Estudos anteriores mostraram que altos níveis de CPE são expressos no hipocampo e têm um papel neurotrófico independente de sua atividade enzimática na proteção contra a morte de neurônios piramidais induzida por estresse e comprometimento cognitivo [9, 10]. O estresse prejudica a estrutura e a função de uma série de regiões cerebrais [11].

O córtex pré-frontal (PFC) é o principal alvo neuropatológico do estresse, que está conectado com numerosas regiões corticais e subcorticais e contribui para as funções cognitivas [12, 13]. O PFC dorsal medial (dmPFC) inclui o córtex cingulado rostralanterior e o córtex pré-límbico, que são as regiões envolvidas na modulação da dor, emoções e cognição. Foi demonstrado que a inativação funcional do dmPFC induz emoções negativas e reduz a capacidade cognitiva [14]. A atividade dos neurônios dmPFC transmite informações sobre escolhas e resultados passados, e a remoção ou inativação do dmPFC prejudica a orientação dos sinais [15].

Além disso, o estresse leva ao comprometimento das redes neurais, disfunção cognitiva, degeneração do hipocampo e redução da neurogênese [10]. Os neurônios piramidais no dmPFC e no hipocampo mostram atrofia sob estresse, e o estresse psicossocial e de restrição produzem atrofia dentro de aproximadamente 3-4 semanas [11, 16]. As alterações morfológicas variam de acordo com a região cerebral. O estresse de restrição crônica leva à retração dendrítica e diminui a densidade espinhal na área pré-límbica do dmPFC e do hipocampo [17].

A redução induzida pelo estresse na complexidade do dendrito apical do hipocampo é consistente com funções prejudicadas do hipocampo, como aprendizado e memória [18]. Além disso, a lesão neuronal e a apoptose na região CA3 levam a déficits de memória espacial [19]. Comportamentalmente, descobriu-se que o estresse prejudica várias funções dependentes do hipocampo, como a memória [20].

O CPE é modulado sob diferentes tipos de estresse e é importante na proteção dos neurônios. Neurônios no hipocampo e no córtex regulam positivamente a expressão de CPE após estresse isquêmico, o que está relacionado à sobrevivência neuronal [21].

Além disso, após camundongos CPEknockout (KO) receberem um paradigma de estresse quando foram desmamados às 3 semanas de idade, eles exibiram degeneração da região CA3 e diminuição da neurogênese no giro denteado (DG) [1, 22].

Neste estudo, usamos um sistema Camk2aCre comum específico para neurônios para excluir o CPE do neurônio. Geramos um modelo de camundongo CPE condicional KO (cKO) para estudar o fenótipo de perda de função do CPE em neurônios do cérebro. Avaliamos o efeito do paradigma de estresse (desmamado, etiquetado na orelha e cortado na cauda) às 3 semanas de idade em camundongos CPE-cKO. Usamos testes de reconhecimento de objetos, labirinto em Y e condicionamento do medo entre 8 e 10 semanas de idade para avaliar o desempenho cognitivo. Além disso, analisamos os fenótipos de neurônios e astrócitos, bem como a neurogênese no hipocampo.

MÉTODOS

Animais

Camundongos Camk2a-Cre e camundongos CPEflox / flox foram obtidos da CyagenBiosciences (Suzhou, China). Todos os animais foram alojados em temperatura ambiente (22 graus ± 2 graus) com um ciclo natural de luz/escuridão e tiveram livre acesso a água limpa e ração padrão para roedores. Os camundongos Camk2a-Cre e CPEflox/flox são chamados de camundongos CPE-cKO. Às 3 semanas de idade, os camundongos foram desmamados, etiquetados nas orelhas e as caudas cortadas para genotipagem, causando um paradigma de estresse emocional e físico. Referimo-nos ao Camk2a-Cre; Camundongos CPEflox/flox como CPEcKO, Camk2a-Cre; Camundongos CPEflox/− como heterozigotos (HE) e camundongos CPE−/− como tipo selvagem (WT). Todos os procedimentos experimentais para os animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais Experimentais da Universidade Minzu da China.

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Caudas cortadas foram coletadas para isolamento de DNA para PCR para identificação do genótipo. As sequências de primers são as seguintes:

Peso corporal

Camundongos WT, CPEflox/- e CPEflox/flox (1–20 semanas de idade; n=10 para cada genótipo) foram pesados ​​todas as semanas, o que foi usado para determinar mudanças de peso. O peso de cada rato foi calculado para cada grupo.

Glicose plasmática

O sangue venoso das caudas dos camundongos foi coletado e detectado pelo Sistema de Monitoramento de Glicose no Sangue (Yuwell, China) após jejum de 12 h. Amostras de sangue foram coletadas da veia caudal em 0 min para glicose plasmática em jejum. Em seguida, cada camundongo foi injetado intraperitonealmente com uma solução de glicose de 1 g/kg. Em seguida, determinamos a glicose plasmática por 15,30, 60, 90 e 120 min para medir os níveis de glicose no sangue.

Testes comportamentais

Para avaliar o comportamento dos camundongos WT, CPEflox/- e CPEflox/flox, animais de 8 a 10- semanas de idade foram submetidos a testes de campo aberto, reconhecimento de objetos, labirinto em Y e condicionamento do medo.

Campo aberto

O comportamento exploratório foi medido utilizando um aparelho de campo aberto (50 × 50 × 40 cm). Cada animal foi colocado em um canto do aparelho e medido durante 7 min. A distância percorrida foi registrada nos últimos 5 minutos com um sistema de vídeo-imagem (Taimeng, Chengdu, China).

Reconhecimento de objeto

O teste de reconhecimento de objetos foi utilizado para testar o aprendizado e a memória em camundongos. No dia do treinamento, dois objetos idênticos foram colocados na diagonal de um aparelho (50 × 50 × 40 cm). Os animais foram autorizados a explorar livremente durante 7 min. Para o procedimento de teste, um objeto foi substituído por um novo objeto na mesma diagonal do dia de treinamento. Os animais foram autorizados a explorar livremente durante 7 min. O tempo de exploração de 2 a 3 cm ao redor do novo objeto foi registrado nos últimos 5 minutos.

Labirinto Y

A atividade exploratória e a memória de trabalho foram medidas utilizando um aparelho labirinto em Y (comprimento do braço: 30 cm, largura do braço: 6 cm, altura da parede: 15 cm). Cada animal foi colocado na área central. O número e as alterações de entradas nos braços foram registrados durante 7 minutos com um sistema de vídeo-imagem (Taimeng, Chengdu, China). O resultado foi calculado como o número de alteração correto/número total de entrada do braço.

Condicionamento do medo

O condicionamento do medo consistia em duas câmaras, e a caixa do monitor de congelamento (23 × 23 × 30 cm) foi colocada em uma sala maior à prova de som (30 × 30 × 37 cm). A caixa do monitor de congelamento continha uma grade metálica para choque nas patas, e os movimentos verticais e horizontais dos animais foram registrados. O primeiro dia foi de treinamento de reflexos condicionados. O procedimento foi o seguinte: inação por 60 segundos e depois estimulação 12 vezes.

O conteúdo da estimulação incluiu um estímulo condicionado de 30 s (75 dB), seguido de um intervalo de traço (30 s), e finalizou com um choque nos pés de 2 s (30 mA) e 15 s de inação. Seis horas depois, foi realizado o teste de memória de curto prazo e o número de estímulos foi reduzido para 6. Durante o processo de estimulação, cada tentativa consistiu no estímulo condicionado seguido de um intervalo de traçado (30 segundos) e terminou sem a aplicação do choque no pé.

O teste de memória de longo prazo foi realizado no dia seguinte com intervalo de um dia. O método foi o mesmo da memória de curto prazo para medir a qualidade da memória de longo prazo.

For more information:1950477648nn@gmail.com