A inibição do receptor de hidrocarboneto de arila restaura a disfunção endotelial mediada por sulfato de indoxil em anéis aórticos de ratos
Dec 15, 2023
Abstrato:Otoxina urêmica indoxil sulfato(IS), elevado emdoença renal crônica(DRC), é conhecido por contribuir para doenças cardiovasculares progressivas. IS ativa o receptor de aril hidrocarboneto (AhR) mediando o estresse oxidativo edisfunção endotelialatravés da ativação da via CYP1A1. O presente estudo examina a inibição do AhR com o antagonista, CH223191, no comprometimento da função endotelial vascular mediado por IS e na interrupção do equilíbrio redox. Os efeitos agudos do EI no relaxamento dependente do endotélio foram avaliados em anéis aórticos de ratos Sprague Dawley expostos às seguintes condições: (1) controle; (2) É (300µM); (3) É + CH223191 (1µM); (4) É + CH223191 (10µM). Posteriormente, os tecidos foram avaliados quanto a alterações na expressão de marcadores redox. IS reduziu o nível máximo de relaxamento dependente do endotélio (Rmax) em 42% (p < 0.001) compared to control, this was restored in the presence of increasing concentrations of CH223191 (p < 0.05). Rings exposed to IS increased expression of CYP1A1, nitro-tyrosine, NADPH oxidase 4 (NOX4), superoxide, and reduced eNOS expression (p < 0.05). CH223191 (10 µM) restaurou a expressão desses marcadores de volta aos níveis de controle (p < 0.05). These findings demonstrate the adverse impact of IS-mediated AhR activation on the vascular endothelium, where oxidative stress may play a critical role in inducing disfunção endotelialna vasculatura do coração erins. Inibição de AhRpoderia fornecer uma nova terapia interessante para DCV noConfiguração de DRC.
Palavras-chave:receptor de hidrocarboneto de arila; sulfato de indoxil; disfunção endotelial; doença renal crônica; doença cardiovascular; estresse oxidativo
Contribuição chave: O indoxil sulfato (IS), a toxina urêmica ligada a proteínas mais estudada e um potente agonista do receptor de aril hidrocarboneto (AhR), é conhecido por desempenhar um papel patológico naProgressão da DRCeLesões relacionadas à DRCem outros tecidos, como a vasculatura. Este estudo demonstra que a inibição ex vivo do AhR pode prevenir a disfunção endotelial induzida por IS e alterações associadas no equilíbrio redox, realizando um potencial novoalvo para terapia de DRC
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1. Introdução
A DRC afecta 10% da população mundial, impactando não só os sistemas de saúde, mas também colocando um pesado fardo económico e de produtividade nos países em todo o mundo [1,2]. O risco de doença cardiovascular (DCV) aumenta em pacientes com doença renal crônica (DRC) [3]. Nestes pacientes, o acúmulo de toxinas urêmicas ligadas a proteínas circulantes não dialisáveis (PBUTS), como o indoxil sulfato (IS), não apenas demonstra um aumento da mortalidade por DCV [4], mas também prediz eventos cardiovasculares adversos em pacientes com insuficiência cardíaca crônica [4]. 5]. A DRC e níveis elevados de IS também exacerbam complicações cardiovasculares, como hipertrofia miocárdica, dislipidemia, inflamação crônica [6], bem como disfunção endotelial, evidenciada por dilatação anormal mediada pelo fluxo arterial braquial (FMD) correlacionada com níveis séricos de IS [7,8] . Outros estudos observaram que o estreitamento da microvasculatura em pacientes com DRC está associado à diminuição da taxa de filtração glomerular estimada [9]. Além disso, estudos em animais relataram que o IS, seja aumentado em um modelo de DRC ou administrado exogenamente, contribui para o comprometimento do vasorrelaxamento dependente do endotélio [10,11].
O IS é derivado do metabolismo do triptofano que se acumula progressivamente no soro dos estágios 2–5 da DRC em avanço; sua alta afinidade de ligação à albumina impede sua depuração mesmo após diálise [4,12]. Estudos anteriores identificaram o IS como um agonista endógeno no receptor de aril hidrocarboneto (AhR), um fator de transcrição dependente de ligante citosólico que é constitutivamente expresso e envolvido em numerosos processos biológicos, como estresse oxidativo, inflamação, remodelação vascular e aterogênese [13, 14]. A ativação do AhR mediada por IS induz a enzima citocromo P450 1A1 (CYP1A1) nas células endoteliais e isso está associado ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) [14,15]. Além disso, foi observado aumento da expressão de CYP1A1 no sangue de pacientes com DRC [16]. Inibição da ativação de AhR mediada por IS com antagonistas seletivos, como o ácido 2-metil-2H-pirazol-3-carboxílico (2-metil-4-o-toly- foi relatado que lazo-fenil)-amida (CH223191) [17] reverte a inflamação induzida por IS e a produção de ROS para controlar os níveis nas células endoteliais [14,15].
Sabe-se que o AhR desempenha um papel na manutenção do equilíbrio redox genômico pela ativação dos elementos de resposta antioxidante (ARE) de fase I xenobióticos e de fase II. A ativação do AhR desencadeia um sistema de desintoxicação celular, que é dividido em enzimas de fase I, como CYP1A1, envolvidas em Produção de ROS. A geração contínua de ROS leva à sua interação com o fator de transcrição antioxidante, fator nuclear eritróide 2-fator relacionado (Nrf2), além disso, a ativação do AhR também estimula o Nrf2 [18,19]. Nrf2 juntamente com o fator de transcrição proto-oncogene c-Maf liga-se à expressão indutora de ARE das enzimas antioxidantes de fase II NAD(P)H: quinona oxidoredutase (NQO1) e glutationa S-transferase (GSTA1/2). CYP1A1 e NRF2 desempenham um papel homeostático na manutenção de um equilíbrio entre pró e antioxidantes [18,19].
As opções de tratamento que limitam os efeitos prejudiciais dos PBUTs, como o IS, são limitadas. O adsorvente oral AST-120, que remove precursores de toxinas urêmicas do intestino, como o indol, reduz a formação e os níveis circulantes de IS e outros PBUTs derivados do indol. A AST-120 tem sido usada em pequenos ensaios clínicos com algum sucesso [20–22], que foi aprovada em vários países asiáticos. No entanto, os grandes ensaios clínicos de fase III EPPIC-1 e -2 (Evaluating Prevention of Progression in CKD) demonstraram que a AST-120 não atingiu o seu objetivo primário [23]. Isto levanta a necessidade de estratégias alternativas que possam impedir o mecanismo de ação dos SI. In vitro, o AhR demonstrou ser um alvo eficaz cuja inibição pode bloquear as ações a jusante do IS e potencialmente de outros metabólitos do triptofano [13,14] e pode fornecer utilidade terapêutica na redução do risco de DCV na DRC e no alívio de sua progressão.
Embora a maioria dos estudos in vitro que avaliam a inibição do AhR utilizem siRNA ou inibidores de moléculas pequenas, como o antagonista puro do AhR CH223191 [17], nenhum estudo ex vivo foi realizado avaliando o efeito deste antagonista no relaxamento endotelial para determinar a 'prova de princípio'. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da inibição do AhR no tecido aórtico isolado para prevenir o comprometimento da função vascular dependente do endotélio induzido pelo IS, aliviando o estresse oxidativo mediado pelo IS e a expressão do gene CYP1A1 associada à ativação do AhR e, além disso, examinar o efeitos no sistema antioxidante.
2. Resultados
2.1. Efeito da inibição do receptor de hidrocarboneto de arila no relaxamento dependente do endotélio prejudicado por IS
Anéis aórticos de ratos saudáveis foram expostos ao IS (10–300 µM) para determinar a dose ideal de IS causando comprometimento do relaxamento endotelial. IS a 300 µM, mas não a 10 µM ou 100 µM, reduziu significativamente o relaxamento dependente do endotélio (Rmax) à acetilcolina (ACh) em comparação com o controle em 32% (p < 0,05; Figura 1A), e esta concentração foi usado em experimentos posteriores. Em experimentos subsequentes na presença do inibidor de AhR, CH223191 (1 e 10 µM), o comprometimento de Rmax induzido por IS (42%) foi evitado (p <0,001, Figura 1B, Tabela 1). Nos anéis aórticos estimulados apenas com IS, a potência da ACh (-pEC50) foi reduzida em relação ao controle (p < 0,01) e restaurada na presença de CH223191 (p < 0,05; Tabela 1). Para determinar se o inibidor de AhR sozinho exibiu algum efeito intrínseco no relaxamento dependente do endotélio, os anéis aórticos foram incubados apenas com CH223191 e não exibiram efeito nos valores de Rmax ou -pEC50 (Tabela 1, também Figura Suplementar S1).
Figura 1. Efeito do CH223191 na reatividade vascular. (A) A exposição dos anéis aórticos ao IS (300 µM) reduziu o relaxamento dependente do endotélio estimulado pela ACh (p < 0,05; N=6). (B) A pré-incubação com CH223191 (1 μM e 10 μM) evitou a redução no relaxamento dependente do endotélio induzido por IS (p <0,001; N=10). Pontos de dados expressos como média ± SEM
2.2. Efeito do IS no endotélio e na óxido nítrico sintase endotelial
Após a conclusão das respostas de relaxamento funcional à ACh, secções de tecido destes anéis aórticos foram analisadas por imuno-histoquímica para células endoteliais e expressão de óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Não houve alteração nas células endoteliais conforme determinado pela coloração para antígeno de células endoteliais de rato{{0}} (RECA-1) sob as quatro condições examinadas (Figura 2A). No entanto, secções do anel aórtico coradas para eNOS demonstraram que a exposição IS reduziu significativamente a expressão de eNOS em 75% da superfície luminal endotelial (p <{11}}.01), enquanto na presença de CH223191 esta redução foi evitada na presença de 10 µM CH223191 (Figura 2B-F; p < 0,05).
Figura 2. IS reduz a expressão de eNOS sem perda de células endoteliais. (A) A coloração do marcador de células endoteliaisRECA-1 em anéis aórticos tratados com IS na ausência e presença de CH223191. (B) A expressão endotelialNOS reduzida na presença de IS foi evitada com CH223191. Imagens representativas da coloração de eNOS em (C) tecido de controle, (D) tratado com IS, IS na presença de (E) 1 uM e (F) 1{{10}} uM CH223191. As setas indicam coloração positiva. Dados expressos como média 土 SEM de=10 experimentos. ** p < 0,01 em comparação com tecido de controle, #fp < 0,05 em comparação com tecido exposto a ISMagnification X400.
2.3. Efeito de IS e CH223191 em Pró e Antioxidante
Sabe-se que a ativação do AhR induzida pela expressão gênica IS aumenta o CYP1A1. Descobrimos que IS (3{{10}}0 µM) aumentou significativamente a expressão de CYP1A1 em anéis aórticos após 1 e 4 h em quase nove e sete vezes, respectivamente, em comparação com condições de controle (p < 0,05, Figura 3). CH223191 a 1 e 10 µM reduziu a expressão do gene CYP1A1 mediada por IS após 1 h de estimulação IS para níveis semelhantes aos observados em anéis expostos ao controle, enquanto após 4 h de estimulação IS, apenas 10 µM CH223191 foi capaz de reduzir significativamente os níveis de CYP1A1 (p <0,001 , Figura 3). Ao examinar a via antioxidante, o IS na ausência e presença de CH223191 não conseguiu induzir uma alteração na expressão genética de Nrf2, NQO1 e GSTA1/2 (Ver Figura Suplementar S2)
2.4. Efeito de IS e CH223191 em marcadores de estresse oxidativo e inflamação
Para examinar melhor as alterações no equilíbrio redox, os tecidos dos experimentos funcionais foram analisados para examinar as alterações nos marcadores de estresse oxidativo, nomeadamente nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase 4 (NOX4), expressão de superóxido e nitro-tirosina. Os tecidos expostos ao IS demonstraram um aumento de 180% na expressão de NOX4 (Figura 4; p < 0.001). Na presença de CH223191 (1 e 10 µM), a expressão de NOX 4 foi significativamente reduzida em comparação com IS (Figura 4; p < 0.001). A exposição ao IS aumentou os níveis de expressão de nitrotirosina, um marcador de dano celular e coloração de inflamação em 90% em comparação ao controle (Figura 5; p <0,05), enquanto na presença de CH223191 (10 µM), a expressão de nitrotirosina foi reduzida retorno aos níveis de controle (Figura 5; p < 0,05). A expressão da molécula da espécie reativa de oxigênio, superóxido, foi determinada por coloração com diidroetídio (DHE). A exposição ao IS aumentou a coloração de DHE em 430% em comparação com o controle (Figura 6; p <0,001), enquanto na presença de CH223191 em ambas as doses, a expressão de superóxido foi reduzida de volta aos níveis de controle, como mostrado na Figura 6; (p < 0,001
A expressão gênica de marcadores inflamatórios também foi examinada na aorta estimulada na ausência e na presença de CH223191. IS produziu um aumento não significativo de 111 e 55% na expressão do fator de necrose tumoral a (TNFa) e da molécula de adesão celular vascular-1VCAM-1), respectivamente, às 4 h. Na presença de CH223191, os níveis de expressão de ambos os genes foram significativamente reduzidos, como mostrado na Figura 7 (p <{9}},05).
Figura 6. CH223191 preveniu a expressão de superóxido induzida por IS. (A) Quantificação da coloração DHE em anéis aórticos tratados com S na ausência e presença de CH223191. Imagens representativas da expressão de superóxido em (B) tecido de controle, (C) tratado com IS, IS na presença de (D) 1 uM e (E) 1{{10}} M CH223191Dados expressos como média SEM de N=10 experimentos. *** p < 0,001 em comparação com tecido de controle#### p < 0,001 em comparação com tecido exposto a IS. Ampliação x200.
Figura 7. Efeito da inibição de IS e Ahk na expressão gênica inflamatória. A exposição dos anéis aórticos à expressão do gene IS não significativamente elevada (A) TNFa e (B) VCAM-1 às 4 h. Na presença de CH223191, a expressão TNFx e VCAM-1 foi evitada. Dados expressos como média 土 SEM de=6 experimentos. # p < 0.05 comparado ao tecido exposto ao IS.
