Abstrato.Arbutin é um composto natural extraído de várias plantas, incluindo folhas de uva-ursina, que exerce múltiplos efeitos, incluindo clareamento da pele e propriedades anti-inflamatórias e protetoras do estresse oxidativo. No entanto, os efeitos da arbutina nos osteoblastos permanecem desconhecidos. O presente estudo teve como objetivo investigar a função e os mecanismos da arbutina na proliferação e diferenciação de células precursoras de osteoblastos de camundongos MC3T3‑E1 in vitro. A proliferação de células MC3T3‑E1 tratadas com arbutina foi avaliada usando um ensaio Cell Counting Kit-8 e um ensaio de marcação de 5-etinil-2'-desoxiuridina. Além disso, o ciclo celular e a apoptose foram examinados usando análise de citometria de fluxo. Os efeitos da arbutina na diferenciação osteoblástica foram investigados usando coloração de fosfatase alcalina (ALP) e examinando os níveis de expressão de mRNA da cadeia de colágeno tipo I 1 (COL1A1), proteína carboxiglutamato óssea (BGLAP) e fator de transcrição Sp7 (SP7). Para investigar melhor o mecanismo molecular subjacente à função de arbutina na promoção da osteogênese, os níveis de expressão de mRNA e proteína do fator de transcrição runt-related 2 (RUNX2) e -catenina foram analisados por uma reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa e western blotting. A arbutina promoveu significativamente a proliferação de células MC3T3‑E1 e aumentou a proporção de células na fase S. O tratamento com arbutina aumentou a atividade de ALP e os níveis de expressão de mRNA de COL1A1, BGLAP e SP7 em células MC3T3‑E1. Além disso, a proteína e os níveis de expressão de mRNA de RUNX2 e -catenina aumentaram significativamente após o tratamento com arbutina. Coletivamente, os presentes achados sugeriram que o arbutin foi capaz de promover a proliferação e diferenciação de células MC3T3‑E1 por meio da via de sinalização Wnt/-catenina.
De acordo com estudos relevantes,cistancheé uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu componente principal écistanósido, que tem vários efeitos, comoantioxidante, anti-inflamatórioe promoção da função imunológica. O mecanismo entre cistanche eClareamento da pelereside no efeito antioxidante dos glicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação da tirosina catalisada portirosinase, e a reação de oxidação requer a participação de oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contém cistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo, assiminibindo a produção de melanina.
Para mais informações:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Introdução
A osteoporose é um problema de saúde e socioeconômico caracterizado por baixa massa óssea e microarquitetura óssea deteriorada, o que aumenta o risco de fraturas por fragilidade (1,2). Na União Europeia (UE), a taxa de prevalência da osteoporose em indivíduos com idade igual ou superior a 50 anos foi estimada em 6,6 e 22,1 por cento para homens e mulheres em 2010, respetivamente. Economicamente, o custo total da osteoporose para a UE foi de aproximadamente € 37,4 bilhões em 2010 (3). Devido ao aumento da expectativa de vida e ao envelhecimento da população, um número crescente de pessoas pode sofrer fraturas osteoporóticas no futuro (4). A osteoporose é causada por um desequilíbrio entre a formação óssea, mediada pelos osteoblastos, e a reabsorção, mediada pelos osteoclastos (5). Os tratamentos disponíveis para a osteoporose incluem medicamentos antirreabsorção (como bisfosfonatos e denosumabe), calcitonina e estrogênio. No entanto, esses compostos exibem certas limitações; em particular, eles diminuem a taxa de renovação osteogênica e, ao diminuir o processo de remodelação óssea, causam uma diminuição na formação óssea (6). A terapia com estrogênio não é ideal para terapia de osteoporose de longo prazo, uma vez que altos níveis de estrogênio podem induzir sangramento uterino, câncer de mama e doenças cardiovasculares (7). Além disso, os medicamentos anti-reabsorção não são capazes de restaurar a estrutura óssea perdida. No entanto, os agentes anabolizantes podem estimular a formação óssea e aumentar a massa óssea (8). Portanto, é importante identificar novas drogas seguras e eficazes capazes de promover a formação óssea.
A arbutina (4-hidroxifenil- ‑D‑glucopiranósido; Fig. 1) é um derivado de hidroquinona de ocorrência natural (massa molecular 272 Da) presente em vários tipos de plantas. Altos níveis de arbutina foram identificados em plantas, incluindo manjerona (Origanum majorana, Lamiaceae) e peras (Pyrus communis, Rosaceae) e, em particular, a família Ericaceae, como folhas de uva-ursina (Arctostaphylos uva‑ursi) (9). Arbutin exibe várias atividades biológicas. Por exemplo, arbutin pode ser usado
como agente clareador da pele; ao inibir a atividade da tirosinase nos melanossomas, foi identificado que o arbutin promove a despigmentação (10,11). Um estudo anterior demonstrou que o arbutin pode desempenhar um papel protetor da apoptose induzida por radiação X, diminuindo os níveis intracelulares de radicais hidroxila (12). Além disso, o arbutin pode inibir a diferenciação dos osteoclastos diminuindo os níveis intracelulares de superóxido e regulando negativamente o fator nuclear das células T ativadas 1 (13). No entanto, os efeitos da arbutina na função osteoblástica permanecem desconhecidos. Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos e os mecanismos da arbutina na proliferação e diferenciação de células precursoras de osteoblastos de camundongos MC3T3‑E1.
A via de sinalização Wnt pode afetar osteoblastos e osteoclastos, direta e indiretamente, aumentando a formação óssea e diminuindo a reabsorção óssea (14). A sinalização Wnt canônica pode regular a proliferação, diferenciação e função dos osteoblásticos em vários níveis (15). Em modelos animais, diminuindo a atividade de inibidores da via de sinalização Wnt/-catenina usando anticorpos contra proteína 1 relacionada à proteína frisada secretada, esclerostina e inibidor 1 da via de sinalização dikkopf WNT (DKK1) e inibidores de moléculas pequenas da glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3 ) pode aumentar a massa óssea e diminuir o risco de fraturas(16). Portanto, a via de sinalização Wnt representa um potencial alvo terapêutico para o desenvolvimento de novas drogas para tratar a osteoporose (17). No presente estudo, foram investigados os efeitos da arbutina na proliferação e diferenciação das células MC3T3‑E1. Além disso, o mecanismo molecular subjacente à função do arbutin na indução da diferenciação celular MC3T3‑E1 foi examinado.
Materiais e métodos
Produtos químicos. Arbutin (pureza, maior ou igual a 98 por cento) foi adquirido de Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Dalian, China), dissolvido em dimetil sulfóxido (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e armazenado em um concentração de 0,5 M. O DKK1 humano recombinante foi adquirido da PeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ, EUA; cat. no. 120-30).
Cultura de células. Os pré-osteoblastos da calvária de camundongos MC3T3‑E1 foram adquiridos no The Cell Resource Center dos Institutos de Ciências Biológicas de Xangai da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China) e cultivados em -Meio Essencial Mínimo (-MEM; HyClone; GE Healthcare Life Sciences, Logan, UT, EUA) suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino (FBS; Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel), 100 µg/ml de estreptomicina e 100 U/ml penicilina (HyClone; GE Healthcare Life Sciences). As células foram mantidas em uma incubadora de cultura de células com 5% de CO2 a 37°C. O meio foi substituído a cada dois dias. As células com confluência de 80 por cento foram semeadas novamente em frascos de cultura de tecidos após o tratamento com 0,25 por cento de tripsina (HyClone; GE Healthcare Life Sciences) por 1 a 2 minutos a 37°C. Para experimentos de diferenciação osteoblástica, as células foram tratadas com um suplemento osteogênico contendo 50 µg/ml de ácido L-ascórbico (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) e 10 mM de hidrato de sal dissódico de glicerofosfato (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) por 9 dias a 37 ˚C. Para estudos mecanísticos, as células MC3T3‑E1 foram pré-tratadas com DKK1 (0,5 µg/ml) por 6 h a 37˚C e foram então tratadas com arbutina (100 µM) por 3 dias a 37˚C.
Proliferação celular. Um ensaio Cell Counting Kit{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japão) foi usado para avaliar os efeitos da arbutina na proliferação celular. As células foram semeadas em placas de poços 96- a uma densidade de 5x103 células/poço por 24 h a 37˚C. Posteriormente, as células foram tratadas com arbutina em várias concentrações (0, 10, 50 e 100 µM). Após 24, 48 ou 72 h, as células foram tratadas com uma solução CCK-8 a 9,1 por cento contendo 10 µl de CCK-8 e 100 µl de ‑MEM por 1‑2 h a 37˚C. O valor da densidade óptica de cada poço foi medido usando um leitor de microplacas (ELx808; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, EUA) em um comprimento de onda de 450 nm. A viabilidade celular relativa foi calculada como a razão entre a absorbância média da amostra e do controle.
Ensaio de marcação de 5‑etinil‑2'‑desoxiuridina (EdU). O efeito da arbutina na proliferação celular foi medido usando um kit EdU Apollo®567 in vitro Imaging (Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangzhou, China). As células foram inoculadas em uma placa de 96-poços a uma densidade de 1x103 células/poço e incubadas em -MEM contendo 10 por cento de FBS com 0, 10, 50 ou 100 µM arbutin. Após uma incubação de 72-h, EdU foi adicionado a cada poço a uma concentração de 50 µM antes de uma incubação adicional por 2 h a 37˚C. As células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com PBS contendo 4 por cento de paraformaldeído por 30 min em temperatura ambiente (RT). Após a lavagem com glicina (2 mg/ml) e PBS, as células foram permeabilizadas com Triton X-100 (0,5 por cento) por 10 min à temperatura ambiente. As células foram incubadas com líquido de reação de coloração Apollo 1X à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Os núcleos celulares foram contrastados com 1X Hoechst 33342 por 30 min à temperatura ambiente. As células EdU-positivas foram visualizadas por microscopia de fluorescência (ampliação, x200; Eclipse Ti; Nikon Corporation, Tóquio, Japão) em cinco campos selecionados aleatoriamente.
Análise do ciclo celular e apoptose. As células MC3T3‑E1 foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 2x105 células/poço. Após uma incubação de 24-h, as células foram tratadas com arbutina em concentrações de 0, 10, 50 e 100 µM. As células foram colhidas após 3 dias à temperatura ambiente e fixadas com etanol a 70% por 12 h a 4°C. As células foram lavadas três vezes com PBS e coradas com solução de coloração de iodeto de propídio (PI) (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China) por 30 min a 37˚C no escuro. O conteúdo de DNA foi medido usando um citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) com o software CellQuest Pro (versão 5.2; BD Biosciences) e o software ModFit LT (versão 3.0; Verity Software House, Inc., Topsham, ME, EUA). Para análise de apoptose, as células tratadas com arbutina foram colhidas e coradas com anexina-V e P I marcadas com isotiocianato de fluoresceína (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) no escuro por 15 minutos à temperatura ambiente. A taxa de apoptose celular foi avaliada usando um citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences) com o software CellQuest Pro (versão 5.2; BD Biosciences).
Ensaio de coloração de fosfatase alcalina (ALP). Os osteoblastos foram semeados em placas de poços {{0}}a uma densidade de 5x104 células/poço incubados em -MEM contendo suplemento osteogênico e tratados com 0 (controle), 10, 50 ou 100 µM de arbutina. Após 9 dias a 37˚C, as células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas em 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente por 10 min. As células foram lavadas três vezes com água destilada e subsequentemente coradas usando o kit de desenvolvimento de cores 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro azul cloreto de tetrazólio ALP (Beyotime Institute of Biotechnology) por 2 h na RT. As células coradas foram visualizadas usando um microscópio de luz (ampliação, x40; Eclipse Ti; Nikon Corporation).
Transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR). As células foram semeadas em placas de 6-poços a uma densidade de 2x105 células/poço. Após o tratamento com arbutina em várias concentrações por 3 dias a 37˚C, o RNA total foi extraído das células MC3T3‑E1 usando o reagente RNAiso Plus (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China). No total, 1 µg de RNA foi transcrito reversamente em cDNA usando um kit de reagentes PrimeScript RT com gDNA Eraser (Takara Biotechnology Co., Ltd.), de acordo com as instruções do fabricante. As condições da reação foram as seguintes: 42˚C por 2 min, 37˚C por 15 min e 85˚C por 5 seg. A qPCR foi realizada usando quantidades iguais de cDNA de cada amostra em um volume total de 20 µl com um sistema ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA) usando SYBR premix Ex Taq II (Takara Biotecnologia Co., Ltd.). As seguintes condições de termociclagem foram usadas: desnaturação inicial a 95˚C por 30 seg, seguida de 40 ciclos de 95˚C por 5 seg e 60˚C por 34 seg. A especificidade da amplificação foi avaliada pela análise da curva de fusão e a -actina serviu como controle interno. Os níveis relativos de expressão gênica foram analisados usando o método 2-ΔΔCq (18). As sequências dos primers utilizadas foram as seguintes: Fator de transcrição relacionado a Runt 2 (RUNX2), direto 5'‑CCAACCGAGTCATTTAAGGCT-3', reverso 5'-GCTCACGTCGCTCATCTTG-3'; cadeia de colágeno tipo I 1 (COL1A1), direta 5'-GCCTCCCAGAACATC ACCTA‑3', reversa 5'-GCAGGGACTTCTTGAGGTTG-3';osso Proteína -carboxiglutamato (BGLAP), 5'-CGC diretoTACCTTGGAGCCTCAGT-3', reverso 5'‑AGGCGGTCTTCAAGCCATAC‑3'; Fator de transcrição Sp7 (SP7), direto5'‑AAGGTGTACGGCAAGGCTTC‑3', reverso 5'‑CGTCAGAGCGAGTGAACCTC‑3'; -catenina, para a frente 5'-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC-3', reverso 5'-CTTGCCACTCAGGGAAGGA-3'; -actina, encaminhar 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3', reverso 5'‑CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.
Análise de Western Blot. As células MC3T3‑E1 foram semeadas em placas de 6-poços a uma densidade de 2x105 células/poço. As células foram tratadas com arbutina em várias concentrações por 3 dias e lavadas três vezes com PBS gelado. A proteína celular total foi extraída de células MC3T3‑E1 usando tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação (Beyotime Institute of Biotechnology) contendo 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila. As proteínas foram isoladas após centrifugação a 13.800 xg por 15 min a 4˚C. A concentração de proteína foi quantificada usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (Beyotime Institute of Biotechnology). Quantidades iguais de proteína (20-30 µg) em cada amostra foram separadas por 10 por cento SDS-PAGE por 2 h a uma voltagem constante (110 V) e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (EMD Millipore, Billerica, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas em TBS mais Tween-20 (TBST; 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7,5 e 0,1 por cento Tween-20) contendo 5 por cento de leite desnatado à temperatura ambiente por 2 h e depois incubados durante a noite a 4˚C com anticorpos primários apropriados. Os anticorpos utilizados foram os seguintes: coelho monoclonal anti- -catenina (1:5,000; cat. no. ab32572; Abcam, Cambridge, MA, EUA), coelho policlonal anti‑RUNX2 (1: 1,000; cat. no. ab23981; Abcam) e mouse policlonal anti- -actina (1:1,000; cat. no. AF0003; Beyotime Instituto de Biotecnologia). Posteriormente, as membranas foram lavadas três vezes com TBST e as membranas de PVDF foram incubadas com imunoglobulina G de cabra anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano (HRP) (IgG; 1:10,000; cat. no. ZB{{ 52}}; OriGene Technologies, Inc., Pequim, China) ou IgG de cabra anti-camundongo conjugada com HRP (1:10.000; cat. no. ZB-2305; OriGene Technologies, Inc.) à temperatura ambiente por 2 h . As proteínas foram visualizadas usando reagentes de quimioluminescência aprimorada (Thermo Fisher Scientific, Inc.) e detectadas com um sistema de detecção de quimioluminescência (Amersham Imager 600; GE Healthcare Life). As proteínas foram quantificadas usando o software ImageJ (versão 1.52; National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Após a normalização, os níveis relativos de expressão de proteína foram calculados com -actina como controle interno.
Análise estatística. Todos os experimentos foram repetidos independentemente pelo menos três vezes. As análises estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA). Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão, e as diferenças significativas foram analisadas pela análise de variância unidirecional juntamente com o teste post hoc de Dunnett. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
Resultados
A arbutina promove a proliferação celular MC3T3‑E1. Os efeitos da arbutina na proliferação celular MC3T3‑E1 foram examinados usando um ensaio CCK-8. Arbutin foi administrado em várias concentrações (0, 10, 50 e 100 µM) por 24, 48 e 72 h, e um ensaio de CCK-8 foi realizado (Fig. 2A). Após 24 h, não foram identificadas diferenças estatísticas na proliferação de osteoblastos em comparação com as células de controle não tratadas. No entanto, a proliferação de células MC3T3‑E1 aumentou significativamente após o tratamento com arbutina a 100 µM após 48 e 72 h. O ensaio de marcação de EdU foi realizado após 72 h e os resultados demonstraram que a porcentagem de células MC3T3-E1 positivas para EdU tratadas com arbutina em uma concentração de 50 e 100 µM aumentou significativamente em comparação com o controle não tratado (Fig. 2B e C) .
Arbutin acelera a progressão do ciclo celular. Os efeitos da arbutina na progressão do ciclo celular foram avaliados usando a análise do ciclo celular (Fig. 3). O tratamento com arbutina a 50 e 100 µM levou a um aumento na porcentagem de células na fase S (Fig. 3A e C) e 100 µM de arbutina levou a uma diminuição na porcentagem de células na fase G1-( Fig. 3D). Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi identificada no grupo de 10 µM em comparação com o grupo controle. Os efeitos da arbutina na apoptose MC3T3‑E1 também foram avaliados por citometria de fluxo (Fig. 3B e E). A taxa de apoptose não foi significativamente alterada após o tratamento com arbutina a 10, 50 e 100 µM em comparação com o controle.
Efeitos da arbutina na atividade da ALP. Os efeitos da arbutina na diferenciação osteoblástica foram analisados por coloração ALP. Após 9 dias, o tratamento com várias concentrações de arbutina (0, 10, 50 ou 100 µM) aumentou notavelmente a atividade de ALP em comparação com o grupo controle (Fig. 4A). Os presentes achados sugeriram que a arbutina pode aumentar a atividade da ALP nas células MC3T3‑E1.
Efeitos da arbutina nos níveis de expressão de mRNA de COL1A1, ‑catenina, RUNX2, BGLAP e SP7. Os níveis de expressão de mRNA de COL1A1, -catenina, RUNX2, BGLAP e SP7 foram avaliados em células MC3T3‑E1 usando RT-qPCR após tratamento com arbutina em várias concentrações (0, 10, 50 ou 100 µM) para 3 dias. Os níveis de expressão de COL1A1 e -catenina foram aumentados em osteoblastos tratados com 10, 50 e 100 µM de arbutina em comparação com células não tratadas (Fig. 4B e C). Os níveis de expressão de RUNX2, BGLAP e SP7 aumentaram significativamente após o tratamento com arbutina a 50 e 100 µM (Fig. 4D‑F).
Efeitos da arbutina nos níveis de expressão proteica de ‑catenina e RUNX2. Para investigar os mecanismos subjacentes da diferenciação osteoblástica induzida por arbutina, os níveis de expressão de proteína de RUNX2 e -catenina foram examinados em células MC3T3‑E1 por western blotting (Fig. 5A e B). O tratamento com arbutina a 100 µM aumentou significativamente os níveis de expressão proteica de -catenina e RUNX2 em osteoblastos em comparação com os controles (Fig. 5C e D, respectivamente). Os presentes resultados sugeriram que a arbutina pode afetar a diferenciação osteoblástica regulando os níveis de expressão proteica de -catenina e RUNX2. Para investigar se a arbutina estimula a diferenciação osteoblástica através da via de sinalização Wnt/-catenina, as células MC3T3‑E1 foram tratadas com 0,5 µg/ml de DKK1 durante 6 h antes do tratamento com 100 µM de arbutina.
DKK1 inibiu significativamente a expressão da proteína RUNX2 induzida por arbutina (Fig. 5E). Os presentes resultados sugerem que a arbutina pode afetar a diferenciação osteoblástica através da via de sinalização Wnt/-catenina.
Discussão
A osteoporose pode resultar em fraturas graves e incapacidades e representa um problema associado à idade em todo o mundo (19). Evidências acumuladas demonstraram que um desequilíbrio entre osteoclastos e osteoblastos na formação e reabsorção óssea pode levar à osteoporose (20). Notavelmente, a formação óssea depende da proliferação e diferenciação dos osteoblastos (21,22).
Vários medicamentos disponíveis usados para tratar a osteoporose são medicamentos antirreabsortivos (23); no entanto, esses tratamentos não são capazes de reverter a perda óssea (24). Agentes anabolizantes que estimulam a formação óssea podem restaurar a microestrutura esquelética gravemente danificada e a perda de massa óssea (24). A teriparatida é um agente anabólico que demonstrou estimular a formação óssea, e ensaios clínicos demonstraram que o tratamento com teriparatida diminuiu o risco de novas fraturas vertebrais e aumentou a densidade mineral óssea no quadril, coluna lombar e colo do fêmur (25). Notavelmente, a teriparatida é um tratamento caro. Portanto, é importante desenvolver novas drogas que possam efetivamente promover a formação óssea.
A arbutina é um agente citoprotetor e não apresenta efeitos citotóxicos significativos em altas concentrações (26). Embora a concentração sanguínea de arbutina não seja clara (13), a arbutina é usada como medicamento antimicrobiano urinário e é considerada um agente oral seguro (27,28). Estudos anteriores demonstraram que o arbutin pode exibir múltiplas atividades, incluindo clareamento da pele (10,11), antiinflamatório (29), anticancerígeno (30) e supressão da diferenciação osteoclástica (13). No entanto, mais estudos são necessários para investigar os efeitos da arbutina sobre os osteoblastos e seu potencial para ser usado como um novo composto para o tratamento da osteoporose. Portanto, o presente estudo investigou os efeitos da arbutina na proliferação e diferenciação de células MCET3‑E1 e os mecanismos subjacentes à função da arbutina in vitro.
A formação óssea está relacionada ao número de osteoblastos e à atividade de osteoblastos individuais (31). O número de osteoblastos pode ser aumentado promovendo a replicação ou diferenciação pré-osteoblástica, ou reduzindo a morte celular de osteoblastos maduros (32). No presente estudo, a arbutina aumentou a proliferação de células MC3T3‑E1 sem afetar a taxa de apoptose. Além disso, o arbutin aumentou a progressão do ciclo celular ao mudar as células da fase G1-para a fase S. Estes resultados sugeriram que a arbutina pode induzir a proliferação osteoblástica.
ALP é um marcador precoce de diferenciação osteogênica (33). ALP está associada com a calcificação do esqueleto durante a formação óssea (34). No presente estudo, os resultados da coloração de ALP sugeriram que os osteoblastos tratados com arbutina a 10, 50 e 100 µM e com um suplemento osteogênico por 9 dias exibiram um aumento da atividade de ALP, sugerindo que o arbutina pode promover a diferenciação precoce de osteoblastos.
Demonstrou-se que a osteogênese é regulada por vários fatores de transcrição, incluindo RUNX2 e SP7, e múltiplas proteínas de matriz óssea específicas, incluindo ALP,BGLAP e COL1A1 (35). RUNX2 e SP7 são importantesFatores de transcrição envolvidos na diferenciação osteoblásticadurante a formação óssea (36). COL1A1 é um extracelularproteína da matriz que promove a regeneração óssea e osteodiferenciação de explosão (37). BGLAP é um não colágenoproteína da matriz óssea que regula a renovação óssea e amineralização (38). O presente estudo identificou que a arbutinapode induzir os níveis de expressão de mRNA de importantesreguladores osteogênicos, incluindo RUNX2, BGLAP, SP7 eCOL1A1. Além disso, o nível de expressão de -catenina foiaumentou. Esses resultados sugeriram que o arbutin pode promoverdiferenciação osteoblástica através de um mecanismo envolvendoWnt/ -sinalização de catenina.
A via de sinalização Wnt influencia a formação óssea durante o desenvolvimento e a remodelação óssea durante a renovação tecidual (39). A via de sinalização Wnt canônica foiidentificado para ser iniciado pela sinalização do ligante Wnt na célulasuperfície através do receptor de lipoproteína de baixa densidadeproteína 5 ou 6 (Lrp5/6) e transmembrana de sete passagensReceptor frisado (40). A interação entre os ligantes Wnte seu receptor pode inibir GSK3- no citoplasma,levando à liberação de -catenina, o meio transcricionalator da sinalização Wnt canônica. Após o lançamento, -cateninapode entrar no núcleo, controlando assim a expressãoníveis de seus genes-alvo (41). RUNX2 pertence ao Runtfamília de genes de domínio e é um fator de transcrição envolvido emdiferenciação osteoblástica (42). O RUNX2 atende a um importantepapel na coordenação de múltiplas vias de sinalização durantediferenciação osteoblástica (43). Um demônio de estudo anteriordemonstrou que a sinalização Wnt canônica pode regular diretamenteRUNX2. Especificamente, o -catenina/HNF1 homeobox Acomplexo pode ativar o nível de expressão de RUNX2,promovendo assim a formação óssea (44). DKK1 é um poderosoinibidor do Wnt/ -catenina via canônica, por ligaçãopara Lrp5/6 (45,46). Os resultados do presente estudo sugeriramque o tratamento com arbutin aumentou significativamente a proteínaníveis de expressão de RUNX2 e -catenina em MC3T3-E1células, e DKK1 diminuiu significativamente a proteína expressanível de integração do RUNX2. Os presentes resultados sugeriram quearbutina pode promover a diferenciação de células MC3T3-E1 via Wnt/via -catenina.
Coletivamente, de acordo com o conhecimento dos autores, o presente estudo é o primeiro a indicar que a arbutina pode estimular a proliferação e diferenciação de células MC3T3‑E1 por meio da via de sinalização Wnt/-catenina. Portanto, o arbutin pode representar um novo candidato potencial para o tratamento da osteoporose. No entanto, mais estudos são necessários para identificar o papel específico da via de sinalização Wnt/-catenina na osteogênese induzida por arbutina, incluindo a fosforilação de -catenina em Ser675 (47); mais informações sobre o papel da sinalização Wnt/-catenina podem ser obtidas usando agonistas Wnt. No futuro, outros estudos podem investigar a capacidade do arbutin de promover a formação óssea in vivo.
Agradecimentos
Não aplicável.
Financiamento
O presente trabalho foi financiado pelo Programa Principal da Fundação Nacional de Ciências da Natureza da China (concessão nº 81370981) e pelo Outstanding Scientific Fund of Shengjing Hospital.
Disponibilidade de dados e materiais
Os conjuntos de dados usados e/ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.
Contribuições dos autores
QF, XM e LiY conceberam e projetaram os experimentos. XM realizou os experimentos e escreveu o manuscrito. SL, LiY, LeY e ML analisaram os dados e revisaram criticamente o manuscrito. QF supervisionou toda a pesquisa e revisou o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Aprovação ética e consentimento para participar
Não aplicável.
Consentimento do paciente para publicação
Não aplicável.
Interesses competitivos
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Referências
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