Aplicações de Aptâmeros em Neurociências Parte 1

Resumo:

Sendo a causa predominante de incapacidade, as doenças neurológicas têm recebido muita atenção da comunidade de saúde global.

O sistema nervoso é uma parte importante do corpo humano. É responsável pela percepção humana, pensamento, movimento, psicologia e emoção. No entanto, algumas pessoas podem ter problemas neurológicos que afetam a memória. As doenças do sistema nervoso referem-se a alterações patológicas no sistema nervoso central e no sistema nervoso periférico, como acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, etc. Estas doenças afectarão a memória, mas todos podemos superá-las através de métodos activos. Melhore isso.

O primeiro é um derrame. Segundo as estatísticas, milhões de pessoas são afetadas por acidente vascular cerebral todos os anos, e um dos sintomas mais comuns é a perda de memória. O AVC é muito prejudicial ao corpo porque afeta as partes do cérebro que fornecem oxigênio e sangue. No entanto, podemos prevenir acidentes vasculares cerebrais praticando exercícios e mudando nossos hábitos alimentares. Por exemplo, o exercício adequado, a manutenção de um peso normal e uma dieta saudável podem efetivamente reduzir o risco de acidente vascular cerebral e, assim, manter uma melhor memória.

Em seguida vem a doença de Parkinson. Esta é uma doença de distúrbio do movimento causada pela morte de neurônios. Além do movimento, a doença de Parkinson também pode afetar a memória. Estudos mostram que a maioria dos pacientes desenvolve comprometimento cognitivo, incluindo perda de memória. No entanto, os pacientes podem tomar várias medidas para retardar a progressão da doença, tais como receber tratamento profissional regular e formação em reabilitação. Ter hobbies como ouvir música, ler e aprender novas habilidades também pode ser benéfico para relaxar o cérebro e ajudar na recuperação da memória.

Finalmente, há a doença de Alzheimer. É uma doença que causa comprometimento cognitivo, sendo a perda de memória um dos sintomas mais evidentes e comuns. No entanto, a doença de Alzheimer também é uma doença que pode ser remitida. A pesquisa mostra que fazer exercícios, seguir uma dieta saudável, aprender novas habilidades e fazer voluntariado pode ajudar a retardar a progressão da doença e melhorar a memória.

Devemos sempre manter uma atitude positiva e adotar métodos ativos para prevenir e tratar doenças neurológicas para melhorar a nossa memória. Mesmo que sejamos afetados, podemos tomar diversas medidas para melhorar a nossa resistência e capacidade de combater a doença. Enquanto persistirmos, encontraremos um caminho melhor e mais saudável para prevenir e tratar a perda de memória. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque a Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês que tem muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da Cistanche deserticola vem dos múltiplos ingredientes ativos que contém, incluindo ácido tânico, polissacarídeos, glicosídeos flavonóides, etc.

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Mais de um bilhão de pessoas sofrem de um dos seguintes distúrbios neurológicos: demência, epilepsia, acidente vascular cerebral, enxaqueca, meningite, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, doença prionar ou tumores cerebrais. As opções de diagnóstico e tratamento são limitadas para muitas destas doenças.

Os aptâmeros, sendo moléculas de ácido nucleico pequenas e não imunogênicas que são fáceis de modificar quimicamente, oferecem potenciais aplicações diagnósticas e terapêuticas para atender a essas necessidades.

Esta revisão abrange estudos pioneiros na aplicação de aptâmeros, que se mostram promissores para diagnósticos e tratamentos futuros de distúrbios neurológicos que representam desafios de saúde cada vez mais graves em todo o mundo.

Palavras-chave: aptâmero; neurociência; doenças neurológicas; distúrbios neurológicos; neurotoxinas; Câncer.

1. Introdução

Aptâmeros são moléculas de DNA, RNA ou XNA sintéticas de fita simples que podem se dobrar em estruturas tridimensionais (3D) únicas pelas quais se ligam às suas moléculas alvo com alta especificidade e afinidade [1,2].

Uma abordagem para selecionar aptâmeros foi alcançada em 1990 por três grupos separados [3–5]. O método agora é conhecido como Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial (SELEX). Desde então, muitos aptâmeros foram selecionados para uso em áreas da ciência básica e um número crescente de aptâmeros estão em subdesenvolvimento para aplicações em terapêutica, diagnóstico e imagem [6–10].

O método SELEX simula a evolução darwiniana in vitro. Inclui várias rodadas de seleção e, após cada rodada, é realizada a amplificação exponencial dos oligonucleotídeos (oligos) "mais aptos".

Uma rodada de SELEX tradicional inclui três etapas na ordem (1) incubar a molécula alvo desejada com um conjunto de oligos com uma região central de 20-60 nucleotídeos de sequência aleatória cercada por regiões terminais de sequência constante que serão modelos para reações em cadeia da polimerase posteriores (PCRs ), (2) capturar os oligos no pool que se ligam com sucesso ao alvo e (3) amplificar os oligos capturados por PCR ou PCR de transcrição reversa (rt-PCR), dependendo do tipo de oligo, DNA ou RNA, respectivamente.

Também estão incluídas rodadas de contra-seleção, nas quais o pool de ácidos nucleicos é passado sobre uma matriz de suporte vazia, sem o alvo desejado ou sobre a matriz de suporte com uma ou mais outras moléculas que possam estar estruturalmente relacionadas à molécula alvo.

Na contra-seleção, os oligos que não se ligam à matriz de suporte ou às moléculas estruturalmente relacionadas são capturados e continuados através de mais rodadas de SELEX.

A contrasseleção é realizada para muitos propósitos, como eliminar oligos que interagem com (1) a matriz de suporte, (2) análogos ou moléculas que estão estruturalmente relacionados ao alvo, ou (3) moléculas presentes em altas concentrações na matriz biológica (como soro ou extrato de tecido) no qual o aptâmero selecionado funcionará.

O principal objetivo da contra-seleção é aumentar a especificidade do aptâmero para o alvo desejado em relação a outros concorrentes moleculares potenciais. Além do SELEX convencional, o SELEX de comutação de estrutura recentemente desenvolvido está se tornando popular [11–13].

Nesta abordagem, os oligos são obrigados a alterar as suas estruturas quando interagem com o alvo, para se dissociarem de uma sequência de captura complementar. Isso garante que os aptâmeros selecionados mudem de estrutura após a ligação do ligante. Outros métodos SELEX alternativos foram desenvolvidos, incluindo CE-SELEX, Cell-SELEX e SELEX in vivo, conforme resumido na Tabela 1.

É perfeitamente possível combinar diferentes procedimentos SELEX para desenvolver técnicas ainda mais complexas. Depois que os aptâmeros são selecionados pelo SELEX, eles são modificados para melhorar suas especificidades e afinidades por diversas abordagens que, na totalidade, podem ser chamadas de maturação.

Existem várias considerações na seleção e maturação de aptâmeros. Primeiro, as estruturas dos aptâmeros e as interações aptâmero-alvo são afetadas pela temperatura e pelos componentes do tampão, incluindo íons, força iônica e pH.

Assim, um dos pontos mais importantes no projeto SELEX é imitar o ambiente (matriz biológica ou composição sal/tampão) durante a seleção em que o alvo molecular do aptâmero é encontrado e a interação entre o aptâmero e o alvo ocorrerá.

A escolha de composições tampão e temperaturas de incubação adequadas garantirá o desempenho ideal dos aptâmeros selecionados nas condições em que serão aplicados [4,30–32].

Em segundo lugar, a estabilidade do aptâmero pode precisar ser melhorada, uma vez que os aptâmeros de DNA e RNA são alvos potenciais para ataques de nucleases. Este é especialmente o caso do RNA, por causa do grupo 20OH, que é usado pelas ribonucleases em um ataque eletrofílico do fosfato da estrutura do ácido nucleico para hidrólise.

Assim, o RNA é mais lábil a altas temperaturas e pH do que o DNA. Os aptâmeros podem ser amadurecidos por modificações químicas pós-seleção para superar essa suscetibilidade. No entanto, tais modificações podem resultar na perda de especificidade e/ou afinidade do aptâmero.

Portanto, geralmente é melhor incluir nucleotídeos modificados durante o SELEX. Muitas modificações possíveis do aptâmero estão listadas na Tabela 2.

Podem ser selecionados aptâmeros que se ligam seletivamente à maioria dos vírus, células, bactérias, proteínas, toxinas e peptídeos com altas afinidades [45–48]. Eles podem ser usados ​​diversas vezes sem interrupção perceptível da atividade. Em outras palavras, eles podem ser separados de seus alvos para uso posterior.

Por outro lado, os anticorpos só podem ser utilizados algumas vezes antes de perderem funcionalidade. Os aptâmeros de ácidos nucleicos também podem ser amadurecidos para serem mais estáveis ​​que anticorpos e enzimas, particularmente em temperaturas mais altas [2].

Além disso, uma vez conhecida a sequência de um aptâmero, sua síntese química e purificação até a homogeneidade são altamente reprodutíveis e baratas. Essas propriedades dão aos aptâmeros o potencial de substituir anticorpos como componentes de unidades de detecção [49].

A flexibilidade das estruturas dos aptâmeros e sua capacidade de "mascarar" regiões de uma sequência de aptâmeros com oligos complementares fornece opções de sinalização que permitem a incorporação de aptâmeros em muitas plataformas de sensores, que não são facilmente adaptáveis ​​a anticorpos. Essas propriedades motivam o desenvolvimento de biossensores baseados em aptâmeros [50–52].

O desenvolvimento de novas ferramentas para diagnóstico é uma das áreas mais importantes no campo dos biossensores, com muitos investigadores buscando criar métodos fáceis, eficientes e mais baratos para alcançar o diagnóstico precoce e a medicina de precisão.

A inclusão de aptâmeros em biossensores (denominados "aptasensores") criou raízes na década de 1990.

Um exemplo inicial de aptâmeros como elementos de bioreconhecimento é um biossensor óptico que usou aptâmeros marcados com fluorescência contra a elastase de neutrófilos humanos em um ensaio homogêneo [53].

Desde então, muitos tipos de designs de aptasensores foram relatados, a maioria com aptâmeros em suportes sólidos e com sinais eletroquímicos, ópticos, mecânicos e acústicos [45,54–56]. Alguns exemplos serão discutidos posteriormente neste artigo.

Os aptâmeros também foram aplicados na terapêutica. Modificações que resultam em aumento da meia-vida e melhora na farmacocinética tornam alguns aptâmeros boas opções para aplicação clínica. Em comparação com os anticorpos, os aptâmeros são muito menos imunogênicos e suas ações podem ser inibidas por oligonucleotídeos complementares reversos (Munzar et al., 2019).

Essas características importantes recomendam aptâmeros para desenvolvimento como terapêutica. Macugen (pegaptanib sódico), que reconhece seletivamente o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), foi o primeiro aptâmero a ser aprovado como agente terapêutico (Tobin, 2006).

Desde então, vários aptâmeros atingiram diferentes estágios de ensaios clínicos nos quais estão sendo testados para o tratamento de condições médicas como câncer de pulmão de pequenas células, distúrbio relacionado ao fator von Willebrand, angiomas e carcinomas de células renais [51,57–60].

Outra aplicação terapêutica potencial de aptâmeros envolve sistemas de entrega [61,62]. Para obter resultados eficientes nesses sistemas, os aptâmeros devem reconhecer proteínas da superfície celular em suas formas nativas.

O Cell-SELEX foi desenvolvido para selecionar proteínas da superfície celular que são frequentemente difíceis de purificar em suas formas nativas [63]. Um aptâmero que reconhece uma proteína de superfície celular pode cooptar o receptor para internalizar uma carga ligada ao aptâmero. Com este método, pode-se selecionar aptâmeros para receptores expressos principalmente em um único tipo de célula que pode ser direcionado in vivo [57].

Por exemplo, aptâmeros anti-PSMA (antígeno de membrana específico da próstata) foram desenvolvidos para a entrega de siRNAs a tumores em camundongos ou células cultivadas [62,64–66].

Na neurociência, o uso de aptâmeros tem sido, até agora, limitado, embora tenha uma ampla gama de aplicações potenciais. Aptâmeros foram relatados como possíveis opções de tratamento para doenças neurodegenerativas que resultam na perda da estrutura e função do sistema nervoso central (SNC), incluindo doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), doença de Creutzfeldt-Jakob, doenças dos neurônios motores e doença de Huntington. doença(DH) (Figura 1). Atualmente, cerca de 50 milhões de pessoas no mundo enfrentam demência, para a qual o custo global dos cuidados de saúde é próximo de um bilião de dólares por ano.

Isto faz das demências um dos maiores problemas médicos e económicos da nossa sociedade [67]. Além disso, de acordo com as Nações Unidas e a Organização Mundial da Saúde, estima-se que a população mundial com mais de 65 anos duplique até 2050.

Portanto, as doenças neurodegenerativas dependentes da idade exigirão gastos crescentes com diagnóstico e tratamento [67].

Essas demandas críticas por métodos que facilitem o diagnóstico precoce e novas aplicações terapêuticas poderiam ser atendidas pelos aptâmeros, que também poderiam ser soluções para algumas das complicações subjacentes [68,69].

Aptâmeros estão sendo desenvolvidos para aplicações em tecnologias de imagem cerebral (MRI, PET, etc.), visualização de neurotransmissores, diagnóstico e terapêutica para tumores cerebrais e outras doenças relacionadas ao cérebro. Em muitas dessas abordagens, os aptâmeros são marcados com radiotraçadores, como o flúor-18 para imagens PET [70]. Nesta revisão, discutiremos as conquistas e desafios da aplicação de aptâmeros em imagens cerebrais e doenças neurais.

2. Detecção Molecular

2.1. Detecção de neurotoxina
As neurotoxinas são um grupo quimicamente diverso de compostos farmacologicamente ativos. Elas exercem efeitos biológicos claros nos sistemas nervosos dos organismos, mas diferem em suas estruturas químicas e mecanismos de ação.

Eles alteram os potenciais de ação e interferem na transmissão dos impulsos nervosos. Para avaliar adequadamente os seus riscos para a saúde humana e os impactos ambientais, é essencial utilizar técnicas suficientemente sensíveis para a sua identificação precisa.

Aptâmeros de ácidos nucleicos têm sido utilizados para validar a presença dessas toxinas em água e amostras biológicas com alta sensibilidade e seletividade [71]. Foram relatados estudos que demonstram a identificação precisa de neurotoxinas botulínicas (Botulinum A, E), saxitoxina, brevotoxina, paraquat e tetrodotoxina por aptasensores.

As neurotoxinas botulínicas (BoNTs) estão entre as neurotoxinas mais mortais e poderiam potencialmente ser empregadas como agentes de bioterrorismo. Para atender à necessidade crucial de um sistema de detecção sensível, eficaz e em tempo real para BoNTs, um SELEX baseado em sol-gel foi usado para isolar aptâmeros de DNA contra a neurotoxina botulínica tipo E (BoNT-E) (47).

As sequências candidatas a aptâmeros, após a quinta rodada, foram analisadas por sequenciamento de próxima geração (NGS), e os aptâmeros de alta frequência foram caracterizados. Nessas famílias de aptâmeros, o aptâmeroBT5.6 apresentou alta afinidade, de 53 nM Kd, para BoNT-E e foi imobilizado em plataforma de óxido de grafeno. Este sensor exibiu um limite de detecção (LoD) de 0,83 nM para BoNT-E.

Brevotoxinas (BTXs) e saxitoxinas são neurotoxinas marinhas que causam envenenamento neurológico por moluscos (NSP). As BTXs são caracterizadas por alta toxicidade e início rápido de NSP. Dificuldades técnicas relacionadas à sua análise encorajaram os pesquisadores a procurar métodos de detecção alternativos, eficazes e baratos para essas neurotoxinas fortes.

Para tanto, foi desenvolvido um aptasensor eletroquímico para detectar BTX-2, para o qual os aptâmeros de DNA selecionados foram caracterizados por espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e fluorescência.

O aptâmero BT10, com afinidade de 42 nM para BTX-2, foi incorporado a um biossensor impedimétrico competitivo sem rótulo que demonstrou um limite de detecção de 95 pM de BTX-2.

Este aptasensor foi capaz de detectar BTX -2 em um extrato de marisco enriquecido com uma resposta confiável na presença de uma matriz de marisco [72]. Como a segunda classe de neurotoxinas marinhas, a saxitoxina foi caracterizada por sua importância para a saúde pública.

Novos estudos foram necessários para serem desenvolvidos como alternativas adequadas devido às questões técnicas e éticas dos sistemas atualmente aplicados. Para atender a essa necessidade, foi desenvolvido um aptasensor competitivo de interferometria de biocamada óptica sem rótulo. O biossensor tem um limite de detecção de 1,66 nM para saxitoxina, com alto grau de seletividade e sensibilidade, boa estabilidade e capacidade de detecção rápida [73].

Semelhante às toxinas marinhas, as neurotoxinas liberadas na picada de cobra estão entre as toxinas mais poderosas e letais. Infelizmente, o diagnóstico convencional de picada de cobra baseado em ensaios de coagulação sanguínea e sintomas clínicos não pode fornecer um diagnóstico preciso. Além disso, variações dependentes do lote no desempenho dos anticorpos complicam seu uso em diagnósticos.

Uma versão truncada de alta afinidade de um aptâmero -Tox-FL, originalmente selecionado contra a bungarotoxina de Bungarus multicinctus (-Tox-T2) com uma afinidade mais alta (Kd=2,8 nM) do que o pai -Tox-FL (18 nM), foi aplicado em um formato de ensaio de aptâmero ligado a enzima.

Nesta configuração, o aptâmero -Tox-T2 poderia detectar a toxina em apenas 2 ng de veneno bruto, o que demonstrou seu potencial para detecção de veneno de Bungarus caeruleus (74).

2.2. Detecção de neurotransmissores

Para explorar as complexidades funcionais do cérebro, pode-se usar o monitoramento das atividades dos neurotransmissores e das vias de sinalização. Os neurotransmissores são essenciais para a transferência de informações entre as células e desempenham papéis importantes em distúrbios neurológicos, como epilepsia, doença de Parkinson (DP) e doença de Alzheimer (DA).

Em vários estudos, aptâmeros específicos para dopamina, epinefrina ou serotonina foram usados ​​para desenvolver biossensores baseados em aptâmeros para detecção de neurotransmissores, in vivo e in vitro [75].

Um neurotransmissor de catecolamina, a dopamina (DA), regula aspectos do metabolismo humano e funções dos sistemas cardiovascular e renal. Várias doenças neurodegenerativas, especialmente a DP, demonstraram estar diretamente correlacionadas com o metabolismo anormal da DA [76].

Assim, o desenvolvimento de biossensores altamente sensíveis e seletivos para determinação de DA é importante em sistemas biológicos. O primeiro aptâmero de RNA contra DA, dopa2, ligou-se a DA com uma afinidade representada por Kd=2,8 nM (77).

Usando este aptâmero, um aptasensor eletroquímico sem rótulo baseado em um filme composto de grafeno-polianilina detectou com sucesso a presença de soro desumano DA, com um LoD de 1,98 pM [78]. Em um estudo mais recente, outro aptasensor DA foi desenvolvido composto por um aptâmero de DNA como sensor e um composto de óxido de grafeno de colágeno de pele de carpa capim (GCSC-GO) como transdutor.

O compósito foi preparado via ultra-sonicação e caracterizado por espectroscopia infravermelha (IR) e Raman, microscopia de força atômica e EIS. Este sistema incluiu imobilização de aptâmeros em colágeno seguida de voltametria de pulso diferencial.

Embora o aptasensor tenha demonstrado um LoD mais alto de 00,75 nM, em comparação com o sensor anterior com 14h, ele mostrou alta seletividade para compostos excessivamente relacionados com DA e mediu DA com precisão na presença de 10% de soro [79].

Para a análise de várias moléculas com rótulo livre, alta sensibilidade e seletividade, foi relatado recentemente um sensor de matriz microcantilever com aptâmeros. O sensor consiste em um conjunto de 12 microcantilevers modificados com aptâmeros DA tiolados e utiliza nanopartículas de ouro (AuNP) conjugadas com um trecho de DNA que é complementar ao DAaptamer na superfície do microcantilever.

Inicialmente hibridizados com o aptâmero DA, os conjugados AuNP-DNA são liberados quando o aptâmero se liga ao DA, o que aumenta o estresse superficial do arranjo em cerca de 15 vezes e aumenta a deflexão.

O sistema tem uma resposta linear na faixa de 0,5 a 4 µM de DA com um LoD de 77 nM. Sua especificidade foi demonstrada com 12 análogos estruturais e funcionais, incluindo L-DOPA, nenhum dos quais iniciou deflexões [80].

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