Potencial antioxidante e antienvelhecimento de uma formulação de peptídeo (Gal2–Pep) conjugada com ácido gálico
May 04, 2023
A pele é altamente vulnerável ao envelhecimento prematurodevido ao estresse externo, portanto, neste estudo, uma formulação de peptídeo, (galloil)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) foi sintetizado combinando o peptídeo TPPTTP e o gálicoácido (AG). Todos os peptídeos foram sintetizados em 2-resina de cloreto de clorotritila usando peptídeo em fase sólidasíntese (SPPS), e analisados em uma ionização por eletrospray (ESI)/quadrupolo-time-of-FLFLsistema de espectroscopia de massa (MS) em tandem (Q-TOF). Inicialmente, Gal2–Pep não apresentou toxicidade abaixo da concentração 100mM com uma taxa de sobrevivência celular de 88% para queratinócitos efibroblastos. Oespécies que reagem ao oxigênio(ROS) atividade de eliminação de Gal2–Pep foi mais estável em comparação com GA sozinho; e depois de quatro semanas no quartotemperatura, suaatividade de eliminação de ROSpermaneceu acima de 50 por cento. Além disso, a formulação do peptídeo,Garota2–Pep também exibiu um efeito inibidor da elastase no CCD-1064Skfibroblastocélulas. Com base nos resultados do RT-qPCR, foi comprovado neste estudo que Gal2–Pep aumentou a expressão de PGC-1a paraevitarestresse oxidativo, e validou seu potencial comoagente antienvelhecimentoporaumentando a expressão decolágeno tipo Ie pordiminuindo a expressão da metaloproteinase da matriz-1 (MMP1). Oachados obtidos reforçam a sugestão de que a formulação de peptídeo sintetizada neste estudo poderia ser usada comoantioxidante naturaleagente antienvelhecimentopara suas aplicações cosméticas.
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1. Introdução
Envelhecimento da peleocorre como resultado da diminuição gradual e eventual interrupção da divisão celular de queratinócitos e brotos.explosões dentro da pele. As rugas na pele se desenvolvem à medida que o número de células diminui, com a conseqüente desnaturação da matriz extracelular levando ao ressecamento e perda de elasticidadeticidade na pele.1 Danos ao DNA mitocondrial intracelulare uma redução na taxa de síntese de proteínas também ocorredurante o processo de envelhecimento da pele.2 O envelhecimento da pele tem dois caminhos principaisformas, intrínsecas e extrínsecas, com exposição ultravioleta (UV)
um grande impulsionador deenvelhecimento extrínseco. A luz UV reage com os principais componentes da pele, incluindo lipídios, proteínas e ácidos nucleicos, para produzir espécies reativas de oxigênio (ROS) que levam à célulamorte.3–5 Níveis excessivos de ROS também levam à clivagem eligação anormal de cadeias de colágeno ou elastina e promovem a expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs), como MMP-1, que quebram o colágeno, levando ao enrugamento da pele eacelerando o envelhecimento da pele.6,7 Portanto, a terapia antioxidante para removerROS e para ativar o potencial mitocondrial tem o mérito de proteger a pele do envelhecimento.
Além das ROS, a elastase tem um papel significativo na perda deelasticidade da pele, que quebra a elastina, uma importante proteína doMatriz extracelular.8 Elastina, devido ao seu recuo elástico significativocaracterísticas, conferem elasticidade à pele, enquanto a elastase tema capacidade de clivar a elastina e outras proteínas.8 Portanto, inibeA ação da enzima elastase pode ser uma estratégia chave para a flacidez da pele por meio de evitando a perda de elasticidade da pele.
Neste estudo, projetamos um novo material que combina ascoativador gama receptor ativado por proliferador de peroxissoma1-alfa (PGC-1a)-peptídeo derivado TPPTTP e ácido gálico (GA)para uso em cosméticos antienvelhecimento. GA é um fitoquímico encontrado em várias frutas e vegetais, incluindo uvas, tomates e chá verde, que é conhecido por ter alto poder antioxidante e antibacteriano. eFfECTS.9 Embora o GA seja usado nas indústrias de cosméticos e alimentos por causa desses efeitos benéficosFfefeitos, sua formulação tende a ser instável.10 Desenvolvemos assim (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) para aumentar a estabilidade do GA vinculando-o ao PGC-1apeptídeo derivado TTPTTP.
Neste estudo, nós sintetizamos um (galloil)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) formulação de peptídeo em conjugação com ácido gálico e confirmadoseu potencial como agente antioxidante e antienvelhecimento.
2. Materiais e métodos
2.1. Materiais
Dulbecco's modificadoMeio de Eagle (DMEM), penicilina/estreptomicina, soro fetal bovino (FBS), fosfato-buFferguidosolução salina (PBS) e tripsina foram adquiridos da Gibco (Carls
ruim, AC). Hidroxibenzotriazol (HOBt), diisopropilcarbodiimida (DIC), 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diisopropiletilamina (DIEA), ácido gálico eN-succinil-tri-alanil-pnitroanilida foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Forma aminoácidos (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH e Fmoc-Pro–OH) foram adquiridos da Bead-Tech (Seul,Coréia).
2.2. Síntese de peptídeos e peptídeos acoplados a ácido gálico
Todos os peptídeos foram sintetizados em 2-resina de cloreto de clorotritila (200mescala molar, valor de substituição¼ 1,46 mmol g 1) usando HOBt–Síntese de peptídeos em fase sólida mediada por DIC (SPPS).
A síntese de peptídeos usando o método SPPS foi realizada com ligeiras modificaçõesreferências a estudos anteriores.11–13 O 2-resina de cloreto de clorotritila (CTC) foi inchada em dicloro
metano (DCM, 8 mL) por 30 min. A resina foi lavada comdimetilformamida (DMF). Todas as reações foram realizadas em temperatura ambiente. Derivados de aminoácidos protegidos por Fmoc (2 equivalentes(Equiv.), para oFiprimeiro aminoácido ligado ou 5 equiv., para os outros aminoácidos) foram acoplados com DIEA (5 equiv., para um aminoácido ligado) ou HOBt/DIC (6 equiv./5 equiv.) em DMF apéserrealizando a desproteção de Fmoc usando 2 por cento (v/v) DBU em DMF (2 vezes, 2 min por vez, 8 mL). E todas as etapas foram lavadas 5 vezes com DMF. O ácido gálico final foi acoplado com peptídeos ligados à lisina.Após o acoplamento do ácido gálico, a resina foiafiltrado, lavado,e secos em alto vácuo. A solução de clivagem (TFA:água deionizada [DI]: TIS¼ 95: 2,5: 2,5, v/v/v por cento) foi tratado por 2 hpara obter os peptídeos brutos. Os peptídeos brutos foram precipitados e lavados três vezes com éter dietílico frio.
Cromatografia líquida analítica de alta performance de fase reversa(RP-HPLC) foi conduzido em um Waters 2695 SeparationsMódulo com uma coluna Capcell Pak C18 (4,6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). A fase móvel consistiu em 00,05 por cento de TFA em H2O (fase móvel A) e 00,05 por cento de TFA em acetonitrila (fase móvel B).
A eluição foi conseguida empregando um gradiente linear parafase B de 5 por cento a 65 por cento ao longo de 30 min a umaVazão de 1.0 mL min 1. Os picos peptídicos foram detectados em um comprimento de onda de 230 nm. A RP-HPLC semi-preparativa foi conduzida em um sistema Waters HPLC (Pump 600E, Detector UV-484) com um Gemini RP-C18coluna (21,2 mm 250 mm, 5mm, Phenomenex). A fase móvel consistiu em 00,05 por cento de TFA em H2O (fase móvel A)e 00,05 por cento de TFA em acetonitrila (fase móvel B). A eluição foi conseguida empregando um gradiente linear para a fase móvel B de7 por cento a 22 por cento ao longo de 15 min a umaltaxa de fluxo de 10 mL min 1. Opicos peptídicos foram detectados espectrofotometricamente em um comprimento de onda de 230 nm.
Os peptídeos sintetizados foram dissolvidos em 5 por cento de ácido fórmico em água e analisados em uma ionização por eletropulverização (ESI)/quadrupolo-tempo-de-lespectroscopia de massa em tandem (Q-TOF)(MS) (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). As amostras foram injetadas no sistema Q-TOF equipado comuma fonte de nanospray em umltaxa de 1mL min 1. O íon ESIos parâmetros da fonte foram os seguintes: uma voltagem de íon spray de 1,5 kV, gás de cortina a 10 psi e gás de bainha a 5 psi. Os espectros emmodo de varredura completa e MS/MS foram coletados na faixa dem/z
100–1200 Da em um tempo de acumulação de 25 ms por espectro.A energia de colisão aumentou de 10 para 80. O resultadoos dados foram adquiridos usando o Analyst TF, entãoware e automaticamenteatribuído pelo centróide 80 por cento com um pico mínimo, redução de ruído de 10 por cento, deisótopo médio com um limite de 3 por cento, sem redução de ruído e sem suavização. Os peptídeos sintetizados foram identificadoscom uma tolerância de massa de 0,05 Da e sequenciado manualmente usando uma tolerância MS/MS de 0.01 Da.
2.3. Culturas de células e ensaios de viabilidade
Células humanas, adultas, com baixo teor de cálcio e alta temperatura (HaCaT)e CCD-1064Sk (pele humana normalfibroblastos) células foramcultivada em DMEM com 10 por cento de FBS e 1 por cento de penicilina/estreptomicina. As células foram incubadas a 37 C em uma câmara de ar umidificado com 5 por cento de CO2.Para os ensaios de viabilidade, foi utilizado o kit de contagem de células-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Pequim, China). HaCaT e CCD-1064Células Skforam semeados em microplacas 96-poços (5 103 células por poço) e incubadas a 37 C em 5 por cento de CO2 por 24h. As culturas foram então expostas a diferentes concentrações dos peptídeos sintetizados ou GA e incubadas a 37 C em 5 por cento de CO2 por 24h. Viabilidade celularfoi posteriormente medido usando um CCK-8 seguindo as diretrizes do fabricante.
2.4. Determinação da atividade antioxidante
2.4.1. Ensaio DPPH.A atividade antioxidante do sintetizadopeptídeos e AG foram avaliados individualmente usando o ensaio DPPH. Os ensaios de DPPH foram realizados seguindo um procedimento previamente relatado
metodologia com modi menorcação.12,14–16 Primeiro, um 0,12 mg mL 1 A solução de DPPH foi preparada em metanol, então 100mL de solução DPPH e 100mL dos peptídeos sintetizados ou GA foram misturados em diferentes concentrações ({{0}}.1 mM, 0.05 mM, 0,01 mM e 1mM) em 96-microplacas bem. Em uma incubadora de agitação orbital, omisturas foram feitas reagir por 30 min a 37 C e 100 rpm semluz. A absorbância foi então medida em 517 nm e a capacidade antioxidante foi calculada.
2.4.2. Atividade de eliminação de ROS.
A atividade de eliminação de ROS intracelular foi avaliada usando um kit de diacetato de 2070-diclorofluoresceína(DCF-DA, Abcam, EUA). Células HaCaT foram semeadas em microplacas 96-poços (5 103 células por poço) e incubadas a 37 C por 24h.ApésApós a incubação, as culturas foram expostas aos peptídeos sintetizados ou GA (100mM) e incubados a 37 C por 24h. As células foram então expostas a 10msolução M DCF-DA e incubados por 30 min. ApésApós a incubação, a solução foi lavada com PBS. Oas células foram analisadas usando um leitor de microplacas na excitação e
comprimentos de onda de emissão de 485 nm e 530 nm, respectivamente.
Figura 1Etapa sintética e confirmação de sequência de peptídeos usando tempo quadrupolo devoo(Q-TOF) espectrometria de massa: (a) procedimento sintético detalhado (b) TPPTTP, (c) galoil–TPPTTP, e (d) (galloil)2–KTPPTTP.
2.5. Ensaio do potencial de membrana mitocondrial
O corante JC-1 (Thermo Fisher, EUA) foi usado para aensaio de potencial de membrana (MmP). As células CCD-1064Sk e HaCaT foram semeadas em 96-microplacas de poço (5 10 3células por poço)
e incubado a 37 C e em 5 por cento de CO2 por 24h. popaer incubação,as culturas foram expostas a diferentes concentrações dos peptídeos sintetizados e incubadas a 37 C em 5 por cento de CO2 por 24h.O corante JC-1 foi adicionado às células CCD-1064Sk e HaCaT paraproduzir um concentração final de 10mM. ApésApós 10 min de incubação, as células foram lavadas duas vezes com 37 C PBS. verde e vermelhofluorescênciaforam medidos usando um Varioskan LUXLeitora de microplacas multimodo (ThermoFisher, EUA) em um excitação (lEx)/emissão (lEme) de 475/530 nm e umalEx/lEmde 475/590 milhas náuticas, respectivamente.
2.6. Ensaio de atividade inibitória da elastase
As células CCD-1064Sk foram semeadas em 6-placas de poços e incubadas a 37 C em 5 por cento de CO2 por 24h. As culturas foram então expostas a uma concentração de 100mM dos peptídeos sintetizados ou GA e incubados a 37 C em 5 por cento de CO2 por 24h. As células foram lavadas com dPBS duas vezes e coletamos cada célula usando raspador de células. Aer adicionando 0,2 M Tris–HCl (pH 8.0) com 0.1 por cento Triton-X para o coletadocélulas, as células foram homogeneizadas por ultrasonicator. A solução homogeneizada foi centrifugada por 20 min a 3000 rpme 4 C. Em seguida, umpéser tomando o sobrenadante, quanti de proteína-catião foi realizada usando o ensaio de proteína BCA. Proteína para cada umamostra foi dispensada noFiconcentração nal de 100mgmL 1, eN-succinil-tri-alanil-p-nitroanilida foi adicionado noconcentração final de 1,6 mM e reagiu a 36 C por 1h.Em seguida, a absorbância foi medida a 405 nm usando um leitor de microplacas.
2.7. RT-qPCR
Os níveis de mRNA de marcadores antienvelhecimento em células CCK-1064Skforam avaliados por RT-qPCR. O RNA total foi coletado usando reagente TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) e reverso
transcritas usando o kit de reagentes PrimeScript RT (Takara BioInc., Kusatsu, Japão). Um sistema CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora
tories) foram usados para RT-qPCR.b-Actina foi usada para normalizar os níveis de mRNA de colágeno tipo I, MMP-1 e PGC-1a.
2.8. Análise estatística
Os dados são apresentados como a média desvio padrão detrês medições independentes e analisados usando Student'st-testes, comp < 0.05 considered to be a signinão posso fazer diferença.
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