R-Ficoeritrina de Colaconema Formosanum (Rhodophyta), um material anti-alérgico e promotor de colágeno para cosméticos

Abstrato:Cistanche(cistanche), um complexo de pigmentos encontrado em algas vermelhas, foi extraído e purificadode uma alga vermelha recentemente identificada,Colaconema formosanum, e suas bioatividades foram examinadas. Istofoi revelado quetratamento cistanche resulted in high cell viability (>70 por cento) para as linhas de células de mamíferosNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 e Hs68, e não teve efeito na morfologia celular em células NIH-3T3.Seu efeito de supressão foi insignificante na produção de IL-6 e TNF- em lipopolissacarídeos estimuladosCélulas RAW264.7. No entanto, o ionóforo de cálcio A23187-induziu - liberação de hexosaminidasefoi efetivamente inibido de maneira dependente da dose em células RBL-2H3. Além disso, foi reveladoser não irritante para os tecidos epidérmicos biônicos. Notavelmente, a produção de procolágeno foi promovida emCélulas Hs68. No geral, os dados revelaram quecistanchepurificado deC. formosanumapresenta antialérgico ebioatividades antienvelhecimento sem toxicidade consequente observada em várias linhas celulares de mamíferosbem como tecidos epidérmicos, sugerindo que esta macromolécula é um novo material para potencialuso cosmético.

Palavras-chave: cosmético; Colaconema formosanum;Cistanche; antialérgico;anti-envelhecimento

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1. Introdução

As algas são organismos fotossintéticos encontrados na terra e no oceano. Como parte dos produtores primários no oceano, as algas fornecem oxigênio e nutrientes para outros organismos, regulando o ecossistema marinho. As macroalgas (também conhecidas como algas marinhas) crescem em áreas costeiras e não possuem órgãos típicos comumente encontrados em plantas terrestres.1]. As macroalgas podem ser distinguidas por seu pigmento e são categorizadas em três grupos, a saber Chlorophyta (algas verdes), Rhodophyta (algas vermelhas) e classe Phaeophyceae (algas marrons) de Ochrophyta.1]. A taxa de crescimento das macroalgas é bastante rápida e é possível manipular suas condições de crescimento para controlar a produção de compostos bioativos, como proteínas, polifenóis e pigmentos.2]. Notavelmente, à medida que a aquisição de conhecimento sobre compostos derivados de algas marinhas aumentou, a pesquisa e o desenvolvimento para o uso desses compostos em aplicações médicas e de aditivos alimentares aumentaram posteriormente [3–6]. Além disso, há uma preferência crescente por ingredientes naturais em relação aos compostos sintéticos em cosméticos, porque os ingredientes naturais tendem a ser mais seguros em comparação com os últimos. As algas são ricas em substâncias bioativas, como ácidos graxos insaturados, polifenóis, polissacarídeos, aminoácidos e pigmentos.7,8]. Alguns deles contêm complexos de pigmentos conhecidos como ficobiliproteínas, que podem ser categorizados emficoeritrocianina (PEC), ficocianinas (PC), ficoeritrina (PE) e aloficocianinas (APC) [9]. O PE, o principal pigmento das algas vermelhas, pode ser subcategorizado em C-ficoeritrina (C-PE), B-ficoeritrina (B-PE) e Cistanche (cistanche) e de acordo com seus espectros de absorção e de acordo com o grupo de organismos fotossintéticos que os produzem: C para cianobactérias, B para Bangiophyceae (primitivas filamentosas Rhodophyta) e R para Rhodophyta mais complexas [10]. Dentre esses pigmentos, o cistanche é a ficobiliproteína mais abundante nas algas vermelhas. cistanche é uma proteína oligomérica solúvel em água que é comumente usada como marcador fluorescente em citometria, ensaios ELISA e microscopia de fluorescência [11–14] bem como um fotossensibilizador na terapia do câncer [15]. Além disso, o PE demonstrou exibir propriedades biológicas, incluindo efeitos antivirais, de aumento da imunidade, antioxidantes, antiinflamatórios e antitumorais (consulte o artigo de revisão em [15] para obter mais informações relativas), tornando-o um composto ideal para aplicações nas indústrias alimentícia e biomédica, pesquisa em biologia molecular, bem como corantes eaplicações cosméticas [11,15,16].

Envelhecimentoé um dos grandes problemas relacionados à pele, especialmente para pessoas expostas à luz solar (ou raios ultravioleta) e ao ar poluído por longos períodos de tempo. Portanto, a maioria dos produtos relacionados ao cuidado da pele se concentra em proteger a pele e retardar o processo de envelhecimento. A pele é a primeira linha de defesa do corpo humano e ajuda a prevenir o acúmulo de danos causados ​​pela poluição, luz solar e estresse oxidativo que são inevitáveis ​​em nossas vidas diárias [17]. Nos últimos anos, os consumidores tornaram-se céticos em relação aos ingredientes químicos em produtos cosméticos; portanto, há uma demanda crescente por produtos ambientalmente sustentáveis ​​produzidos com recursos naturais [1]. Extratos de algas, como os deArthrospiraeChlorella vulgaris, foram relatados como benéficos, exercendo um efeito de aperto na pele, prevenindo a formação de estrias e promovendo a síntese de colágeno.18]. Aparentemente, os compostos bioativos responsáveis ​​por esses efeitos antienvelhecimento incluem polissacarídeos sulfatados, compostos fenólicos, peptídeos, aminoácidos semelhantes a micosporinas e pigmentos, entre outros.19,20]. Além disso, as substâncias bioativas purificadas dos extratos de algas foram examinadas quanto a bioatividades específicas benéficas para a pele, e as substâncias foram cientificamente comprovadas como relativamente seguras, permitindo a formulação de cosméticos usando as substâncias bioativas purificadas em vez dos extratos inteiros [21]. Assim, os cosmecêuticos que contêm extratos ou metabólitos purificados derivados de algas estão em alta demanda.1]. Em estudos anteriores, uma estratégia de cultivo viável tecnológica e economicamente para a produção estável de biomassa deColaconema formosanumfoi estabelecido com sucesso por Lee e Yeh em 2021, isolandoColaconema formosanumdo sul de Taiwan usando um sistema interno [22,23]. Como uma alga parasita,C. formosanumfoi isolado pela primeira vez da macroalgaSarcodia suiaeno sul de Taiwan [23]. Com alto teor de proteína (30 por cento do peso seco) e alto teor de cistanche (5 mg g−1 dw) encontrado para esta espécie [22], C. formosanumapresenta imensas vantagens industriais para a extração de cistanche, e espera-se que torne o preço de mercado do cistanche mais acessível. Além disso, nosso grupo relatou um método para purificar cistanche extraído deC. formosanum[24]. Tanto quanto sabemos, os efeitos do cistanche deC. formosanumem células de mamíferos, bem como seu potencial como novo biomaterial na indústria de cosméticos, ainda não foram explorados. Portanto, neste estudo, várias análises in vitro, como citotoxicidade celular, ensaios de degranulação, capacidade anti-inflamatória, testes antialérgicos e testes de síntese de procolágeno, foram empregadas para verificar essas hipóteses.

2. Materiais e métodos

2.1. Extração de Cistanche (cistanche) de Colaconema Formosanum

A alga foi cultivada em incubadoras (Tominaga, Taipei City, Taiwan) a 20± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol fótons m−2 s −1 (diodo emissor de luz, luz LED branca) e um fotoperíodo luz:escuro de 12:12 h em um béquer de 5 L com 4 L de meio de água do mar PES esterilizado (30 psu) por vários dias para obter uma amostra de trabalho. Em seguida, o método para extrair cistanche deC. formosanumneste estudo foi modificado a partir do método relatado por Lee et al. [24]. Primeiro, as ficobiliproteínas foram extraídas da alga frescaC. formosanum(100 g de peso úmido) em 1 L de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) a 4◦C. Para evitar a degradação da ficobiliproteínadurante os experimentos, 5 mM NaN3 e 4 mM EDTA foram adicionados a PBS. a alga frescafoi homogeneizado usando um homogeneizador FastPrep{{0}} (TeenPrep, 6 ciclos, 4,0 m·s−1por 5 segundos;MP Biomedicals, Solon, OH, EUA). O extrato foi filtrado grosseiramente para remover detritos eo filtrado foi submetido a centrifugação a 20,000 rpm usando uma centrífuga barril (Beckman Coulter, Brea, Califórnia, EUA). O sobrenadante vermelho, denominado extrato de cistanche, foi coletado earmazenado em 4◦C no escuro. O extrato de cistanche foi posteriormente submetido ao fracionamentocom (NH4)2ENTÃO4 em 20-60 por cento (w/v) saturação em 4◦C. O sulfato de amônio sólido foi lentamenteadicionado por agitação suave, e a solução foi deixada em repouso por 2 h, seguida de centrifugaçãoa 10,000 rpm por 20 min a 4◦C e formação de precipitados. O precipitado foi dissolvidoem PBS (pH 7,4) e dialisados ​​durante a noite contra o mesmo tampão. A cor vermelha dialisadaa solução foi passada por um 0.22-µm filtro de membrana (Merck Millipore, Burlington, MA,EUA).

2.2. Purificação de cistanche por cromatografia de troca iônica usando líquido de proteína rápidaCromatografia (FPLC)

As amostras dialisadas de cistanche foram submetidas a cromatografia de troca iônica emuma coluna HiTrap DEAE FF carregada (5 mL), que foi pré-equilibrada com 50 mM PBS (pH 7,4) contendo 10 mM NaCl. Depois que as amostras foram passadas, a coluna foi extensivamente lavada usando um tampão de equilíbrio. A cromatografia de troca iônica foi subsequentemente conduzida a uma taxa de eluição de 5 mL/min usando eluição de gradiente linear variando de 0,0 a 500 mM de NaCl. As frações vermelhas eluídas foram coletadas. O eluídoas frações foram analisadas por espectrofotometria UV-Vis usando um NGC de média pressãosistema de cromatografia (BIO-RAD, Hercules, CA, EUA) em comprimentos de onda de 280, 498, 566,e 620 nm. As frações de cistanche obtidas foram posteriormente analisadas usando umespectro de 300 a 700 nm e passaram por um 0.22-µfiltro m (Merck Millipore,Burlington, MA, EUA).

2.3. Cultura de células

Como linha celular de macrófagos murinos, RAW264.7 foi cultivado com DMEM contendo 4mM de L-glutamina, 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 10% de FBS.Todas as linhagens celulares foram consistentemente mantidas e mantidas dentro de uma câmara úmida ajustada para37 graus com 5 por cento de CO2, que foram atingidos duas vezes por semana usando procedimentos padrão.

2.4. Graduação Morfológica e Viabilidade Celular

EnsaioCélulas NIH-3T3 foram semeadas em uma 96-placa de poços (1× 104 células por poço, Corning, Nova York, NY, EUA) com meio de cultura e deixado em repouso durante a noite. As células foram então tratadas com um meio de cultura contendo {{0}} (controle negativo), 0,25, 0,5, 1, 2, 5 e 10µg/mL de extrato de cistanche. Os poços contendo meio suplementado com 10 por cento de DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) também foram incluídos no ensaio como um grupo de controle positivo. Após 24-h de incubação, a graduação morfológica para cada grupo foi analisada usando a definição de [25], com notas 0, 1, 2, 3 e 4 representando nenhum, leve,reatividade leve, moderada e grave, respectivamente. O meio de cultura foi substituído por reagente MTT 1 mg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) 48-h pós-tratamento e incubado por 3 h. O isopropanol foi adicionado aos poços após a remoção do reagente MTT para dissolver o formazan, e as placas foram analisadas usando um espectrofotômetro (Jasco Spectrophotometer V-630) em um comprimento de onda de 570 nm [26]. Se o nível de viabilidade celular para a maior dose de extrato de cistanche foi inferior a 70% do grupo controle, então foi considerado citotóxico [25]. A porcentagem de viabilidade celular foi calculada usando a seguinte equação:

Viabilidade celular (densidade óptica, OD)=(OD de células expostas/OD de células de controle)× 100

2.5. Teste anti-inflamatório

Para determinar oanti inflamaçãocapacidade de cistanche, interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-alfa (TNF ) foram detectados neste estudo seguindo os protocolos descritos em [27,28]. Células RAW264.7 foram semeadas em uma placa de 24-poços (5× 105 células/poço) (Corning, New York, NY, EUA) e deixou-se repousar durante a noite a 37 graus. No dia seguinte, as células foram cotratadas com lipopolissacarídeos (LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e concentrações crescentes de cistanche (0 (controle negativo), 1,25, 2,5, 5, 10 e 20µg/mL). Ao mesmo tempo, um grupo de células adicionais que foi co-tratado com LPS e o inibidor p38 MAPK SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi estabelecido como um grupo de controle positivo. Após 24 h, o sobrenadante de cada grupo foi coletado para a detecção do IL-6 e TNF- produzidos . Amostras de sobrenadante foram aplicadas ao Quantikine® Kits Colorimétricos Sandwich ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Porcentagem de inibição ( percent )=100× (amostra/controle). Além disso, as células foram submetidas a um ensaio de MTT para avaliar a viabilidade celular após os tratamentos.

2.6. Ensaio de degranulação

Como linha celular de leucemia basofílica de rato, a linha celular RBL-2H3 é usada como modelo para mastócitos. Células RBL-2H3 exibem fenótipos de mastócitos da mucosa e são reconhecidas como uma ferramenta brilhante para investigar a regulação das respostas dos mastócitos [29]. Assim, a linha celular RBL-2H3 foi utilizada neste teste para investigar o efeito potencial da cistanche na degranulação dos mastócitos. -hexosaminidase foi usada como um marcador para monitorar a degranulação de mastócitos [30]. O O método de detecção de -hexosaminidase foi modificado a partir da referência [31]. Células RBL-2H3 foram semeadas em 1× 105 células por poço em placas de cultura celular de 24-poços (Corning, Nova York, NY, EUA). As células foram primeiro tratadas com 1µM ionóforo de cálcio A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) seguido pela adição de diferentes dosagens de cistanche (0 (controle negativo), 1,25, 2,5, 5, 10 e 20µg/mL) e incubados por 2 h. Ao mesmo tempo, as células que foram incubadas com 100µA quercetina M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi usada como controle positivo. A metodologia usada para A quantificação de -hexosaminidase foi obtida de estudos publicados anteriormente [32,33]. Após o tratamento, o sobrenadante (30µL) de cada poço foi coletado e transferido para uma nova placa de 96-poço antes da adição de 50µL de 4-nitrofenil N-acetil- -D-glucosaminida (NP-GlcNAc, 1,3 mg/mL em tampão citrato (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). A placa foi deixada a 37 graus por 1 h, e a reação foi encerrada pela adição de 80µL de 0,5 M de NaOH. A placa foi então analisada para qualquer formação de p-nitrofenolato usando um espectrofotômetro (Jasco, Halifax, NS, Canadá) em um comprimento de onda de 405 nm. As células que sobraram da placa de cultura original foram usadas em um ensaio MTT para examinar a viabilidade celular após os tratamentos.

2.7. Teste de Irritação da Pele

Para verificar se a aplicação tópica não causaria irritação na pele, um epidérmicotecido mal foi usado para imitar um cenário onde cistanche foi aplicado no nível do tecido. Uma avaliação da irritação epidérmica é um teste fundamental para qualquer dispositivo médico ou produto cosmético, de modo que apenas produtos considerados seguros para a pele sejam fornecidos aos consumidores. Foi relatado que os testes tradicionais em animais não só causam dor e desconforto para os animais de teste, mas tambémesses testes também nem sempre foram representativos dos efeitos observados em humanos; assim, considera-se que o uso de um tecido biônico reconstruído é vantajoso, pois eles possuem vários tipos de células cercadas por um microambiente local, simulando a pele humana in vivo [34]. Os efeitos da cistanche na irritação da pele foram avaliados usando o tecido epidérmico biônico EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante e com experimentos seguindo a metodologia modificada das referências [35–37]. As inserções contendo a amostra EpiDerm foram inseridas em uma placa de 6-poços (Corning, Nova York, NY, EUA) contendo DMEM pré-aquecido. uma quantidade de 100µL DMEM contendo {{0}} (controle negativo) ou 1 mg/mL de cistanche purificado (concentração final de 0,1 mg/mL) foi adicionado ao inserto de cultura celular no topo da amostra EpiDerm. O tecido tratado com dodecil sulfato de sódio (SDS) a 5 por cento serviu como controle positivo. Após 1-h de incubação em um ambiente umidificado de 37◦C, 5 por cento de CO2 incubadora, os insertos foram removidos e lavados duas vezes com PBS (pH 7,4), seguido de colocação em uma placa de 24-poços contendo 300µL de uma solução de MTT 1 mg/mL (em DMEM). Após 3-h de incubação, o isopropanol foi aplicado para dissolver os cristais de MTT formazan. O sobrenadante foi transferido para uma placa de poços 96- e a amostra foi medida a um OD de 570 nm usando espectrofotometria. A viabilidade relativa foi calculada seguindo a equação descrita na Seção2.4. Os produtos químicos são considerados irritantes quando diminuem a viabilidade celular para menos de 50 por cento (Categoria 2), e os produtos químicos que resultam em viabilidade celular superior a 50 por cento são considerados não irritantes (sem categoria) [37]. 

2.8. Síntese de Procolágeno

TesteCélulas Hs68 foram inoculadas em uma 24-placa de poços (2× 105 células/poço) e deixado em repouso durante a noite. As células foram subsequentemente tratadas com um meio de cultura contendo {{0}}, 0,625, 1,25, 2,5, 5 e 10µg/mL extrato de cistanche. O grupo controle positivo foi tratado com 100 ng/mL de fator transformador de crescimento (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) [38,39]. Em seguida, 72-h pós-tratamento, o sobrenadante de cada amostra foi coletado e submetido à detecção de procolágeno. Peptídeo monoclonal anti-humano de procolágeno tipo IC (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japão). (MK101) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante para a detecção de procolágeno. Além disso, o ensaio MTT foi conduzido para avaliar a viabilidade celular após o tratamento.

2.9. Análise estatística

Os dados foram analisados ​​usando o IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, EUA). Primeiro, submetemos os dados de cada grupo ao teste de Kolmogorov-Smirnov para verificar se eles eram normalmente distribuídos ( > 0.05) [40]. estudantet-test foi usado para analisar a viabilidade celular, IL-6, TNF- , -hexosaminidase, tecidos epidérmicos e produção de procolágeno. Todos os dados são apresentados como os meios± desvio padrão (DP), com cada experimento realizado em quintuplicata. Ap-valor < 0.05 foi considerado estatisticamente significativo.