Um estudo comparativo das propriedades e mecanismos antienvelhecimento: resveratrol e restrição calórica Ⅱ

Efeito do resveratrol e CR nas expressões de mRNA de SIRT1, p53 e Foxo3a em tecidos de ratos idosos

Condições de estresse oxidativomuitas vezes induzem a expressão e atividade de SIRT1. SIRT1 modula as funções dos principais fatores de sobrevivência, incluindo p53 e Foxo3a [9]. Para determinar o efeito do resveratrol e CR nos níveis de mRNA de SIRT1, p53 e Foxo3a em ratos com envelhecimento induzido por D-Gal, foram realizados ensaios quantitativos de RT-PCR. Em comparação com o grupo de controle negativo correspondente, os níveis de expressão de mRNA de SIRT1 e Foxo3a diminuíram significativamente, mas o nível de p53 aumentou significativamente no grupo D-Gal (P <0.01; Figura 9A e 9B). Além disso, o tratamento simultâneo de resveratrol ou CR com D-gal em ratos causou um aumento nos níveis de expressões de mRNA de SIRT1 e Foxo3a, mas diminuiu os níveis de p53 em comparação com o grupo de controle modelo (P <0,05). No entanto, em comparação com o tratamento CR, o nível de expressão de mRNA de SIRT1 foi significativamente aumentado em fígados de alta dose de resveratrol mais D-gal, o nível de expressão de p53 mRNA foi significativamente reduzido em fígados e cérebros de alta dose de resveratrol mais D- grupo gal (P <0,05).

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Efeito do resveratrol e CR nas expressões da principal proteína associada à SIRT1-em tecidos cerebrais de ratos idosos

FOXO3a e p53, que são regulados pela SIRT1, são as moléculas a jusante da SIRT1. Simultaneamente, a atividade do SIRT1 é regulada por suas moléculas upstream, por exemplo, DBC1 (também conhecido como KIAA1967), AROS (também conhecido como RPS19BP1) e o supressor de tumor HuR (também conhecido como ELAVL1) [9, 10] . Para determinar o efeito do resveratrol e CR nos níveis de proteína de p53, FOXO3a, HuR, AROS e DBC1 em ratos com envelhecimento induzido por D-Gal, foram realizados ensaios de western blot. Em comparação com o grupo de controle negativo correspondente, os níveis de expressão das proteínas FOXO3a, AROS e HuR diminuíram significativamente, mas os níveis de p53 e DBC1 aumentaram significativamente no grupo D-gal (P <0.01 ; Figura 10). Além disso, o tratamento simultâneo de resveratrol ou CR com D-gal em ratos causou um aumento nas expressões de proteínas de FOXO3a, AROS e HuR, mas diminuiu os níveis de p53 e DBC1 em comparação com o grupo de controle modelo (P < 0,05). No entanto, em comparação com o tratamento CR, o nível de expressão da proteína HuR aumentou significativamente, mas o nível de DBC1 diminuiu significativamente nos cérebros de uma alta dose de resveratrol mais o grupo D-gal (P < 0,05). Não houve diferenças entre o grupo resveratrol mais D-gal e o grupo CR mais D-gal nos níveis de p53, FOXO3a e expressão da proteína AROS (P > 0,05).

Expressões de FOXO3a e p53 em tecidos cerebrais e hepáticos

O estado de expressão de FOXO3a e p53 foi determinado em tecidos cerebrais e hepáticos por imuno-histoquímica. A análise imuno-histoquímica de FOXO3a e p53 revelou que a expressão de FOXO3a nos tecidos do cérebro e do fígado foi significativamente diminuída, e a expressão de p53 foi significativamente aumentada no grupo D-Gal, em comparação com o grupo de controle negativo (P <0.{{13} }5, Figura 11). Além disso, o tratamento simultâneo de resveratrol ou CR com D-gal em ratos causou um aumento na expressão de FOXO3a, mas diminuiu a expressão de p53 em comparação com o grupo de controle modelo (P <0,05). No entanto, não houve diferenças entre o grupo resveratrol mais D-gal e o grupo CR mais D-gal nas expressões de p53 e FOXO3a (P > 0,05).

DISCUSSÃO

O processo químico básico subjacente ao envelhecimento foi desenvolvido pela primeira vez peloteoria dos radicais livres do envelhecimento[11], eestresse oxidativoacredita-se ser um fator primário no processo normal de envelhecimento.Iniciador de radicais livres AAPHestava acostumado ainduzir estresse oxidativoe estabelecer um modelo de oxidaçãosenescência celular induzida por estresseem células IMR humanas-90 [12, 13]. As vantagens deste método são que o AAPH se decompõe termicamente emgerar radicaissem biotransformações ou enzimas, e a taxa degeração radicalpoderia ser facilmente controlado ajustando a concentração do iniciador [12]. O AAPH foi encontradoinibir a proliferação de humanosCélulas IMR- 90 de maneira concentrada e dependente do tempo. Os resultados mostraram que a incubação de 2 dias com AAPH (1 mM) aumentou significativamente a porcentagem de razão SA-Gal positiva, a população de células apoptóticas, reduziu a expressão de mRNA de SIRT1 e induziu uma morfologia aumentada e achatada. Estes indicaram que o estresse oxidativo resultante de AAPH levou as células IMR-90 à senescência. Com base neste modelo de senescência celular, o tratamento com 10 μM de resveratrol inibiu de forma mais eficiente a senescência e apoptose induzida por AAPH do que o tratamento com CR.

O modelo animal D-gal é um modelo animal de envelhecimento reconhecido internacionalmente e tem sido amplamente utilizado no campo damedicamentos anti-envelhecimento. D-gal é um nutriente fisiológico que é normalmente metabolizado por D-galactoquinase e galactose-1-fosfato em animais. No entanto, um excesso de oferta de D-gal, que não é metabolizado pelas enzimas acima, mas se acumula nas células, leva ao estresse oxidativo e ao dano celular [14]. Assim, a administração a longo prazo de D-gal induz alterações que se assemelham ao envelhecimento natural em animais, como redução da expectativa de vida, disfunção cognitiva, neurodegeneração, estresse oxidativo, diminuição das respostas imunes e formação avançada de produtos finais de glicação (AGE) [15]. O presente estudo indicou o estabelecimento bem-sucedido do modelo de envelhecimento mimético, evidenciado por notável aprendizado e comprometimento da memória, produção de MDA, acúmulo de lipofuscina, declínio no T-AOC e SOD e regulação negativa da atividade da telomerase no cérebro. Enquanto isso, os tratamentos com resveratrol ou CR protegeram os ratos induzidos por D-gal contra o estresse oxidativo, elevando a atividade das enzimas antioxidantes, diminuindo os níveis de produtos da peroxidação lipídica e mantendo o equilíbrio dos sistemas oxidativo e antioxidante. Em testes comportamentais e de atividade da telomerase, o tratamento com resveratrol ou CR pode reverter o comprometimento cognitivo induzido por D-gal e a atividade da telomerase. Além disso, ratos modelo de envelhecimento tratados com altas doses de resveratrol mostraram efeito relativamente mais significativo no comportamento do que aqueles tratados com CR.

Figura 11: Análise imuno-histoquímica das expressões de p53 (A, B) e FOXO3a (C, D) em tecidos hepáticos (A, C) e cerebrais (B, D) de ratos idosos. A ampliação foi de 20×. NG, grupo controle negativo; MG, grupo de controle modelo; RESL, grupo baixa dose de resveratrol; RESH, grupo alta dose de resveratrol; CR, grupo de restrição calórica

Estudos demonstraram que a RC, uma redução de 10 a 40 por cento na ingestão de uma dieta nutritiva, poderiaretardar o envelhecimento e aumentar a vida útil, portanto, um nível comumente usado de CR (redução de 40 por cento na ingestão de alimentos) foi aplicado em ratos do grupo CR no presente estudo. No entanto, algumas investigações revelaram que nenhum efeito benéfico de CR na longevidade em primatas naturalmente envelhecidos [16]. Da mesma forma, embora o tratamento com resveratrol tenha demonstrado induzir efeitos do tipo CR emmetabolismo energéticoe perfil metabólico em humanos obesos [17], não melhorou a função metabólica em mulheres não obesas com tolerância normal à glicose [18]. A razão para as diferenças entre esses estudos não é clara, mas pode ser que CR e resveratrol trabalhem para restaurar a homeostase em indivíduos metabolicamente comprometidos, e menos em indivíduos saudáveis, uma possibilidade consistente com funções conhecidas de SIRT1 em estudos com animais [19]. Portanto, modelos de ratos com envelhecimento induzido por D-gal foram aplicados para comparar as atividades antienvelhecimento do resveratrol ou CR , em vez do modelo de ratos naturalmente envelhecidos.

A SIRT1, uma desacetilase dependente de (NAD plus), ganhou muita atenção por causa de seus múltiplos papéis na extensão da expectativa de vida, resistência ao estresse e redução da apoptose [20, 21]. Estudos acumulados implicaram fortemente que SIRT1 era um alvo chave do resveratrol e CR [22]. Há um grande número de moléculas downstream de SIRT1, incluindo p53, Foxo1, Foxo3, Foxo4 e E2F1, que são reguladas por SIRT1. Simultaneamente, a atividade de SIRT1 é regulada por suas moléculas upstream, por exemplo, p53, HIC1, E2F1, DBC1, HuR e AROS. A retirada aguda de nutrientes ativa um programa de transcrição no promotor SIRT1 que é direcionado pelos fatores de transcrição Foxo3a e p53. Como p53 reprime a expressão do gene SIRT1, sua remoção por Foxo3a ativa a transcrição de SIRT1 [23]. DBC1 e AROS foram recentemente descritos como reguladores diretos negativos e positivos da atividade de SIRT1, respectivamente, HuR mostra o efeito de reduzir os níveis de expressão de SIRT1 em células senescentes envelhecidas [9, 10].

CRretarda o envelhecimento e prolonga o tempo de vida médio e máximoem uma variedade de espécies, incluindo ratos, camundongos, peixes, moscas, vermes e leveduras. No entanto, tais programas dietéticos rigorosos em pessoas de vida livre levantaram questões éticas e metodológicas [24]. Atualmente, aumentar o tempo de saúde pode ser mais importante do que simplesmente prolongar o tempo de vida. Investigações recentes sugerem que o resveratrol é um dos instigadores mais potentes da atividade SIR2 entre todos os polifenóis vegetais [25], e influencia a longevidade através de mecanismos semelhantes aos vistos na restrição calórica. Esses resultados mostraram que CR e resveratrol tiveram atividades semelhantes de recuperação dos níveis de expressão do mRNA de SIRT1, aumentando as expressões das proteínas FOXO3a, AROS e HuR e diminuindo os níveis de p53 e DBC1. Enquanto isso, várias linhas de evidências convincentes indicam os efeitos benéficos do resveratrol nos sistemas neurológico, hepático e cardiovascular.

MATERIAIS E MÉTODOS

Cultura de células, estresse e tratamentos

A cepa de fibroblastos diploides humanos IMR-90 foi obtida da ATCC. As células foram cultivadas em meio mínimo essencial (MEM) (Gibco, UK) suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal (FBS) (Gibco) a 37 graus em 5 por cento de CO2. Depois que a confluência foi alcançada, as células foram semeadas em 6-placas de cultura de poços. Um dia depois, as células foram tratadas por 48 h com 1 mM de 2,2'-azobis (2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH) (Sigma, EUA) diluído em MEM mais 10 por cento de FBS. Uma incubação de 48 h com iniciador de radicais livres AAPH estabelece um modelo de senescência celular induzida por estresse oxidativo [12, 13]. As células de controle foram incubadas apenas em meio de cultura. Após o tratamento com AAPH, os IMR-90 foram lavados com tampão fosfato salino frio (PBS) pH 7,4 e incubados com meio de cultura fresco ou meio de cultura contendo resveratrol (grupo resveratrol) ou MEM suplementado com 3% de FBS (grupo CR) por um adicionais 48 h antes da colheita.

Atividade de coloração SA-gal

O aparecimento de biomarcadores de senescência foi verificado (diminuição do potencial proliferativo e aumento da coloração SA-gal) [26] a partir do dia seguinte ao tratamento. Em seguida, as células foram coradas seguindo as instruções do fabricante do SA-gal Staining Kit (CST, EUA). Após a coloração, pelo menos 300 células em vários campos foram examinadas e as células positivas para SA-gal foram contadas. Esses experimentos foram repetidos três vezes e os resultados foram apresentados como valores médios com desvios padrão (DP). Para evitar coloração inespecífica possivelmente devido à confluência celular, a coloração histoquímica SA-gal foi realizada com células subconfluentes.

Análise por microscopia eletrônica de varredura

As células foram cultivadas em lamínulas em 6-placas de cultura bem como descrito acima. Depois que resveratrol e CR foram tratados, as lamínulas foram removidas das placas, então as células foram fixadas em glutaraldeído tamponado com fosfato a 2,5 por cento e pós-fixadas em tetróxido de ósmio tamponado a 1 por cento. Espécimes fixados foram imersos em álcool t-butílico após desidratação por meio de uma série graduada de etanol. As amostras foram liofilizadas a partir de álcool t-butílico, depois revestidas por evaporação com ouro usando um revestidor fino automático (JFC-1600, JEOC, Japão) e examinadas usando um microscópio eletrônico de varredura (JEOL, JSM{{11} } LV, Japão).

Análise apoptótica

Após incubação com resveratrol ou CR, todas as células foram colhidas com tripsina e lavadas duas vezes com PBS, seguidas de ressuspensão em 400 μL de tampão de ligação Anexina V. Em seguida, as células foram coradas seguindo as instruções do fabricante do kit de detecção de apoptose celular Anexina V-FITC (BestBio, China). Um citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA) foi usado para detectar a fluorescência, e a porcentagem de células apoptóticas foi calculada pelo sistema de software interno do FACSCalibur. Aproximadamente 104 células foram analisadas para cada trilha.

procedimentos animais

Ratos Wistar machos albinos, pesando aproximadamente 200 ± 10 g, foram obtidos do Experimental Animal Center do Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (SCXK 2010-0009). Os animais foram aclimatados durante 2 semanas antes da dosagem no Experimental Animal Center da Universidade de Medicina Chinesa de Hubei, período durante o qual tiveram livre acesso a comida e água ad libitum. Após a aclimatação, 50 ratos foram selecionados e divididos em cinco grupos de dez cada. Os animais foram mantidos de acordo com as diretrizes e protocolos nacionais aprovados pelo Comitê Institucional de Ética Animal (IAEC).

Os ratos do Grupo I (grupo de controle negativo) receberam o veículo sozinho (1 mL/kg de peso corporal de 0,9 por cento de solução salina) por 6 semanas. Ratos do grupo II (grupo de controle modelo) receberam D-gal (200 mg/kg de peso corporal, Sigma Chemical, St. Louis, MO) por 6 semanas. Ratos do Grupo III (dose baixa de resveratrol) receberam D-gal e resveratrol (50 mg/kg de peso corporal) dissolvido em 5% de dimetil sulfóxido (DMSO) por 6 semanas. Ratos do grupo IV (grupo alta dose de resveratrol) receberam D-gal e resveratrol (100 mg/kg de peso corporal). Os ratos do Grupo V (grupo CR) receberam D-gal e CR (alimentados com uma dieta 40% menor em calorias do que os ratos alimentados ad libitum [27]) por 6 semanas. D-gal foram administrados por via intraperitoneal, enquanto o resveratrol foi administrado por via oral durante toda a duração do experimento. Os ratos foram sacrificados no último dia de tratamento, então o sangue, soro e órgãos foram imediatamente coletados para bioensaio ou armazenados a -80 graus para uso posterior.

testes comportamentais

O teste do labirinto aquático de Morris foi projetado para avaliar a capacidade de aprendizado espacial e memória dos ratos após 6 semanas após a lesão [28]. O teste do labirinto aquático de Morris consistiu em 4-dia de aprendizado e treinamento de memória e um teste de sondagem no dia 5. Os animais foram treinados em uma piscina circular (155 cm de diâmetro) com dicas visuais. Uma plataforma de escape (9,0 cm de diâmetro) foi submersa 1,0 cm abaixo da superfície da água da piscina, que foi mantida a 25 ± 2 graus. A localização da plataforma permaneceu no centro do quadrante noroeste durante todo o período de treinamento de 4-dia. Em cada dia, os ratos foram treinados para um bloco matinal e um bloco vespertino. O rato nadou livremente até encontrar a plataforma em 120 s. Se falhou, foi colocado na plataforma por 10 s. A latência de escape (encontrar a plataforma de escape submersa) e a velocidade de nado foram registradas. O teste da sonda foi feito removendo a plataforma e permitindo que cada rato nadasse livremente por 120 s dentro da piscina. O número de travessias da plataforma no quadrante treinado (onde a plataforma foi removida) foi registrado com um sistema de vídeo computadorizado. A versão de plataforma visível do labirinto aquático não foi realizada depois que uma diferença significativa na velocidade de natação foi observada entre ratos tratados com D-gal e veículo.

Detecção de indicadores biológicos associados ao estresse oxidativo

Os níveis de MDA, SOD e T-AOC no sangue e tecidos foram determinados fotometricamente de acordo com o protocolo do fabricante usando kits de ensaio enzimático disponíveis comercialmente (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing City, PR China). Todos os experimentos descritos nesta seção foram realizados em triplicata para obter médias e DP.

O nível de lipofuscina foi determinado pelo método de Sohal [29]. Resumidamente, pesamos 200 mg de córtex cerebral, adicionamos 2 ml de extrato de clorofórmio-metanol (2:1), homogeneizamos e filtramos, depois lavamos o resíduo com o extrato, combinamos os filtrados, adicionamos o extrato a 5 ml e mediu a intensidade de fluorescência em um espectrômetro de fluorescência. O comprimento de onda de emissão foi de 435 nm e o comprimento de onda de excitação foi de 365 nm. O espectrofluorímetro foi padronizado para dar uma deflexão de 50 nos comprimentos de onda acima com uma solução de 1 ug/ml de bissulfato de quinino em 0,1 M H2SO4. Os resultados foram expressos como unidades fluorescentes relativas/ml de clorofórmio/g de peso de tecido úmido.

Detecção de atividade TE

Para a extração da telomerase, aproximadamente 30 mg de tecido foram lavados duas vezes em PBS gelado e finalmente homogeneizados em cerca de 150 ml de PBS. A atividade TE foi medida usando kits TE ELISA de acordo com as instruções do fabricante (Nanjing Sen Beijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, China). Os limites de sensibilidade dos ensaios foram de 0,8 UI/L para TE.

análise RT-PCR

Os níveis de expressão de mRNA de SIRT1, Foxo3 e p53 em tecidos hepáticos e cerebrais foram analisados ​​usando análise de RT PCR. O RNA total foi extraído com Trizol, e sua quantidade e pureza foram avaliadas por um ultramicroespectrofotômetro (Thermo Fisher Scientific, EUA) com base na medida de absorbância em 260 e 280 nm. Após a quantificação, o cDNA foi sintetizado usando um kit FastQuant RT (Tiangen Biotech, Pequim, China) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de expressão de SIRT1, Foxo3, p53 mRNA foram medidos por RT-PCR usando TIANGEN SuperReal PreMix Plus (Tiangen Biotech, Pequim, China) com primers específicos (Tabela 2). A PCR quantitativa em tempo real foi realizada com um sistema de PCR LightCycler de 480 graus (Roche, Basel, Suíça) usando 20 μL como o volume total de cada reação. A amplificação por PCR foi iniciada por 15 min de desnaturação a 95 graus , seguida por 40 ciclos de 95 graus por 10 s, 59-63 graus (temperatura de anelamento) por 20 s e 72 graus por 30 s, e uma incubação final a 72 grau por 5 min. O número de limite de ciclo obtido de cada gene (valor Ct) foi normalizado em dobras de mudanças relativas de acordo com a equação do método 2-∆∆CT [30].

Tabela 2: Lista de primers

análise de Western blot

Os níveis de expressão de proteínas de p53, FOXO3a, HuR, RPS19BP1 e DBC1 em tecidos cerebrais foram analisados ​​usando análise de western blotting. A proteína total dos tecidos cerebrais foi extraída usando RIPA Lysis Buffer (Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de proteína foram determinadas usando o BCA Protein Assay Kit (Beyotime, China). 5 mg de proteínas foram separados usando géis de SDS-poliacrilamida a 12% e transferidos para uma membrana de PVDF (00,45 μm, Millipore, EUA). Os blots foram bloqueados com 5 por cento de leite desnatado em TBS, então incubados durante a noite a 4 graus com a diluição apropriada de anticorpos primários: anti-p53 (SC- 6243, Santa Cruz Biotechnology), anti-FOXO3a (#12829, Cell Signaling Technology), anti-HuR (#12582, Cell Signaling Technology), anti-AROS (Ab201091, abcam), anti-DBC1 (#5857, Cell Signaling Technology), anti- - ação (AC004, ABClonal Technology) . Após a lavagem das membranas para remover o excesso de anticorpos primários, as membranas foram incubadas por 1 h em temperatura ambiente com os anticorpos secundários apropriados na diluição de 1:2000-1:5000 (AC004 ou AS003, ABClonal Technology). As membranas foram lavadas 3 vezes e depois visualizadas usando Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific). -ação foi usada como um controle interno.

imuno-histoquímica

As amostras de tecido foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10% dentro de 1 h após a remoção cirúrgica e embebidas em parafina usando procedimentos padrão. Em seguida, as amostras fixadas embebidas em parafina foram cortadas em seções de 5-μm de espessura, que foram desparafinizadas em xileno, reidratadas em etanol e tratadas com micro-ondas para recuperação antigênica. O anticorpo primário adequadamente diluído, anti-p53 (SC-6243, Santa Cruz Biotechnology) e anti-FOXO3a (#12829, Cell Signaling Technology), foram incubados por 60 min em temperatura ambiente em câmara úmida. As lâminas foram então lavadas em PBS e posteriormente incubadas com o anticorpo secundário contra anticorpo anti-coelho e a visualização de HRP (concentração 1:300, #074-1506, KPL). Em seguida, as lâminas foram lavadas e os cortes revelados na solução enzima-substrato diaminobenzidina (DAB, Sigma). Imagens de seções coradas imuno-histoquimicamente foram capturadas pelo microscópio digital Olympus (IX-73P1F, Olympus, Japão).

Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± SD para pelo menos três experimentos independentes e foram analisados ​​usando o software SPSS 18.0. As diferenças de grupo na latência de fuga e na velocidade de nado na tarefa de treinamento do labirinto aquático de Morris foram analisadas usando análise de variância (ANOVA) de duas vias com medidas repetidas, sendo os fatores tratamento e dia de treinamento. Os demais dados foram analisados ​​com ANOVA de uma via seguida de um teste post-hoc de Tukey. O valor de P menor que 0.05 foi considerado significativo.

CONCLUSÕES

O resveratrol e o CR exibiram atividades antienvelhecimento semelhantes in vitro e in vivo, evidenciadas por sua capacidade de inibir a senescência e apoptose induzidas por AAPH e restaurar o comprometimento cognitivo relacionado à idade causado pela administração de D-gal. Seus mecanismos antienvelhecimento incluíram a regulação da atividade TE, diminuição do dano oxidativo e regulação da via SIRT1. No geral, 10 μM de resveratrol in vitro e alta dose de resveratrol in vivo exibiram atividades relativamente mais fortes de antienvelhecimento e estimulando os níveis de SIRT1. Esses resultados implicaram o potencial do resveratrol como um mimético da RC.

Abreviaturas

AAPH, dicloridrato de 2,2'-azobis (2-amidinopropano); AMPK, proteína quinase ativada por monofosfato de adenosina; ANOVA, análise de variância; AROS, regulador ativo da SIRT1; CR, restrição calórica; DBC1, excluído no câncer de mama 1; D-gal, D-galactose; FBS, soro bovino fetal; Foxo3a, caixa de forquilha 3a; HuR, antigénio Hu R; MEM, meio mínimo essencial; PBS, tampão fosfato salino; PGC-1 , coativador G do receptor ativado por proliferador de peroxissoma-1 ; RES, resveratrol; SA-gal, -galactosidase associada à senescência; SD, desvio padrão; SIRT1, regulador de informação silenciadora; TE, telomerase.

Contribuições do autor

Concepção e desenho da pesquisa: Gang Chen; aquisição, análise e interpretação dos dados: Juan Li, Xia Chun Zhang, Yi-Mei Liu; obtenção de financiamento e revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Gang Chen, Ke-Li Chen; redação do manuscrito: Juan Li. Todos os autores leram e aprovaram a publicação deste manuscrito. AGRADECIMENTOS E FINANCIAMENTO

Este trabalho foi financiado pela China Postdoctoral Science Foundation (2016M601237), o projeto Natural Science Foundation (81373704, 30873292).

CONFLITOS DE INTERESSE

Nenhum conflito de interesse de todos os autores participantes.

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