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Atividade antinociceptiva de estolões de salsa Cistanche, crescendo na República do Cazaquistão

Elmira B. Kartbaevaa, et al

ABSTRATO

ErvaCistanche(espécie Cistanche) na Medicina Tradicional Chinesa é utilizada para o tratamento de várias doenças e sintomas, incluindo a dor. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antinociceptivo do hidroetanólicoextrato deCistanchesalsa(CAMey.) Beck, Orobanchaceae, estolões em modelos animais de dor. A composição química deErvaCistanchefoi analisado por HPLC-UV. Camundongos Swiss Webster (25-30 g, n=6) foram pré-tratados oralmente comErvaCistanche(10, 30 ou 100 mg/kg) e avaliados no teste de formalina e na resposta de lambida induzida por capsaicina ou glutamato. cazaqueErva Cistancheé composto principalmente de glicosídeos fenilpropanóides, dos quaisechinacoside, acteósido, etubulósidoB são os principais constituintes. QuandoErvaCistanchefoi administrado a camundongos, teve efeito em ambas as fases do teste de formalina (77 por cento de atividade a 30 mg/kg para a fase 1 e 62 por cento de atividade a 100 mg/kg para a fase 2), sugerindo propriedades analgésicas e anti-inflamatórias. cazaqueErvaCistanchefoi capaz de reduzir o tempo de lambida dos animais após a injeção de glutamato (redução de 81 por cento a 30 mg/kg) e capsaicina (redução de 81 por cento a 100 mg/kg). Concluímos que os fenólicos presentes no extrato hidroetanólico de C. salsa podem ser responsáveis ​​pelo seu perfil farmacológico. A fim de obter uma matéria-prima de boa qualidade para a Medicina Tradicional Chinesa, recomendamos que esta espécie do Cazaquistão seja padronizada usandoechinacoside e acteósidocomo marcadores.

Palavras-chave:Herba Cistanche,HPLC-UV,Echinacoside, Acteoside, Tubuloside, Estandardização

Introdução

Cistanchesalsa(CA Mey) Beck, Orobanchaceae, é uma planta parasita da República do Cazaquistão, onde é utilizada como matéria-prima industrial (Sarsenbayev et al., 2011; Grudzinskaya e Gemedzhieva, 2012). O valor científico desta erva na Medicina Tradicional Chinesa está relacionado ao tratamento de problemas renais (variando de dor a insuficiência), impotência, infertilidade feminina, leucorréia mórbida, metrorragia profusa e constipação senil (Jiangsu New Medical College Dictionary of Traditional ChineseDrugs, 1977; Ervas Medicinais Chinesas, 1988). A composição química dos estolões de outras espécies deCistanchejá foi estudado em detalhes por cientistas chineses. Os seguintes compostos fenólicos foram identificados:echinacoside, tubulósido, acteósido, além de lignanas, iridóides e um polissacarídeo complexo (Yong e Tu, 2009; Zhang et al., 2003; Xie et al., 2005; Jiang et al., 2009; Suiet al., 2011; Liu et al., 2013; Zhou et al., 2014).

Shimoda et ai. (2009) mostraram que esta erva possui um efeito hipocolesterolêmico enquanto Yang et al. (2013) determinaram sua atividade hepatoprotetora. Nan et ai. (2013) relataram a atividade anti-inflamatória para seus extratos. Um complexo polissacarídeo previamente isolado desta planta apresentou efeitos imunomoduladores (Wang et al., 2009).

Embora haja uma quantidade considerável deCistanchestolons na República do Cazaquistão, não há uso popular para esta planta pela população cazaque, embora os vizinhos da China a usem extensivamente. Devido ao fato de que atualmente existe um problema considerável em relação à substituição/adulteração de plantas medicinais e a crescente necessidade de padronização de medicamentos para uso na Medicina Tradicional Chinesa, este estudo foi desenvolvido para verificar a composição química fenólica desta matéria-prima vegetal cultivada no vizinho Cazaquistão bem como avaliar seu uso como antinociceptivo para potencial alívio da dor – o que caracteriza um de seus principais usos na Medicina Tradicional Chinesa.

Materiais e métodos

Material vegetal

Cistanchesalsa (CAMey.) Beck, Orobanchaceae, estolões foram coletados no deserto de Moinkum, Aldeia de Bakanas, em julho de 2014 em Almaty. O material vegetal foi identificado pelo Dr. G. Sitpayeva do Instituto de Botânica e Fitointrodução, Ministério da Educação e Ciências da República do Cazaquistão, onde foi depositado sob o número 01-04/306.

Análises químicas

Estolhos de C. salsa (2 g) foram submetidos à extração por micro-ondas. Inicialmente, o material foi moído até 0.001–2.000 mm e, em seguida, colocado em um recipiente hermético para ser extraído por 10 min. at100–1100 ◦C com etanol 80 por cento (proporção 1:10). O extrato hidroetanólico (CSHE) foi analisado por HPLC-MS. O extrato bruto foi dissolvido em metanol (9,6 mg/ml) e filtrado através de uma membrana de 0,45 mm de Teflon antes da análise. Um cromatógrafo líquido modelo HP 1100 Series (empresa Agilent Technologies, Inc., CA, EUA), equipado com um desgaseificador a vácuo de fluxo, uma bomba de gradiente de baixa pressão de quatro canais e um injetor automático. Os compostos fenólicos foram separados cromatograficamente por uma coluna Zorbax Eclipse XDB-C18, 2,1 × 50 mm, preenchida com polímero de octadecilsilil sílica gel (1,8). A análise cromatográfica foi realizada com um fluxo de fase móvel de 0,2 ml/min, pressão de operação do eluente de 175–200 kPa, temperatura do forno da coluna de 30 ◦C, volume de amostra de 2 ml, modo de alimentação do eluente gradiente: 0–36 min 10 por cento A – 90 por cento B; 36 min – 100 por cento B (eluente A: metanol, eluente B: solução de ácido fórmico a 0,2 por cento). A detecção foi realizada por UV nos comprimentos de onda de 254, 334, 350, 410, 450 e 550 nm. A comparação dos tempos de retenção, espectros UV e de massa obtidos com os compostos de referência foi utilizada para a identificação dos compostos químicos no extrato. A análise quantitativa foi realizada pelo uso de padrõesverbascosideeechinacosideanalisadas nas mesmas condições cromatográficas. Suas curvas de calibração permitiram o cálculo da quantidade de glicosídeo fenilpropanoide um do outro no extrato etanólico desta planta. O método não foi validado.

Animais

Camundongos Swiss Webster (20–25 g, dois meses de idade) foram usados ​​neste estudo (doados pelo Instituto Vital Brazil, Niterói, RJ, Brasil). Os animais foram mantidos em condições padrão (ciclo claro-escuro de 12 h, 22 ± 2 graus e 70-80 por cento de umidade. Comida e água ad libitum). Os animais receberam apenas água para evitar a interferência do alimento na absorção da substância 12 h antes do início dos experimentos. A aclimatação às condições do laboratório ocorreu por pelo menos 1 hora antes de cada teste. Todos os protocolos foram conduzidos de acordo com as Diretrizes de Normas Éticas para Investigação da Dor Experimental em Animais e seguiram os princípios e diretrizes adotados pelo Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA), aprovados pelo Instituto de Ciências Biomédicas/UFRJ, Ética Committee for Animal Research e recebeu o número DFBCICB{10}}/16. Todos os protocolos experimentais foram realizados durante a fase de luz. O número de animais por grupo foi mantido no mínimo e de acordo com as normas do CONCEA. Ao final de cada experimento, os camundongos foram mortos por overdose de cetamina/xilazina.

Tratamentos

Neste estudo, a CSHE foi avaliada em 10, 30 e 100 mg/kg. O extrato foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO, FisherBiotech) para preparar uma solução estoque a 100 mg/ml. O PBS foi utilizado como diluente para o preparo das diferentes doses. Soluções contendo 10, 30 e 100 mg/kg do extrato hidroetanólico deCistanchesalsaestavam preparados. As drogas padrão utilizadas foram morfina 2,5 mg/kg (Merck, diluída em solução salina tampão fosfato (PBS)), ácido acetilsalicílico 200 mg/kg (Sigma Aldrich, dissolvido com 5 M de hidróxido de sódio (NaOH) em 0,9 por cento salina) e capsazepina 10 nMolper na pata. Solução salina mais DMSO (na mesma concentração do tratamento mais alto com extrato) foi administrada ao grupo controle negativo. Todos os tratamentos (extrato testado e padrões) foram administrados por via oral. A única exceção foi a capsazepina que foi administrada por injeção intraplantar.

Dor aguda induzida por formalina

Uma solução de formalina a 2,5 por cento (formaldeído a 37 por cento) foi injetada (20 ul) na região plantar da pata traseira direita de camundongos 60 minutos após o tratamento (extrato hidroetanólico deCistanchesalsaou ácido acetilsalicílico 200 mg/kg ou morfina 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Os animais foram colocados individualmente em uma câmara de vidro transparente e a duração do tempo em segundos que eles passaram lambendo a pata após a injeção de formalina foi registrada e analisada em dois períodos separados, dor neurogênica de fase inicial (0-5 min após a injeção) e fase tardia. dor inflamatória (15-30 min após a injeção).

Nocicepção induzida pela capsaicina

Este teste foi baseado no método descrito por Sakurada et al. com algumas modificações (Sakurada et al., 1992). Capsaicina (20 ul)C18H27NO3 (Galena, Campinas, SP) foi injetada na região plantar da pata traseira direita dos camundongos (1,6 ug/pata) uma hora após o tratamento (extrato hidroetanólico deCistanchesalsa ou capsazepina10 nMol/pata). Os animais foram colocados individualmente em uma câmara de vidro e a duração da lambida da pata foi registrada entre 0 e 5 min após a injeção de capsaicina e então analisada.

Nocicepção induzida por glutamato

No método descrito por Beirith et al. (2002), solução de glutamato em PBS (20 ul) (ácido l-glutâmico, Sigma–Aldrich, 3,7 ng/pata) foi injetada na região plantar da pata traseira direita dos camundongos uma hora após o tratamento (extrato hidroetanólico deCistanchesalsa ou morfina 2,5 mg/kg). Os animais foram colocados individualmente em uma câmara de vidro e a duração da lambida da pata (segundos) foi registrada entre 0 e 15 min após a injeção de glutamato e então analisada.

Análise estatística

Os dados químicos são apresentados como média ± SD de cinco experimentos. Todos os grupos experimentais farmacológicos consistiram de no mínimo seis camundongos. A análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida do teste de Dunnett permitiu a visualização da significância estatística entre os grupos utilizando o software GraphPad Prism 5.0. os valores de p foram considerados significativos quando menores que 0.05(p <>

Resultados

CistancheO cromatograma do extrato hidroetanólico de salsa (duas diluições diferentes) é mostrado na Fig. 1. A Tabela 1 mostra a determinação dos compostos fenólicos juntamente com seus respectivos tempos de retenção no cromatograma.

Efeito do CSHE na dor aguda induzida por formalina

No teste de dor aguda induzida por formalina, os CSHE a 10, 30 e 100 mg/kg foram capazes de diminuir a lambida da pata na primeira fase do teste conhecida como fase de dor neurogênica, essas reduções foram de 60, 77 e 58 por cento, respectivamente . Além disso, também foram eficazes na redução da dor inflamatória induzida durante a segunda fase do teste, o percentual de inibição da dor inflamatória foi de 42, 46 e 62 por cento, respectivamente (fig. 2). A morfina (2,5 mg/kg) e o ácido acetilsalicílico (200 mg/kg) apresentaram os seguintes resultados: 55 por cento /33 por cento e 31 por cento /54 por cento para a primeira e segunda fases, respectivamente.

Efeito de CSHE na nocicepção induzida por glutamato

O CSHE reduziu a lambedura induzida pelo glutamato nas três doses testadas, 10, 30 e 100 mg/kg em 76, 81 e 53 por cento, respectivamente (Fig. 3). A morfina a 2,5% resultou em uma redução de 76%

Efeito de CSHE na nocicepção induzida por capsaicina

Para verificar se o CSHE afetaria a nocicepção através dos receptores TRPV1, foi testado em um modelo de dor induzida por capsaicina. O efeito antinociceptivo através deste modelo foi observado para o CSHE nas três doses testadas, em 76, 79 e 81 por cento, respectivamente (Fig. 4). Capsazepina 10 nMol/pata resultou em uma redução de 60 por cento.

Discussão

Um total de dez glicosídeos fenilpropanóides foram identificados no extrato hidroetanólico de C. salsa (que cresce no Cazaquistão).Echinacoside(10,98 mg/g),acteósido(9,44 mg/g) e tubulósido B (7,94 mg/g) foram os principais compostos identificados. Os dados obtidos foram correlacionados com a literatura disponível para espécies deCistanchecrescendo em diferentes regiões da Ásia (Zhou et al., 2014; Xieet al., 2005; Jiang et al., 2009).Echinacosideeacteósidosão os principais componentes, que formam a base para a padronização das espécies oficiaisCistanchedeserticola eCistanchetubulosa, listado na Farmacopeia Chinesa em 2005. Propomos que esses compostos também possam ser usados ​​para a padronização deCistancheestolões de salsa do Cazaquistão, pois são os principais no extrato hidroetanol estudado.

De acordo com os resultados farmacológicos deste estudo, é possível sugerir que o CSHE é um agente eficaz contra a dor e inflamação neurogênica observada no teste da formalina. Para o melhor de nosso conhecimento,Cistanchea salsa nunca foi testada em relação às suas ações antinociceptivas. Um estudo de 2002 comCistanchedeserticola (Lin et al., 2002) demonstrou que esta planta apresentou atividades antinociceptiva e anti-inflamatória quando testada em modelos como contorções totais, formalina e edema de pata. Embora não tenha havido tentativa de investigar os principais constituintes dos extratos ativos, eles consideraram o extrato butanol e a camada d'água como ativos. Não surpreendentemente, esses solventes estão na escala de polaridade que combina com os glicosídeos fenilpropanóides encontrados emCistanchesalsa. Além disso, Lin e colaboradores estabeleceram que a ação antinociceptiva daCistanchedeserticola não foi devido à ação do composto no receptor opiáceo ou relacionado ao sistema imunológico. Em nosso estudo, o extrato rico em fenilpropanóides apresentou atividade em ambas as fases do teste da formalina. A atividade observada deveu-se, de fato, ao alvo farmacológico investigado e não a qualquer possível alteração motora evidenciada pelo teste do therotarod. Os resultados do teste de formalina indicam o potencial para dor neurogênica, bem como a dor induzida por mediadores inflamatórios. Inicialmente, decidimos investigar a via da dor neurogênica. Como compostos semelhantes de outras espécies estudadas anteriormente não apresentaram atividade de receptor opiáceo, decidimos testar outros modelos, como modelos de Glutamato e capsaicina.

O glutamato é um neurotransmissor excitatório que tem um papel importante na modulação da dor em todo o sistema nervoso periférico e central. Essa ação é mediada por receptores de glutamato ionotrópicos controlados por ligantes (iGluRs) e receptores de glutamato metabotrópicos. Os iGluRs podem ser divididos em N-metil-d-aspartato(NMDA) e -amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-ácido propiônico (AMPA) (Kolber, 2015). A pesquisa mostrou que ao antagonizar os receptores NMDA e AMPA com cetamina e cainato, respectivamente, são observados efeitos antinociceptivos. No entanto, os antagonistas direcionados a esses receptores até agora induziram um efeito adverso substancial e, por esse motivo, novas pesquisas se concentram no mGluRshoping de que o medicamento mediado por esse receptor causaria menos efeitos colaterais (Palazzo et al., 2014). Os resultados do teste do CSHE mostraram que este tratamento foi eficaz na redução da dor induzida pelo glutamato. No entanto, ainda não se sabe se esse efeito é mediado por receptores ionotrópicos e/ou metabotrópicos. A morfina é uma das drogas disponíveis que tem efeito na transmissão glutamatérgica (Deyama et al., 2007). É relatado na literatura que a ativação do receptor de glutamato aumenta as respostas do TRPV1 (Szteyn et al., 2015). Por essa razão, é possível que o efeito observado para CSHE possa ser devido à atividade no TRPV1 e não necessariamente por uma resposta direta nos receptores de glutamato.

O próximo passo desta pesquisa foi realizar um teste de lamber a pata utilizando capsaicina como agente analgésico, que é um agonista do receptor TRPV1. Os resultados mostraram que, de fato, o CSHE diminuiu a dor através do receptor TRPV1.

No caso da CSHE, em quase todas as metodologias testadas, pudemos observar que a dose de 30 mg/kg obteve resultados melhores que 100 mg/kg. Isso pode ser devido à saturação da solução levando a compostos precipitados e efetivamente menos quantidade de drogas sendo biodisponíveis.

Confirmar a composição química estabelecida para o extrato cazaque CSHE foi um passo importante, pois os principais constituintes presentes nele já tiveram suas ações antinociceptivas/anti-inflamatórias de alguma forma confirmadas.echinacosidefoi estabelecido como um dos princípios ativos responsáveis ​​pela ação antinociceptiva da Echinacea (Hostettmann, 2003). Além disso, um estudo anterior de Schapoval e colaboradores (Schapoval et al., 1998) apontouacteósidocomo um dos principais princípios ativos em um extrato etanólico preparado com Stachytarpheta cayennensis avaliado por modelos de edema de pata e placa quente. Backhouse e colegas de trabalho (Backhouse et al., 2008) também consideraramacteósidoser o princípio ativo de Buddleja globosausando vários modelos de avaliação da dor, incluindo teste de formalina. Novas formulações estão sendo desenvolvidas usando o conhecimento de ponta para aumentar a estabilidade e prolongar a ação antinociceptivaacteósido(Isacchi et al., 2016).

Conclusão

Dez substâncias de natureza fenólica foram identificadas nos estolões do CazaquistãoCistanchesalsa por análise HPLC/MS. Esses compostos podem ser responsáveis ​​pela atividade antinociceptiva observada nos modelos experimentais aqui realizados. Levando em consideraçãoque no território do Cazaquistão o gêneroCistancheé representado principalmente por espéciesCistanchesalsa, podemos recomendar sua colheita e padronização usandoechinacosideeacteósidocomo compostos padrão, para obter uma matéria-prima de boa qualidade para a Medicina Tradicional Chinesa.

Divulgações éticas

Proteção de seres humanos e animais. Os autores declaram que os procedimentos seguidos estavam de acordo com os regulamentos do comitê de ética em pesquisa clínica relevante e com os do Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque).

Confidencialidade dos dados.

Os autores declaram que nenhum dado do paciente aparece neste artigo.

Direito à privacidade e consentimento informado. Os autores declaram que nenhum dado do paciente aparece neste artigo.

Contribuições dos autores

A EBK executou a coleta da planta, preparação do extrato e análise dos resultados químicos, bem como a redação do artigo; GRD, executou todos os testes farmacológicos; ZBS, desenhou o estudo em conjunto com FB; LNI e ENB, participaram do desenho farmacopeico do estudo para inclusão dos resultados obtidos na farmacopeia cazaque; IIT, executou as análises de HPLC; PDF, desenhou o estudo farmacológico e FB, organizaram a equipe para escrever este artigo.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Reconhecimentos

Os autores do Brasil agradecem ao Sr Alan Minho pela assistência técnica e ao Instituto Vital Brazil pelas doações dos animais utilizados. Eles também querem agradecer as bolsas do CNPq e da Fundação Carlos Chagas Filho de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro. Os autores da Irlanda desejam agradecer ao Programa de Pesquisa em Instituições de Terceiro Nível do Ciclo 5 da Autoridade de Ensino Superior pelo apoio financeiro ao TBSI e reforçar a importância do programa SFI ISCA-Brasil (grantno. SFI/13/ISCA/2843) que contribuiu para a trabalho colaborativo entre Brasil e Irlanda. Os autores do Cazaquistão agradecem à KazNMU pelo apoio financeiro permitido para a execução deste trabalho.

De: 'Atividade antinociceptiva de estolões de salsa Cistanche, crescendo na República do Cazaquistão' por Elmira B. Kartbaevaa, et al

---EB Kartbaeva et al. / Revista Brasileira de Farmacognosia 27 (2017) 587–591

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