Polissacarídeo Cistanche Deserticola Atenua Osteoclastogênese e Reabsorção Óssea Via Inibição da Sinalização RANKL e Produção de Espécies Reativas de Oxigênio

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Dezhi Song e outros

A osteoporose é uma doença metabólica caracterizada por osteopenia e deterioração da microestrutura óssea. Os osteoclastos são as células efetoras primárias que degradam a matriz óssea e sua função anormal leva ao desenvolvimento da osteoporose. O acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs) durante o metabolismo celular promove a proliferação e diferenciação de osteoclastos, portanto, desempenhando um papel importante na osteoporose.Cistanchedeserticolapolissacarideo(CDP) possui atividade antitumoral, anti-inflamatória e antioxidante. No entanto, o impacto da CDP nos osteoclastos não é claro. Neste estudo, coloração com fosfatase ácida resistente ao tartarato, imunofluorescência, reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa e análise de Western blot foram utilizados para demonstrar que a CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)inibiu a osteoclastogênese e a reabsorção de hidroxiapatita. Além disso, o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)também inibiu a expressão de genes marcadores de osteoclastos, incluindo Ctsk, Mmp9 e Acp5, e não teve efeito sobre a expressão do ativador do receptor do fator nuclear κB (RANK). Análises mecanísticas revelaram que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)aumenta a expressão de enzimas antioxidantes para atenuar a produção de ROS mediada por RANKL em osteoclastos e inibe o fator nuclear de células T ativadas e a ativação da proteína quinase ativada por mitógeno. Esses resultados sugerem que a CDP pode representar uma droga candidata para o tratamento da osteoporose causada pela atividade excessiva dos osteoclastos.

PALAVRAS-CHAVEreabsorção óssea,Cistanchedeserticolapolissacarídeo, MAPK, osteoclasto, espécies reativas de oxigênio

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1|INTRODUÇÃO

O equilíbrio entre a formação óssea, mediada pelos osteoblastos, e a reabsorção óssea, mediada pelos osteoclastos, desempenha um papel vital na manutenção da homeostase metabólica óssea (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Quando a reabsorção óssea excede a formação óssea, ocorre a osteoporose, que é caracterizada pela redução da massa óssea e dano microestrutural ósseo (Ikeda, 2008). A osteoporose é uma doença comum em idosos e mulheres na pós-menopausa e sua patogênese não foi totalmente elucidada (Cooper & Melton, 1992). A deficiência de estrogênio é a principal causa de osteoporose (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Além disso, as espécies reativas de oxigênio (ROS) podem ser induzidas pelo receptor ativador do ligante do fator nuclear κB (RANKL) e estão associadas à formação de osteoclastos (Yip et al., 2005), podendo assim contribuir para o desenvolvimento da osteoporose (Manolagas, 2010). Alguns estudos descobriram que a deficiência de antioxidantes Nrf2 aumenta os níveis de ROS e promove a diferenciação de osteoclastos induzida por RANKL (Hyeon, Lee, Yang e Jeong, 2013). Portanto, a redução da produção de ROS durante a diferenciação dos osteoclastos deve ser avaliada como uma estratégia terapêutica para o tratamento da osteoporose.

Os osteoclastos são derivados da linhagem hematopoiética de monócitos ou macrófagos e são as únicas células multinucleadas que realizam reabsorção óssea (Teitelbaum, 2000). Portanto, pesquisas envolvendo a formação de osteoclastos são de grande importância no desenvolvimento de tratamentos eficazes para doenças do metabolismo ósseo (Lorenzo, 2017). O fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e RANKL, produzidos por osteoblastos e células T ativadas, são citocinas importantes que regulam a osteoclastogênese (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL induz a expressão do fator nuclear de células T ativadas (NFATc1), que é um fator crítico de transcrição ativo durante a formação de osteoclastos (Ishida et al., 2002). O NFATc1 ativado promove a expressão de genes marcadores de osteoclastos, como a fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAcP) e a catepsina K (CTSK) que regulam a osteoclastogênese e a função dos osteoclastos (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolissacarideo(CDP) é isolado dos caules carnosos deCistanchee possui regulação imunológica, antitumoral, antienvelhecimento e outros efeitos farmacológicos (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)teve um efeito inibitório na produção de óxido nítrico (NO) induzida por lipopolissacarídeos em células microgliais de camundongo (células BV-2; Nan et al., 2013). Além disso, um extrato rico em feniletanoides (ECD) deCistancheaumentou a capacidade de natação de camundongos, diminuindo o dano muscular, retardando o acúmulo de ácido lático e melhorando o armazenamento de energia (Cai et al., 2010). No entanto, os efeitos da CDP na função e atividade dos osteoclastos permanecem desconhecidos.

Neste estudo, demonstramos que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)inibe a diferenciação de osteoclastos induzida por RANKL e a reabsorção óssea. O mecanismo subjacente era que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)aumenta a expressão de enzimas antioxidantes para atenuar a produção de ROS e, em seguida, suprime as cascatas de sinalização do NFAT ativado por RANKL e da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK). Esses resultados sugerem que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)pode ser usado para tratar a osteoporose causada por reabsorção óssea osteoclástica excessiva.

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2|MATERIAIS E MÉTODOS

2.1|Materiais

CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)(pureza > 98 por cento) foi adquirido da Solarbio (Pequim, China) e preparado em uma concentração de estoque de 1 mM em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Os anticorpos são específicos para c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforilado (p)-ERK, p-p38, p-JNK e ‐actina foram obtidos de Santa Cruz Biotecnologia (San Jose, CA). Anticorpos para V-ATPase d2 foram produzidos como descrito anteriormente (H. Feng et al., 2009). O 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (MTS) e o sistema de ensaio de luciferase foram obtidos da Promega (Sydney, Austrália) . O M-CSF recombinante foi adquirido da R&D Systems (Minneapolis, MN). A proteína GST-rRANKL recombinante foi expressa e purificada como descrito anteriormente (Xu et al., 2000).

2.2|Cultura de células

As células RAW264.7 (células de macrófagos de camundongo) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas em meio essencial mínimo modificado (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Austrália) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina (meio completo). Monócitos derivados da medula óssea (BMMs) foram isolados de camundongos C57BL/6J de 6 semanas de idade, que foram sacrificados de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade da Austrália Ocidental (RA/3/100/1244). Os ossos longos foram dissecados livres de tecidos moles e a medula óssea foi lavada do fêmur e da tíbia, que foi então cultivada em meio completo na presença de M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Ensaio de osteoclastogênese

As BMMs foram semeadas em placas de cultura de 96 poços a uma densidade de 6 × 103 células por poço e tratadas com um meio completo contendo M-CSF (50 ng/ml) e GST-rRANKL (100 ng/ml), na presença ou ausência de concentrações variadas de CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>três núcleos) foram identificados como osteoclastos.

2.4|Ensaios de citotoxicidade

Os BMMs foram semeados em placas de 96 poços a 6 × 103 células por poço e deixados durante a noite para aderir. No dia seguinte, as células foram incubadas com concentrações variadas de CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo). Após mais 48 horas, a solução de MTS (20 µl/poço) foi adicionada e incubada com células por 2 horas. A absorbância a 490 nm foi determinada com um leitor de microplacas (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Coloração imunofluorescente

Os BMMs foram semeados a uma densidade de 6 × 103 células por poço na presença de M-CSF (50 ng/ml) durante a noite. As células foram então estimuladas com M-CSF e GST-rRANKL (100 ng/ml) até a formação de osteoclastos maduros. Os osteoclastos foram então tratados com concentrações variadas de CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)por 48 horas antes de fixar com 4% de paraformaldeído, permeabilizando com 0.1% Triton X-100-PBS e bloqueando com 3% de albumina de soro bovino em PBS. As células preparadas foram incubadas com faloidina conjugada com rodamina por 45 min no escuro para corar para F-actina. As células foram então lavadas com PBS, os núcleos contrastados com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e montados com lamínulas para microscopia confocal.

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2.6|Ensaio de reabsorção de hidroxiapatita

Para medir a atividade dos osteoclastos, BMMs (1 × 105 células por poço) cultivados em placas revestidas com colágeno de seis poços (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) foram estimulados com GST-rRANKL (100 ng/ml) e M-CSF (50 ng/ml) ml) até que os osteoclastos maduros fossem gerados (Zhou et al., 2016). As células foram então suavemente separadas da placa usando solução de dissociação celular (Sigma-Aldrich) e números iguais de osteoclastos maduros foram semeados em poços individuais em placas de 96 poços revestidas com hidroxiapatita (Corning Osteoassay, Corning, NY). Osteoclastos maduros foram incubados em meio contendo GST-rRANKL e M-CSF com ou sem CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)nas concentraes indicadas. Após 48 h, metade dos poços foi corada imuno-histoquimicamente para atividade de TRAcP, conforme descrito acima, para avaliar o número de células multinucleadas por poço. Os poços restantes foram branqueados por 10 min para remover as células e permitir a medição das áreas reabsorvidas. As áreas reabsorvidas foram fotografadas sob microscopia de luz padrão e o software Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) foi usado para quantificar a porcentagem de área de superfície de hidroxiapatita reabsorvida pelos osteoclastos.

2.7|Ensaios de repórter de luciferase

Para investigar a ativação transcricional de NFATc1, as células RAW264.7 foram transfectadas de forma estável com um construto repórter de luciferase responsivo a NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). As células transfectadas foram cultivadas em placas de 48 poços a uma densidade de 1,5 × 105 células por poço e pré-tratadas com várias concentrações de CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)por 1h. Após o pré-tratamento, as células foram estimuladas com GST-rRANKL (100 ng/ml) por 24 horas e a atividade da luciferase foi medida usando o sistema de ensaio repórter de luciferase de acordo com o protocolo do fabricante (Promega).

2.8|Análise quantitativa de transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR)

O RNA total foi isolado das células usando o reagente Trizol de acordo com o protocolo do fabricante (Thermo Fisher Scientific). O DNA complementar foi sintetizado usando a transcriptase reversa do vírus da leucemia murina Moloney com 1 ug de molde de RNA e primers oligo-dT. A amplificação da reação em cadeia da polimerase de sequências específicas foi realizada usando o seguinte programa: 94 graus por 5 min, seguido por 30 ciclos de 94 graus por 40 s, 60 graus por 40 s e 72 graus por 40 s, e uma etapa final de extensão de 5 minutos a 72 graus. As informações detalhadas de primers específicos são mostradas na Tabela 1. Os níveis relativos de RNA mensageiro foram calculados por normalização para a expressão do gene housekeeping Hmbs.

2.9|Análise de Western Blot

As BMMs foram cultivadas em meio completo com M-CSF em placas de seis poços e estimuladas com GST-rRANKL (100 ng/ml) pelos tempos indicados. As células foram lisadas em tampão de lise de radioimunoprecipitação e as proteínas foram resolvidas por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida e transferidas para membranas de poli(fluoreto de vinilideno) (GE Healthcare, Silverwater, Austrália). As membranas foram bloqueadas em 5 por cento de leite desnatado por 1 hora e então sondadas com vários anticorpos primários específicos com agitação suave durante a noite a 4 graus. As membranas foram lavadas e subsequentemente incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. A reatividade do anticorpo foi então detectada com reagente de quimioluminescência aprimorado (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) e visualizado com um Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Detecção de ROS intracelular

Os níveis intracelulares de ROS foram detectados usando um kit de ensaio de detecção de ROS celular com diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (Abcam, Melbourne, Austrália). BMMs (5 × 103 células por poço) foram cultivadas em placas de 96 poços e tratadas com RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) e CDP por 72 horas. Os níveis intracelulares de ROS foram medidos usando diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína, que oxida em DCF fluorescente na presença de ROS. As células foram lavadas em tampão de Hank e incubadas no escuro por 30 min com 10 µM de DCFH-DA. As imagens foram obtidas por microscopia confocal.

2.11|análise estatística

Todos os dados são representativos de pelo menos três experiências realizadas em triplicado, salvo indicação em contrário. Os dados são expressos como média ± DP. Análise de variância unidirecional seguida de testes post hoc de Student–Newman–Keuls foram usados ​​para determinar a significância das diferenças entre os resultados, com p < 0,05="" considerado="">

3|RESULTADOS

3.1|CDP inibe a osteoclastogênese induzida por RANKL e a fusão de osteoclastos

Para determinar se o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)pode suprimir a formação de osteoclastos induzida por RANKL, primeiro realizamos um ensaio de osteoclastogênese usando BMMs de camundongo (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMMs foram tratados com RANKL e M-CSF por 5 dias com concentrações crescentes de CDP. CDP reduziu o número de células multinucleadas positivas para TRAcP quando a concentração de CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)atingiu 5 µM ou superior (Figura 1a,b). Para avaliar o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)toxicidade e confirmar que esses resultados não foram um reflexo da morte celular ou número, realizamos um ensaio MTS. BMMs foram tratados com RANKL e M-CSF por 48 horas com diferentes dosagens de CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo). CDP não teve efeito na proliferação de BMM na concentração de 15 µM ou menos (Figura 1c).

Para testar os efeitos do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)na fusão dos osteoclastos, os osteoclastos foram induzidos com tratamento RANKL e M-CSF, com ou sem doses variadas de CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo). Os osteoclastos foram corados com rodamina-faloidina e DAPI para avaliar o número de núcleos por osteoclasto (Figura 2a). Tanto o número de osteoclastos quanto o número médio de núcleos por osteoclasto diminuíram após o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)tratamento (5-10 µM; Figura 2b,c). Portanto, o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)teve efeitos inibitórios na osteoclastogênese induzida por RANKL e na fusão de osteoclastos de maneira dose-dependente.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)atenua a atividade de reabsorção de hidroxiapatita osteoclástica induzida por RANKL

Um ensaio de reabsorção de hidroxiapatita foi realizado para detectar o efeito da CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)na função dos osteoclastos (Figura 3a). Após uma incubação de 24 horas, o número de osteoclastos por poço não mudou, enquanto a área de reabsorção de hidroxiapatita foi significativamente diminuída pelo tratamento com 5 e 10 µM de CDP quando comparado aos grupos de controle (Figura 3b,c). Esses resultados demonstram que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)tem fortes efeitos inibitórios tanto na formação de osteoclastos como na atividade de reabsorção de osteoclastos sem quaisquer efeitos citotóxicos.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)inibe a expressão do gene marcador de osteoclastos

Para investigar ainda mais os efeitos inibitórios da CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)na osteoclastogênese e reabsorção óssea osteoclástica, os BMMs foram tratados com RANKL e M-CSF por 5 dias com concentrações variadas de CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo). A RT-PCR foi então realizada para detectar a expressão de genes marcadores de osteoclastos. A expressão de Nfatc1, um fator de transcrição crucial durante a osteoclastogênese, foi inibida por CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)dose-dependente (Figura 4a). Além disso, o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)(5 e 10 µM) reduziram a expressão de genes relacionados à reabsorção óssea, incluindo Mmp9, Ctsk e Acp5 (Figura 4b–d).

3.4|CDP suprime a atividade de NFATc1 e a expressão de proteínas a jusante

Para examinar o efeito do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)na atividade de NFATc1 induzida por RANKL, foi realizado um ensaio de repórter de luciferase. Tratamento com CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo), em concentrações de 5 µM e superiores, inibiu significativamente a atividade de NFATc1 induzida por RANKL (Figura 5a). Além disso, a análise de Western Blot mostrou que a CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)suprimiu significativamente a expressão proteica de NFATc1 e c-Fos em BMMs tratados com RANKL e M-CSF por 3 e 5 dias (Figura 5b). Além disso, a expressão de proteínas relacionadas à função dos osteoclastos, como V-ATPase-d2 e CTSK, foi regulada negativamente na presença de CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)comparado aos grupos de controle. No entanto, CDP não teve efeito na expressão de RANK (Figura 5b).

3.5|CDP promove a expressão de enzimas antioxidantes para eliminar a produção de ROS durante a osteoclastogênese induzida por RANKL

Para explorar o mecanismo subjacente da inibição da osteoclastogênese dependente de CDP, BMMs foram tratados com RANKL (100 ng/ml) e M-CSF (50 ng/ml) juntamente com PBS ou CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)por 72h. Examinamos o efeito da CDP na produção de ROS intracelular estimulada por RANKL. Os níveis de ROS intracelulares foram aumentados pelo tratamento com RANKL, que foi atenuado por CDP (5 e 10 µM; Figura 6a). Tanto o número de células ROS-positivas quanto a intensidade da coloração de ROS foram diminuídas pelo tratamento com CDP de maneira dose-dependente (Figura 6b,c). A análise de Western blot mostrou que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)promoveram a expressão de tioredoxina (TRX1) e glutationa redutase (GSR) enquanto suprimiam a expressão de óxido nítrico sintase induzível (NOS2) em BMMs que foram tratados com RANKL e M-CSF por 3 dias (Figura 6d).

Para explorar mais se o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)suprimimos a diferenciação de osteoclastos reduzindo a produção de ROS, então tratamos BMMs com peróxido (10 µM) para imitar o alto status de ROS nas células. BMMs foram induzidas por RANKL e M-CSF por 3 dias e os resultados da análise de Western blot e RT-PCR mostraram que o peróxido promoveu a expressão de NFATc1 e c-Fos em comparação com os grupos controle. Consistente com os resultados da Figura 5, a expressão de NFATc1 e c-Fos foi suprimida por CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)enquanto o peróxido resgatou o efeito inibitório da CDP (Figura 6e,f). Esses dados indicaram que o CDP reprimiu a expressão de NFATc1 e c-Fos eliminando a produção de ROS.

3.6|CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)reprime as vias MAPK durante a osteoclastogênese induzida por RANKL

Em seguida, investigamos o efeito do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)tratamento na expressão de TRAF6 mediada por RANKL e ativação da via MAPK. Após a incubação em meio sem soro por 2 horas, os BMMs foram estimulados com RANKL, com ou sem CDP, por 60 minutos. A estimulação com CDP (10 µM) não teve efeito na expressão de TRAF6 e atenuou a fosforilação de JNK2 e ERK1/2 em 10 e 20 min (Figura 7). Além disso, a fosforilação de p38 foi significativamente inibida por CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)tratamento de 60 min em relação aos grupos controle (Figura 7). Esses dados revelam que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)suprime as vias de sinalização MAPK induzidas por RANKL, consistente com seu efeito inibitório na formação e atividade dos osteoclastos.

4|DISCUSSÃO

Cistanche, conhecido como "ginseng do deserto", tem atraído muita atenção recentemente por sua capacidade de modular a imunidade e agir de forma protetora durante o envelhecimento e estresse oxidativo (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Os glicosídeos substituídos por fenilpropanóides, os principais componentes ativos do Cistanche, demonstraram inibir a atividade do NO em macrófagos (Ahn, Chae, Chin e Kim, 2017). Além disso, umCistancheextrato reduziu o estresse oxidativo no miocárdio reperfundido após isquemia e desempenhou um papel significativo na inibição das vias apoptóticas que levam à cardioproteção (Yu, Li, & Cao, 2016). Como um componente importante do Cistanche, o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)tem uma variedade de funções farmacológicas. Nosso estudo atual descobriu que o CDP reprimiu a diferenciação e ativação de osteoclastos ativados por RANKL, atenuando a produção de ROS, bem como a ativação de NFAT e MAPK.

Como uma fosfatase ácida, TRAcP existe em uma variedade de células e é abundante em osteoclastos e macrófagos alveolares (Snipes, Lam, Dodd, Gray e Cohen, 1986). A TRAcP é uma enzima característica dos osteoclastos e sua expressão está intimamente relacionada à função osteoclástica, considerada um indicador da atividade osteoclástica e da reabsorção óssea (Minkin, 1982). Em nosso estudo, o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)inibiu o número de células TRAcP-positivas, indicando que a osteoclastogênese induzida por RANKL foi bloqueada por CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo). A degradação da matriz óssea pelos osteoclastos depende da catepsina K (CTSK) e das MMPs (Gruber, 2015). Aqui, o CDP diminuiu significativamente a expressão de genes funcionais de osteoclastos, como Mmp9, Ctsk e Acp5.

A diferenciação e a função dos osteoclastos são reguladas por múltiplas vias de sinalização (Boyle, Simonet e Lacey, 2003). Após a ligação ao RANK, o RANKL recruta a proteína adaptadora TRAF6 para ativar a expressão de NFATc1, que é um importante fator de transcrição para a formação de osteoclastos, afetando a expressão de genes específicos de osteoclastos, incluindo TRAcP e CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Neste estudo, descobrimos que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)não teve efeito na expressão de RANK e TRAF6 em osteoclastos. No entanto, o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)inibiu a ativação de NFATc1 induzida por RANKL durante a osteoclastogênese de BMMs. Além disso, foi demonstrado que ROS, produzidos pelas mitocôndrias no processo de entrega de elétrons, promovem a proliferação e diferenciação de osteoclastos e regulam a degradação da matriz óssea (Ha et al., 2004). Um estudo recente descobriu que o RANKL induziu a importação nuclear de Bach1 e atenuou a produção de enzimas antioxidantes mediadas por Nrf2, aumentando assim a expressão intracelular de ROS e a osteoclastogênese em camundongos (Kanzaki et al., 2017). Além disso, o aumento da geração de ROS intracelular pela homocisteína aumentou a formação e a atividade dos osteoclastos (Koh et al., 2006). Nosso estudo descobriu que a CDP reduziu o acúmulo de ROS em osteoclastos ao inibir a expressão de NOS2 e promover a expressão de enzimas antioxidantes, como TRX1 e glutationa redutase. Quando tratamos BMMs com peróxido para aumentar o acúmulo intracelular de ROS, os resultados de que o aumento de ROS poderia melhorar a expressão de NFATc1 revelaram que ROS estava a montante de NFATc1. Também descobrimos que o peróxido resgatou o efeito inibitório da CDP na expressão de NFATc1. Assim, nossos dados sugerem que o CDP suprime o acúmulo de ROS para inibir a expressão de NFATc1, então para reprimir a formação e função de osteoclastos.

ERK, JNK e p38 pertencem à família MAPK, que também está envolvida na regulação da diferenciação de osteoclastos (Seger & Krebs, 1995). RANKL ativa a via MAPK aumentando a fosforilação de ERK, JNK e p38 (Mizukami et al., 2002). Demonstramos que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)reprimiu a fosforilação mediada por RANKL de proteínas-chave na via MAPK, contribuindo assim para o efeito inibitório da CDP na expressão de genes marcadores de osteoclastos. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo que mostra os efeitos inibitórios da CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)na produção de ROS, NFAT e ativação de MAPK, representando novos mecanismos de ação de CDP in vitro.

Em resumo, demonstramos que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)atenua a osteoclastogênese e a reabsorção de hidroxiapatita e a expressão de genes marcadores de osteoclastos, incluindo Ctsk, Mmp9 e Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)foi capaz de suprimir a produção de ROS mediada por RANKL, bem como a ativação de NFAT e MAPK (Figura 8). Coletivamente, nossos resultados sugerem que o CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)pode representar uma droga candidata para o tratamento de condições relacionadas a osteoclastos acompanhadas de superprodução de EROs.

FIGURA 8 Diagrama esquemático do CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)função na diferenciação dos osteoclastos. CDP(Cistanchedeserticolapolissacarideo)suprime a produção de ROS induzida por RANKL, bem como a ativação de NFATc1 e MAPK, inibindo a osteoclastogênese. CDP,Cistanchedeserticolapolissacarideo; MAPK, proteína quinase ativada por mitógeno; NFATc1, fator nuclear de célula T ativada; RANKL, ativador do receptor do ligante κB do fator nuclear; ROS, espécies reativas de oxigênio [Figura colorida pode ser visualizada em wileyonlinelibrary.com]

AGRADECIMENTOS

Este estudo foi apoiado pela Nature Science Foundation of China (81572164), o National Key Technology Research and Development Program of China (2017YFC1103300), a Natural Science Foundation of Guangxi Province (2016GXNSFAA380295) e o University Science and Technology Research Project of Guangxi Província (KY2015YB054). Também é apoiado em parte pelo Guangxi Scientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013-15), Western Australia Medical & Health Research Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, The University of Western Australia (UWA) Research Collaboration Awards e o Conselho Australiano de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC, Nos. 1107828 e 1027932).

CONFLITOS DE INTERESSE

Os autores declaram que não há conflitos de interesse

A partir de: 'Cistanchedeserticolapolissacarideoatenua a osteoclastogênese e a reabsorção óssea através da inibição da sinalização RANKL e da produção de espécies reativas de oxigênio por Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684