Uma Estratégia de Detecção de Patógenos Inatos Envolvendo a Ubiquitinação de Proteínas de Superfície Bacteriana Parte 2

DISCUSSÃO

Os metazoários usam a ubiquitinação como um mecanismo versátil para manter a homeostase citosólica, evitando o acúmulo de proteínas/organelas danificadas e defendendo-se contra patógenos invasores (40, 41). Dada a variedade de patógenos e diversos conjuntos de proteínas danificadas encontradas, a identificação de motivos comuns para reconhecimento de substrato e subsequente ubiquitinação representa uma estratégia inteligente para otimização de recursos. Proteínas em células eucarióticas que são destinadas à proteólise são tipicamente identificadas por um motivo degron tripartido (24).

Imunidade é a capacidade do corpo de combater doenças, incluindo respostas a bactérias, vírus e outras substâncias nocivas. Se o sistema imunológico do corpo estiver comprometido, não será forte o suficiente para lidar com o ataque de doenças. Estudos têm mostrado que a desnutrição tem um impacto na função do sistema imunológico, tornando o corpo mais suscetível a infecções e doenças. A proteína é uma das substâncias importantes para manter a imunidade.

As proteínas são feitas de aminoácidos, alguns dos quais são chamados de aminoácidos essenciais porque devem ser fornecidos pelos alimentos e não podem ser sintetizados pelo corpo. Esses aminoácidos essenciais incluem triptofano, leucina, fenilalanina, lisina, isoleucina, metionina, valina e histidina. Se o corpo não obtiver aminoácidos essenciais suficientes, pode levar a um metabolismo de proteínas prejudicado, o que pode afetar a função do sistema imunológico.

Além disso, uma ingestão de proteínas de alta qualidade ajuda a manter o sistema imunológico e as funções corporais normais. Quando o corpo carece de proteína, pode levar a um sistema imunológico comprometido e o corpo fica mais suscetível a doenças. Se o corpo humano carecer de proteína por muito tempo, pode causar danos a longo prazo ao sistema imunológico, tornando as pessoas suscetíveis a várias doenças.

Portanto, uma dieta balanceada e exercícios adequados são as chaves para manter a ingestão de proteínas. As pessoas podem atender às necessidades de proteína de seu corpo comendo mais alimentos ricos em proteínas, como carne, frango, peixe, feijão, ovos, laticínios, grãos, nozes e sementes. Além disso, o exercício moderado também pode aumentar a demanda do corpo por proteína e eficiência de absorção. Uma dieta equilibrada e variada e um estilo de vida saudável são as chaves para manter a imunidade, manter o corpo saudável e estável e resistir à invasão de doenças. Desse ponto de vista, precisamos melhorar nossa imunidade. Cistanche pode melhorar significativamente a imunidade porque os polissacarídeos na carne podem regular a resposta imune do sistema imunológico humano, melhorar a capacidade de estresse das células imunes e aumentar a imunidade das células imunes. Efeito bactericida.

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Isso nos levou a explorar se motivos semelhantes poderiam ser encontrados em superfícies de patógenos, onde poderiam funcionar como um proxy para o reconhecimento de substrato. Aqui, demonstramos que as ligases de ubiquitina hospedeiras usam assinaturas moleculares semelhantes para detectar patógenos filogeneticamente distintos. O reconhecimento de patógenos por meio de padrões/motivos moleculares comuns (PAMPs) é uma característica bem caracterizada da imunidade inata (42). Nossos resultados sugerem que as sequências do tipo degron dentro das proteínas de superfície bacteriana agem de maneira equivalente aos PAMPs, para conferir vigilância intracelular de patógenos. Este modus operando pode ser mais explorado pelo hospedeiro para a apresentação de antígenos de proteínas microbianas no complexo principal de histocompatibilidade I para induzir uma forte resposta de CD8 dirigida contra patógenos intracelulares.

A importância potencial da detecção de patógenos mediada por ubiquitina para as defesas do hospedeiro é ainda destacada pela substancial ubiquitinação residual detectada em SPN mutantes que carecem de BgaA e PspA. Isso indica que existem outros substratos não identificados da maquinaria da ubiquitina, com a redundância resultante garantindo uma interceptação robusta de patógenos. Notavelmente, algumas questões imediatas sobre o motivo degron e sua importância para as bactérias (além de ser uma unidade reconhecível) fornecem um ângulo evolutivo interessante.

O motivo degron é dispensável in vivo e, se houver, a mutação ou exclusão do motivo melhora a persistência intracelular, resultando em maior virulência. Isso é corroborado por nossos resultados de que a mutação no motivo degron pode ser usada por patógenos para escapar do reconhecimento mediado por ubiquitina, como observado para o sorotipo 19F de SPN. No entanto, a natureza conservada do motivo degron em BgaA na maioria dos sorotipos SPN pode ser sugestiva de uma contra-estratégia adotada pela bactéria para ser menos letal para o hospedeiro.

Isso poderia fornecer uma oportunidade para o patógeno aumentar seus habitats ocupáveis. Ao mesmo tempo, a ubiquitinação da superfície bacteriana ou proteínas secretadas no motivo degron poderia modulá-las funcionalmente para amortecer ou religar a resposta do hospedeiro para eventual benefício (43). Portanto, a presença ou ausência de domínios ou motivos funcionais do tipo eucariótico (como degrons) pode ser dependente de um nicho patogênico e adaptado para evadir ou modular as respostas imunes do hospedeiro.

Um mecanismo de detecção de patógeno semelhante envolvendo proteínas de ligação de guanilato também foi implicado na eliminação bacteriana; no entanto, ao contrário da ubiquitinação, seu papel é restrito a patógenos Gram-negativos (44-47). A ubiquitinação visa o patógeno independentemente da origem do Gram, por exemplo, RNF213 foi documentado como alvo de Listeria spp. independentemente da ausência de LPS (48). Não eliminamos, portanto, a possibilidade de sua ação antimicrobiana também contra SPN.

Uma superfície patogênica pode ser ubiquitinada com vários tipos de cadeia por diferentes ligases E3 com interações intercadeias (41). Em particular, no caso de Mtb, Smurf1 e Parkin provaram formar os tipos de cadeia K48 e K63 que funcionam sinergicamente para degradar o patógeno (12). A compreensão do papel mecanicista da ubiquitinação K48 e das ligases E3 envolvidas durante cenários de infecção ainda é pouco estudada. No caso de STm, uma única E3 ligase ARIH1 foi descrita para atingir o STm citosólico com cadeias de ubiquitina K48 levando à sua eliminação do sistema (15). Com base em nossas descobertas e de outros, os patógenos marcados com K48-Ub são finalmente degradados enquanto estão associados à maquinaria proteassômica.

No entanto, este estudo mostra a decoração K48-Ub de proteínas específicas da superfície bacteriana. Alguns patógenos são conhecidos por modificar ativamente suas proteínas de superfície, protegendo-as da ubiquitinação e subsequente morte, enfatizando assim a importância da localização da superfície do substrato da ubiquitina (10). Além disso, vários patógenos intracelulares obrigatórios desenvolveram estratégias para desubiquitinar a si mesmos, ou componentes reguladores do hospedeiro, para evitar a depuração mediada pela ubiquitina (5). Juntos, esses achados ressaltam a importância da ativação de alarme mediada por ubiquitina como um mecanismo fundamental de detecção de patógenos intracelulares, central para as defesas do hospedeiro.

Nosso estudo demonstrou ainda o papel central da SCF E3 ligase, particularmente com FBXW7, na ubiquitinação bacteriana aumentando a degradação do patógeno. Mutações heterozigóticas em FBXW7, particularmente a variante R505C (um resíduo crítico na bolsa de reconhecimento de substrato), desencadeiam carcinomas múltiplos e leucemia linfocítica em humanos (49, 50). Um recente estudo baseado em coorte indicou que quase 43 por cento dos pacientes com leucemia linfocítica crônica (LLC) sucumbem à pneumonia bacteriana e sepse, seguida por infecções fúngicas (51).

Isso corrobora nossa observação da capacidade anulada de células hospedeiras com mutação FBXW7 para detectar e eliminar patógenos. Nossos achados, portanto, fornecem uma explicação molecular inesperada do risco aumentado de infecções em pacientes com LLC. A ligação entre o polimorfismo genético nos genes da ligase E3 e a suscetibilidade a infecções bacterianas também é comprovada por pacientes com doença de Parkinson, que são vulneráveis ​​à febre tifoide ou à hanseníase (14), sugerindo a notável contribuição das ligases E3 na imunidade do hospedeiro contra infecções bacterianas e manutenção de estado estacionário celular.

Em conclusão, deciframos uma linguagem universal de detecção de patógenos residentes no citosol que pode ser aplicada de forma eficiente pelo hospedeiro para reconhecer microorganismos para posterior eliminação. Coletivamente, essas descobertas lançam luz sobre a compreensão dos processos imunológicos celulares rudimentares, que podem ser aproveitados para intensificar a imunidade antibacteriana.

MATERIAIS E MÉTODOS

Cultura de células

Tanto a linha celular de carcinoma alveolar do pulmão humano (pneumócito tipo II) A549 [American Type Culture Collection (ATCC) no. CCL185)] e a linha celular de adenocarcinoma cervical HeLa (ATCC no. CRM-CCL-2) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; HiMedia) suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino (Gibco) a 37 graus e 5 por cento de CO2.

Cepas bacterianas e condições de crescimento

SPN (R6, sorotipo 2, presente de Tim J. Mitchell, University of Birmingham, Reino Unido) foi cultivado em caldo Todd-Hewitt suplementado com 1,5 por cento de extrato de levedura a 37 graus em 5 por cento de CO2. Os seguintes antibióticos foram usados ​​para cultivar culturas de SPN quando necessário: canamicina (200 ug/ml), espectinomicina (100 ug/ml) e cloranfenicol (4,5 ug/ml). Novecentos microlitros de 0,4 OD600 (densidade óptica a 600 nm) de cultura SPN cultivada foram misturados com 600 ul de glicerol estéril a 80 por cento (concentração final de glicerol de 32 por cento) e armazenados em um congelador de -80 graus. Esses estoques de glicerol foram usados ​​como inóculo inicial para todos os experimentos.

As culturas de Escherichia coli DH5 e STm (ATCC 14028) foram cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) a 37 graus sob agitação (200 rpm) e, quando necessário, foram utilizados os seguintes antibióticos: canamicina (50 ug/ml), espectinomicina (100 ug/ml), cloranfenicol (20 ug/ml) e ampicilina (100 ug/ml). Para todos os ensaios de infecção, as bactérias foram cultivadas até OD600 ~0,4, seguido de ressuspensão em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma densidade semelhante antes de infectar as células hospedeiras.

Triagem de proteínas alvo de ubiquitina putativas

Todas as proteínas de superfície presentes no proteoma STm e SPN foram identificadas pela primeira vez na literatura publicada. As sequências proteicas completas das proteínas de superfície foram obtidas da UniProt, que foram então utilizadas para identificar a presença de motivos degron. Um conjunto de 29 motivos degron putativos foi curado da literatura publicada (24, 52, 53) e do banco de dados Eukaryotic Linear Motif. O módulo regex do Python foi usado para identificar a localização de todos esses motivos curados nas sequências de proteínas de superfície. Uma busca linear foi ainda realizada para identificar a presença de um resíduo de lisina nas proximidades (8 a 14 resíduos de aminoácidos) para cada motivo degron identificado. Presume-se que este resíduo de lisina atue como o local de ligação para a fração ubiquitina. Por último, as sequências de proteínas pré-selecionadas foram inseridas no IUPred (54), uma ferramenta de previsão da estrutura da proteína, para localizar a presença de uma região desordenada entre o motivo degron e a lisina proximal. As proteínas resultantes (BgaA e PspA para SPN e RlpA para STm) foram selecionadas para avaliação como alvos de ubiquitinação e decodificação de seu papel na eliminação de patógenos.

Construção de estirpe bacteriana

A troca alélica por recombinação homóloga foi realizada usando regiões flanqueadoras de genes que carregam um cassete de antibiótico inserido para a geração de cepas mutantes em SPN e STm (tabela S2).

Para SPN, 500-regiões upstream e downstream de bgaA, pspA e seus genes foram amplificados do genoma com primers apropriados (tabela S3) e montados no vetor pBKS. Após a clonagem desses fragmentos, um cassete de resistência a antibióticos (espectinomicina para bolsa, bem como pspA e cloranfenicol para hysA) foi inserido nessa construção. Os plasmídeos recombinantes linearizados foram então transformados em WT SPN usando o peptídeo estimulador de competência 1 (GenPro Biotech), os recombinantes foram selecionados usando os respectivos antibióticos e a substituição do gene foi confirmada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento dos respectivos loci gênicos. Para STm, o método de recombinase λ-red foi usado para a geração de mutantes de deleção de gene (55).

Resumidamente, sequências homólogas às extremidades do gene da corda foram anexadas nas sequências de primer que são usadas para a amplificação do cassete de resistência à canamicina. O cassete foi então eletroporado na cepa WT STm, e knockouts gerados por recombinação homóloga foram selecionados com base na resistência à canamicina. A deleção do gene foi confirmada por meio de PCR e sequenciamento do locus gênico. PspA completo, hysA e um bgaA-T truncado (1 a 3168 pb) foram clonados sob o promotor P23 no vetor de transporte pIB166 (56) e usados ​​para complementação.

Esses plasmídeos recombinantes também foram usados ​​para mutagênese direcionada ao local para gerar diferentes variantes de bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R e bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R e pspAΔDegron ) e his (hysADegron-BgaA e hysADegron-PspA) usando conjuntos de primers apropriados (tabela S3) e transformados em mutantes ΔbgaA e ΔpspA. Todos os clones foram verificados por sequenciamento de DNA. A expressão de diferentes variantes de BgaA, PspA e HysA foi confirmada por Western blot usando anticorpos apropriados.

Anticorpos e reagentes

soro anti-enolase e anti-PspA (S. Hammerschmidt, Universidade de Greifswald, Alemanha); soro anti-BgaA (S. King, The Ohio State University, EUA); e anticorpos específicos para His6 (Invitrogen, MA1-21315), ligação K48-Ub (Millipore, 05-1307), ligação K63-Ub (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), gliceraldeído fosfato desidrogenase (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], fosfotreonina (CST, 9381S), IgA, Kappa de mieloma murino, clone TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) e PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) foram adquiridos. Os seguintes anticorpos secundários foram usados: anti-coelho marcado com peroxidase (HRP) (BioLegend, 406401), anti-camundongo marcado com HRP (BioLegend 405306), anti-coelho Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-coelho Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), imunoglobulina A anti-rato conjugada com biotina (Life Technologies, M31115), anti-rato Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), anti-rato Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), anti-cabra Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082) e FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Expressão e purificação de proteínas

BgaA-T e suas variantes foram clonadas em pET28 usando sítios de restrição Xba I/Not I. Plasmídeos recombinantes que codificam BgaA-T com His-tag N-terminal foram transformados em células E. coli BL21 (DE3) para expressão de proteína. Colônias recém-transformadas foram cultivadas em LB contendo canamicina (50 ug/ml) a 37 graus em uma incubadora agitadora por 12 horas. Um por cento da cultura primária foi adicionado a 1 litro de caldo LB e incubado a 37 graus em uma incubadora agitadora até que OD600nm atingisse entre 0,6 e 0,8. A expressão da proteína foi induzida pela adição de 100 μM de isopropil- -D-tiogalactopiranósido (IPTG) e crescimento adicional da cultura a 37 graus por 5 a 6 horas com agitação a 150 rpm.

As células foram colhidas por centrifugação a 6000 rpm por 10 min a 4 graus. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão A [tris 25 mM (pH 8,0) e NaCl 300 mM] e lisado por sonicação. Os detritos celulares foram separados por centrifugação (14,000 rpm, 50 min, 4 graus), e o sobrenadante foi aplicado em uma coluna Ni-NTA, equilibrada com tampão A. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão A, e as proteínas marcadas com His foram eluídas com imidazol (250 mM) em tampão A. Todas as variantes de BgaA-T foram expressas e purificadas usando o mesmo procedimento. FBXW7 foi subclonado no vetor pGEX-4 T-1 tendo uma tag N-terminal glutationa S-transferase (GST) do vetor pCMV6-Entry-FBXW7 usando a enzima de restrição Eco RI.

FBXW7 marcado com GST foi expresso em células E. coli BL21 (DE3) após indução da expressão da proteína com IPTG 0,1 mM e crescimento a 30 graus por 4 horas. GST-FBXW7 do extrato bruto de E. coli foi purificado usando cromatografia em coluna de Glutationa-Sepharose (GE HealthCare). Frações contendo proteínas purificadas foram reunidas e concentradas até 0,5 mg/ml usando um filtro de corte de peso molecular 10-kDa (Amicon) por centrifugação a 4700 rpm a 4 graus. A pureza das proteínas foi verificada em eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de coloração com azul de Coomassie.

Transfecções de células hospedeiras

BgaA-T foi clonado no vetor induzível por doxiciclina pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene no. 130261) usando um kit de clonagem por infusão (Takara). Um clone positivo foi confirmado pelo sequenciamento de Sanger. A mutação FBXW7R505C foi realizada por mutagênese dirigida ao local usando pMRX-GFP-FBXW7 como modelo e confirmada por sequenciamento de Sanger. Todas as transfecções foram realizadas usando o reagente Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), e as seleções foram feitas na presença de cloridrato de blasticidina (2 ug/ml; HiMedia).

knockdown de gene dirigido por siRNA

Para knockdown mediado por interferência de RNA de genes específicos, os seguintes siRNAs foram usados: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) e siGSK3 (Dharmacon ONTARGET SMARTpool L-003010-00-0005). Resumidamente, as células A549 cultivadas em uma placa de poços 24-foram transfectadas temporariamente com siRNAs específicos de gene ou mistura (siControl) (150 pmol) usando Lipofectamine 3000 de acordo com as instruções do fabricante. Trinta e seis horas após a transfecção, as células foram processadas para Western blotting e imunofluorescência ou ensaios de proteção com penicilina-gentamicina.

Previsão e modelagem de estrutura

Todas as estruturas foram previstas por AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) e visualizadas usando PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, versão 2.0 Schrödinger, LLC). As estruturas foram codificadas por cores em PyMol com base nas pontuações IUPred (54), variando de ordenadas (azul) a desordenadas (vermelhas) até o branco.

Western Blotting

Culturas SPN crescidas para {{0}}.4 OD600nm foram lisadas por sonicação, e extratos brutos foram coletados após centrifugação (15,000 rpm, 30 min, 4 graus). Para A549s, as monocamadas foram lavadas várias vezes com PBS e lisadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) gelado [50 mM tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1 por cento Triton X-100, 0,5 por cento de sódio desoxicolato e 1 por cento SDS] contendo coquetel inibidor de protease (Promega), fluoreto de sódio (10 mM) e EDTA (5 mM). A suspensão celular foi sonicada brevemente e centrifugada para coletar os lisados ​​celulares. As proteínas presentes em lisados ​​de células bacterianas ou A549 (10 ou 20 ug) foram separadas em géis SDS-PAGE a 12 por cento e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno ativada. Após o bloqueio em 5% de leite desnatado, as membranas foram sondadas com anticorpos primários apropriados e secundários marcados com HRP. Os blots foram finalmente revelados usando um substrato de quimioluminescência aprimorada (Bio-Rad).
Ensaio de proteção penicilina-gentamicina

Cepas SPN cultivadas até OD600nm 0.4 em caldo Todd-Hewitt suplementado com 0.2 por cento de extrato de levedura (THY) foram peletizadas, ressuspensas em PBS ( pH 7,4) e diluído em meio de ensaio para infecção de monocamadas A549 com multiplicidade de infecção (MOI) de 10. Após 1 hora de infecção, as monocamadas foram lavadas com DMEM e incubadas com meio de ensaio contendo penicilina (10 ug/ml ) e gentamicina (400 ug/ml) por 2 horas para matar SPN extracelular. As células foram então lisadas com 0,025% Triton X-100, e o lisado foi semeado em placas de ágar Brain Heart Infusion para enumerar SPN viável. A porcentagem de invasão foi calculada como [unidades formadoras de colônias (CFU) no lisado/CFU usado para infecção] × 100. Para avaliar a sobrevivência intracelular, 9 horas após a infecção (desde o início do tratamento com penicilina-gentamicina), os lisados ​​celulares foram preparados como mencionados acima, e as bactérias espalhadas e sobreviventes foram enumeradas. A eficiência de sobrevivência (porcentagem) foi representada como uma mudança de vezes na porcentagem de sobrevivência em relação ao controle no ponto de tempo indicado (normalizado para 0 horas).

imunofluorescência

Para o ensaio de imunofluorescência, as células A549 ou HeLa foram cultivadas em lamínulas de vidro e infectadas com cepas SPN ou STm em MOI ~25 por 1 hora, seguido de tratamento com antibiótico por 2 horas. Nos pontos de tempo desejados após a infecção (9 horas para infecção SPN em A549s e 3 horas para infecção com STm em HeLa), as células foram lavadas com DMEM e fixadas com metanol gelado a -20 graus por 10 min. Além disso, as lamelas foram bloqueadas com 3 por cento de albumina de soro bovino (BSA) em PBS por 2 horas em temperatura ambiente (RT). As células foram então tratadas com um anticorpo primário apropriado em 1 por cento de BSA em PBS durante a noite a 4 graus, lavadas com PBS e incubadas com um anticorpo secundário adequado em 1 por cento de BSA em PBS por 1 hora à temperatura ambiente. Por último, as lamelas foram lavadas com PBS e montadas em lâminas de vidro juntamente com VECTASHIELD com ou sem 4',6-diamidino-2-fenilindol (Vector Laboratories) para visualização usando um microscópio confocal de varredura a laser (LSM 780, Carl Zeiss ) sob objetivos de óleo de 40× ou 63×. As imagens foram adquiridas após seccionamento óptico e processadas no software ZEN lite (versão 5.0). A microscopia de superresolução foi realizada de forma semelhante usando Elyra 7 (Carl Zeiss) no modo SIM. Para análise de colocalização, as bactérias foram pontuadas por contagem visual de n > 100 bactérias por réplica.

Microscopia eletrônica de transmissão

Após a infecção com SPN e STm, as células foram lavadas com {{0}}. Tampão de cacodilato de sódio 1 M, fixado com 2,5 por cento de glutaraldeído (Sigma-Aldrich) em 0. Tampão de cacodilato de sódio 1 M ( Sigma-Aldrich) por 3 horas a 4 graus. Após a fixação, as células foram coletadas por meio de um raspador de células e peletizadas a 2000 rpm por 10 min. As células foram então lavadas com tampão de cacodilato de sódio 0,1 M e pós-fixadas com 1 por cento de tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M por 20 min a 4 graus. Após lavagens subsequentes com tampão cacodilato e água destilada, as células foram então desidratadas em concentrações crescentes de etanol (50, 70, 95 e 100 por cento) e óxido de propileno por 30 min e, por último, embebidas em resina epóxi (Electron Microscopy Sciences, 14300) por polimerização a 75 graus por 45 min. Posteriormente, as cápsulas foram transferidas para um forno a 95 graus por 45 min. Seções ultrafinas (70 nm) foram cortadas usando uma faca de diamante em um Leica EM UC7 Ultramicrótomo e coradas com 2 por cento de acetato de uranila e 1 por cento de citrato de chumbo e visualizadas usando um microscópio eletrônico de transmissão (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) a 120 KV.

Ubiquitinação ex vivo

A549-expressando BgaA-T e suas variantes foram tratados com MG132 (5 μM), e as expressões de proteínas foram induzidas com doxiciclina (100 ug/ml) por 24 horas. As células foram então lisadas em tampão RIPA e as amostras foram submetidas a eletroforese por SDS-PAGE (8 por cento). A confirmação da expressão da proteína e a ubiquitinação de BgaA-T e suas variantes foram comprovadas por Western blot após sondagem com anticorpos anti-BgaA e anti-K48-Ub, respectivamente.

Ubiquitinação in vitro

Para ensaios de ubiquitinação in vitro, as proteínas recombinantes foram purificadas conforme descrito anteriormente (58). O complexo ligase SCFFBW7 E3 foi incubado com recombinante 0.1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) e ubiquitina (2,5 ug/ml; Boston Biochem) na presença de BgaA-T purificado e suas variantes. As reações de ubiquitilação foram realizadas em tampão de ensaio [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM trifosfato de adenosina (ATP), 1 mM -mercaptoetanol e 0,1 por cento Tween 20] por 2 horas a 25 graus . As reações foram interrompidas com tampão 5× Laemmli, resolvidas em géis SDS-PAGE e analisadas por imunoblotting usando um anticorpo anti-BgaA.

Ensaio de quinase in vitro

Para realizar o ensaio de quinase in vitro, o sistema de enzima GSK3 quinase (Promega) foi usado de acordo com o protocolo do fabricante com as seguintes modificações. Resumidamente, 3 ug de BgaA-T recombinante foram adicionados a 0.5 ug de GSK3 ativo com 400 μM de ATP em tampão de reação composto por 40 mM tris, (pH 7,5), 20 mM MgCl2 , BSA (0,1 mg/ml) e 50 μM de ditiotreitol. A reação foi incubada por 2 horas a 30 graus e interrompida pela adição de 1 × tampão Laemmli. As amostras foram então fervidas e submetidas a eletroforese para Western blotting, conforme mencionado anteriormente. A BgaA-T fosforilada foi detectada com um anticorpo antifosfotreonina.

Modelo in vivo

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 por cento do peso corporal inicial e secreção nasal ou ocular pronunciada. Amostras de sangue foram obtidas por punção cardíaca sob anestesia terminal e os baços foram extirpados post mortem para enumeração bacteriana. As amostras de tecido foram processadas com um homogeneizador de tecido portátil e os homogenatos foram diluídos em série em PBS antes de serem colocados em placas de ágar sangue. As placas foram incubadas durante a noite a 37 graus, 5% de CO2 e o número de colônias bacterianas foi avaliado no dia seguinte.

Análise estatística

GraphPad Prism versão 5 foi usado para análise estatística. Os testes estatísticos realizados para experimentos individuais são mencionados nas respectivas legendas das figuras. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados foram testados quanto à normalidade e para definir a variância de cada grupo testado. Todas as análises multiparâmetros incluíram correções para comparações múltiplas, e os dados são apresentados como média ± DP, salvo indicação em contrário.

REFERÊNCIAS E NOTAS

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs e alarmins: Tudo o que precisamos saber sobre o perigo. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Reconhecimento de patógenos e sinalização inflamatória nas defesas imunes inatas. Clin. Microbiol. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Life on the inside: The intracelular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, O papel da ubiquitylation na defesa imunológica e evasão de patógenos. Nat. Rev. Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, O sistema de ubiquitinação nas interações patógeno-hospedeiro bacteriano. Microorganisms 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Análise global do hospedeiro e ubiquitinoma bacteriano em resposta à infecção por salmonela typhimurium. Mol. Cela 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, uma proteína de superfície da tuberculose do micobactéria recruta ubiquitina para desencadear a xenofagia do hospedeiro. Nat. Comum. 10 de 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitylation of lipopolissacarídeo por RNF213 durante infecção bacteriana. Nature 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, complexo FBXO2/SCF ubiquitina ligase dirige xenofagia através do reconhecimento de glicano de superfície bacteriana. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, A metilação da lisina protege um patógeno intracelular da ubiquitilação e da autofagia. ciência Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, uma E3 ubiquitina ligase com sentido para bactérias. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, A ubiquitina ligase Smurf1 funciona na autofagia seletiva do micobacterium tuberculosis e na defesa antituberculosa do hospedeiro. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathé, MA Michel, D. Komander, F. Randow, cadeias de ubiquitina lineares sintetizadas por LUBAC restringem as bactérias invasoras do citosol ativando a autofagia e o NF-κB. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, A ubiquitina ligase parkin medeia resistência a patógenos intracelulares. Nature 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Expandindo a maquinaria de ubiquitilação da célula hospedeira visando Salmonella citosólica. EMBO Rep. 18, 1572-1585 (2017).

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