Uma nova estratégia para triagem de componentes ativos em Cistanche Tubulosa com base na análise de relação espectro-efeito e farmacologia de rede Ⅱ

3 Resultados e discussão

3.1. Impressões digitais de HPLC

3.1.1. Método de validação

A validação para o método HPLC mostrou que o desvio padrão relativo (RSD) para precisão, reprodutibilidade e estabilidade do método foi inferior a 2,85 por cento para a área de pico relativa (n = 11) e 0,77 por cento para o tempo de retenção relativo (n = 11). A precisão da mesma solução de amostra apareceu dentro do intervalo de 0.05–{{10}}.77 por cento para tempo relativo e 0.28– 2,70 por cento para a área relativa dos picos comuns. A reprodutibilidade do experimento estava dentro do intervalo de 0.03–0,20 por cento para o tempo relativo e 0,23–2,59 por cento para a área relativa dos picos comuns. A estabilidade da amostra foi de 0,09–0,24 por cento para o tempo de retenção relativo e 0,75–2,85 por cento para a área relativa dos picos comuns. Esses resultados indicaram que a impressão digital estabelecida foi satisfeita. As relações lineares para o ácido geniposídico,equinacosida, acteoside, tubulósido A, eisoacteosidesão mostrados na Tabela S4. O valor de R quadrado foi 1.0000, indicando boa linearidade. Os resultados da recuperação da amostra mostraram que as recuperações médias de ácido geniposídico, echinacoside,acteoside, tubulósido A, eisoacteosideforam 100,37 por cento, 103,59 por cento, 98,46 por cento, 100,81 por cento e 101,19 por cento, e o RSD para recuperações de amostras foi inferior a 2,68 por cento.

Clique aqui para obter mais detalhes sobre os componentes ativos do Cistanche

3.1.2. Área de Pico (PA) e Tempo de Retenção Relativo (RRT)

As impressões digitais de referência e impressões digitais de HMs, WEs e HRs de 11 lotes de C. tubulosa são apresentadas na Figura 2. Onze picos, que exibiram boa separação e resolução, foram identificados como picos comuns entre HMs, WEs e HRs. Os cinco compostos padrão foram identificados como ácido geniposídico (A2),equinacosida(A8),acteoside (A9), tubulósidoA (A10), eisoacteoside(A11). O composto padrão,equinacosida, que estava presente em todos os cromatogramas (tempo médio de retenção de 12,86 min) com uma área de pico adequada e boa estabilidade, foi selecionado como o pico de referência e usado para calcular os tempos de retenção relativos (RRTs) dos outros dez picos comuns. Os RRTs dessas formas diferentes estão no intervalo 0.16–1.51. O PA e o coeficiente de variação (CV por cento ) desses picos comuns estão listados nas Tabelas S5–S7. A partir dos dados, os valores percentuais de CV para PA em várias formas são 25,78 por cento –142,02 por cento, 23,36 por cento –150,38 por cento e 28,91 por cento –112,78 por cento para HMs, WEs e HRs, respectivamente. Esses resultados revelam diferenças significativas na concentração de cadacistanche tubulosacomposto entre as diferentes formas. As impressões digitais de HMs, WEs e HRs são mostradas na Figura 3.

Figura 2 Impressões digitais de HPLC de amostras padrão

3.1.3. Conteúdo de HMs, WEs e HRs

Cinco constituintes padrão deC. tubulosaforam medidos. Os conteúdos dos componentes principais são mostrados na Tabela 1. A comparação entre HMs, WEs e HRs é mostrada na Tabela 2 e na Figura 4. PhGs em C. tubulosa são biologicamente ativos, mas termossensíveis. Os componentes sensíveis ao calor que se dissolvem na água podem ser extraídos com eficiência usando um método razoável. Geralmente, a erva Cistanche é extraída com água e depois evaporada em uma solução concentrada para a análise química seguinte [26, 27, 30]. Após a extração e concentração, foi utilizada a tecnologia de spray-drying e o procedimento foi modificado em relação ao artigo anterior. A água foi rapidamente removida do vapor líquido e, em seguida, foram obtidos extratos secos de matérias-primas das plantas. Nesta etapa, a adição de maltodextrina é considerada um carreador comum para aumentar a dispersão e prolongar o tempo de armazenamento. Por meio de uma série de processos de fabricação, as plantas herbáceas foram prensadas em grânulos de fórmula com aditivos. Esta etapa de adição de excipientes não foi incluída no experimento. De um modo geral, nosso processo de produção inclui extração, concentração e secagem por pulverização, conforme descrito na Seção 2.2, em paralelo com um processo de produção de grânulos de fórmula. Para produzir esses produtos semi-acabados, as três etapas acima devem ser seguidas. O procedimento de formação de WEs envolve concentração e spray-drying, que facilmente causam a perda de componentes termossensíveis, mas os HRs são obtidos após a extração e secagem dos HMs. Perguntamo-nos se é possível que os componentes ativos permaneçam nas HRs. De acordo com nossos resultados, o conteúdo de verbascoside reduziu significativamente de HMs para WEs e HRs ( e , respectivamente). A estabilidade térmica do verbascosídeo é investigada monitorando as mudanças na área do pico através de HPLC durante o processo de aquecimento. Após aquecimento por 4 h, resta 41,6% de verbascosídeo. Isso indica que o verbascosídeo é termossensível [31]. Isoacteoside, tubuloside A e echinacoside em WEs permaneceram estáveis ​​após procedimentos complexos de processamento. Durante o processo de secagem de longa duração, o acúmulo de PhGs apresentou uma diminuição significativa, o que pode ser atribuído à degradação térmica desses componentes termossensíveis [32]. Em termos dos outros componentes-alvo, HRs e WEs não diferiram significativamente, exceto para verbascoside. Nossa compreensão dessa diferença nos permitirá desenvolver melhores padrões de qualidade para resíduos de ervas no futuro e avançá-los em produtos.

Tabela 1 Conteúdo de 11 lotes de C. tubulosa

Tabela 2 Comparação do conteúdo dos principais componentes (n = 11).

,

Figura 4 Determinação do conteúdo de cinco componentes de diferentes formas (n = 11). , ns: não significativo.

3.1.4. Análise de similaridade de impressão digital

As similaridades entre os três grupos de C. tubulosa foram avaliadas. Os valores de similaridade de material de ervas-extrato de água, material de ervas-resíduo de ervas e extrato de água-resíduo de ervas estavam nas faixas 0.943–0.994, 0.847–{ {9}}.995 e 0.938–1.000, respectivamente (Tabela 3).

Tabela 3 Semelhanças de HM-WE, HM-HR e WE-HR para 11 lotes de C. tubulosa.

3.2. Resultados do Teste de Atividade Antioxidante

As atividades antioxidantes das várias formas de C. tubulosa foram determinadas usando os ensaios de DPPH, , e capacidade de eliminação, e os resultados relevantes são apresentados na Figura 5. Na Tabela S8, os intervalos para o DPPH e os resultados do ensaio de capacidade de eliminação foram { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 e 0,32–27,65 mg/mL para as três formas diferentes entre os 11 lotes de C. tubulosa. Em três testes de atividade antioxidante, HMs e WEs exibiram atividade de inibição próxima, enquanto HRs mostraram a inibição mais fraca.

Verificou-se que os WEs secos por pulverização exibem atividades significativas mesmo em baixas concentrações. Um relatório anterior indicou que um WE de Vernonia amygdalina seco por pulverização alcançou 50 por cento de inibição de eliminação a 0,17 mg/mL [33]. A aplicação de longos tempos de extração e altas temperaturas é uma faca de dois gumes. Por um lado, aumentar o tempo de extração e a temperatura de entrada da secagem por pulverização melhora o rendimento e a eficiência. Além disso, os extratos alcançam forte atividade antioxidante e maiores concentrações de componentes biológicos do que essas plantas [34]. Por outro lado, o ar de entrada excessivamente quente degrada os compostos bioativos. Essas temperaturas elevadas de entrada de ar levaram a perdas da atividade antioxidante do extrato de Bidens pilosa e foram atribuídas a reduções nos compostos fenólicos [35]. Os resultados presentes são consistentes com o relatório acima mencionado. Por exemplo, o WE em S6 exibiu habilidades inibitórias de radicais mais fracas do que HM e HR. Além disso, HR em S5 exibiu habilidades de eliminação de DPPH e ânion superóxido mais fortes do que HM e WE. A estrutura dos PhGs consiste em ligações glicosídicas e grupos acetil que são facilmente hidrolisados ​​sob ação enzimática ou decompostos em altas temperaturas. Essas reações podem ser responsáveis ​​por diminuições em alguns componentes principais durante a produção em larga escala. No entanto, a hidrólise ou isomerização de certos componentes pode acelerar a síntese de outros componentes. Tais transformações são comuns ao processar ervas Cistanches [36-38]. PhGs sendo solúveis em água implica que a maioria dos componentes biológicos pode ser utilizada via extração de água. A alegação de que a maioria dos componentes ativos permanecem em WEs persistiu por décadas, então parece razoável assumir que os materiais residuais úmidos podem ser descartados após a extração. No entanto, é incorreto considerar as HRs de C. tubulosa como resíduos. Os pesquisadores apontam que os PhGs são instáveis ​​e suscetíveis à degradação enzimática ou hidrolítica [39]. As reações de hidrólise ou isomerização que contribuem para a diminuição dos ingredientes biológicos dentro dos fitoterápicos durante o processamento podem, ao mesmo tempo, apresentar novas oportunidades para explorar os HRs. Ao converter os métodos tradicionais de extração, os resíduos medicinais podem ser desenvolvidos e utilizados de forma mais eficaz. A hidrólise enzimática foi realizada para converter o resíduo de Panax ginseng em monoaçúcares. Os rendimentos de polissacarídeos e ginsenosídeos aumentaram, como açúcar, ácido succínico, polissacarídeos de ginseng e ginsenosídeos [40]. Os resíduos de Sophora flavescens são reextraídos por ondas ultrassônicas com acetato de etila [41]. As tecnologias atualizadas para a utilização de resíduos de ervas são resumidas por Huang et al. [42].

Com base nos resultados de PLSR e BCA, os cinco principais picos de diferentes formas foram rastreados usando ensaios de DPPH, ânion superóxido e eliminação de radicais hidroxila para identificar os picos mais importantes. Os resultados são ilustrados no gráfico de Venn (Figura 7). A2, A6, A8 e A10 são os picos comuns que são compartilhados por HM, WE e HR (Figuras 7(a) e 7(c)) nos ensaios de eliminação do ânion superóxido e do radical hidroxila, enquanto HM, WE e HR não compartilha picos de ensaio de DPPH. Enquanto isso, os modelos BCA mostram que A1, A2, A3 e A6 são os picos comuns compartilhados por HM, WE e HR (Figuras 7(d)–7(f)). Notavelmente, as sobreposições no diagrama de Venn indicam que o modelo BCA parece mais adequado do que o modelo PLSR, o primeiro exibindo mais repetição. Os coeficientes do modelo BCA e os valores de IC50 da capacidade antioxidante foram analisados ​​via RDA. Como o RDA mostrado na Figura 8, A1, A3 e A6 de HM e HR estão relacionados positivamente com os índices antioxidantes, exceto que A3 está relacionado negativamente com a capacidade de eliminação do radical hidroxila. A1 e A6 de WE têm fortes correlações com DPPH e o ânion superóxido. Os picos A6 observados nas várias formas exibem a conexão mais forte com o DPPH, ânion superóxido e radicais hidroxila. A1 e A3 também exibem uma conexão semelhante.

Figura 7

Diagramas de Venn do modelo PLSR e BCA: (a) Ensaio DPPH. (b) ensaio de eliminação. (c) o ensaio de eliminação foi analisado pelo modelo PLSR. (d) ensaio de DPPH. (e) ensaio de eliminação. (f) o ensaio de eliminação foi analisado pelo modelo BCA. A seção sobreposta era o estilhaço de picos comuns por HM, WE e HR.

3.4. Análise Baseada em Farmacologia de Rede

3.4.1. Construção da Rede CT

Um total de 4359 alvos relacionados à atividade antioxidante foram obtidos do banco de dados GeneCards e do banco de dados OMIM. Ao mesmo tempo, os componentes ativos foram rastreados do banco de dados TCMSP e do banco de dados SwissTargetPrediction. Em seguida, 198 alvos foram coletados e padronizados por meio do banco de dados UniPort. Havia 159 genes-alvo compartilhados por componentes ativos e doenças relacionadas a antioxidantes (ver Figura S1). A rede CT foi construída para ilustrar a correlação entre os compostos e os principais alvos do gene (Figura 9).

Figura 9 Rede de TCs. A rede mostrou a correlação entre os componentes ativos e os alvos do gene chave.

3.4.2. Construção da rede PPI e triagem dos principais alvos

O PPI foi visualizado usando o banco de dados STRING (Figura 10). A rede incluiu 159 nós e 2528 arestas. Em toda a rede de interação, os componentes de conexão ou os nós com mais pontos-alvo podem ser o componente-chave ou gene-alvo que desempenha um papel antioxidante em C. tubulosa. Os resultados foram baixados e introduzidos no Cytoscape para visualização. Quanto maior o valor de DC, mais escura a cor e quanto maior o valor da pontuação combinada, mais espessa a borda. Descobrimos que RAC-alfa serina/treonina-proteína quinase (AKT1), interlucina-6 (IL6), fator de necrose tumoral (TNF) e fator de crescimento endotelial vascular A (VEGFA) estavam localizados centralmente (Figura 11), indicando que eles eram alvos principais quando os componentes ativos exerciam um efeito antioxidante. É relatado que o equinacosídeo reduz a disfunção mitocondrial através da regulação das proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPK) e AKT e suas formas fosforiladas [43]. Os pesquisadores especularam que o efeito antidiabético dos glicosídeos de C. tubulosa pode ser devido à atividade antioxidante dos PhGs pela regulação negativa de citocinas pró-inflamatórias, como IL-6 e TNF- [44]. Além disso, o equinacosídeo pode prejudicar o crescimento de células de câncer de ovário ao diminuir a expressão de VEGFA para inibir a angiogênese [45], que está intimamente relacionado ao sistema ROS para ROS induzir a expressão da sinalização de VEGF [46].

Figura 10 Rede PPI.

3.4.3. Análise de Enriquecimento e Estabelecimento de Rede CTP

Os potenciais compostos antioxidantes atuaram em inúmeras funções biológicas, incluindo BP, CC e MF. Na Figura 12(a), os 10 principais caminhos são mostrados. Os alvos previstos da rede PPI responderam principalmente a muitos processos biológicos, como compostos cíclicos orgânicos, estímulo xenobiótico, substâncias inorgânicas, níveis de oxigênio e regulação positiva do movimento de componentes celulares. A análise do componente celular mostrou que os genes estavam relacionados principalmente à balsa da membrana, matriz extracelular, lúmen dos grânulos secretores, complexo regulador da transcrição e parte apical da célula. Esses alvos também estão envolvidos em muitas funções moleculares, incluindo ligação do fator de transcrição de ligação ao DNA, atividade de homodimerização de proteínas, ligação específica de domínio de proteína e ligação de receptor de citocina.

Figura 12 Análise de enriquecimento: (a) análise de enriquecimento GO. (b) Análise de enriquecimento KEGG.

Para investigar as funções biológicas desses hubs principais, foi realizada uma análise de enriquecimento de vias. A partir dos resultados do enriquecimento KEGG, um diagrama de bolhas foi desenhado para mostrar os 20 principais caminhos. Quanto maior o ponto, mais genes foram incluídos no caminho. Conforme mostrado na Figura 12(b), as principais vias de C. tubulosa foram relacionadas a vias de câncer, lipídios e aterosclerose, via de sinalização AGE-RAGE em complicações diabéticas, carcinogênese química - ativação de receptores e via de sinalização MAPK. Os efeitos de C. tubulosa na apoptose e na homeostase redox celular foram investigados. Os dados sugerem que C. tubulosa pode ser um candidato promissor para a terapia anti-câncer de cólon [47]. O extrato de C. deserticola é encontrado em pessoas idosas [48].

A Figura 13 ilustra a correlação entre as vias e seus alvos relacionados e a relação entre os genes alvo sobrepostos e os componentes biologicamente ativos de C. tubulosa. Foi gerada uma visão global da rede CTP, composta por 12 ingredientes, 159 alvos e 20 caminhos. A maioria dos alvos foi compartilhada pelos compostos ativos candidatos. Esses princípios ativos candidatos com alto grau de interconexão foram responsáveis ​​pela alta interconexão da rede CTP, especialmente a quercetina (grau = 131). A maioria dos alvos, como AKT1, IL6, TNF e VEGFA, foram mapeados para vias KEGG associadas a vias no câncer.

Figura 13 Rede CTP.

4. Conclusões

Neste estudo, investigamos principalmente situações complexas ao considerar as relações de efeito de espectro entre HM, WE e HR deC. tubulosa. As impressões digitais de HPLC eensaios antioxidantesforam usados ​​para identificar as diferenças entre Hs, WEs e HRs deC. tubulosa. De acordo com as impressões digitais de HPLC, 11 picos eram comuns entre os 11 lotes de Hs, WEs e HRs. ácido geniposídico,equinacosida, verbascoside, tubulósido A, eisoacteosideforam identificados entre esses picos. O conteúdo desses cinco componentes foi determinado. Além disso, os efeitos antioxidantes doC. tubulosaHs, WEs e HRs variaram devido às alterações nas composições químicas causadas por condições complexas de fabricação. Com base em modelos estatísticos diversificados, o estudo da relação espectro-efeito indicou que o pico A6 pode ser o componente mais decisivo entre as três formas deC. tubulosa. O estudo foi baseado em farmacologia de rede para explorar mecanismos potenciais deC. tubulosasobreantioxidaçãopor meio de triagem de compostos, previsão de alvos-chave, construção de redes e condução de análise de enriquecimento. Nossos resultados fornecem uma base teórica para a reciclagem dos resíduos de ervas e o potencial deC. tubulosano tratamento dedoenças relacionadas com antioxidantes.