N-Hidroxicinamoilfenalquilamidas (36H) exibiram ambas as habilidades antioxidação e antitirosinase. O composto foi estudado por suas propriedades antioxidantes, usando um teste de eliminação de 1,1-difenil-2-picrilhidrazul- (DPPH-), uma avaliação do poder antioxidante de redução de íons férricos (FRAP) e uma avaliação de metal- ensaio de poder quelante. Os resultados mostraram que o 36H tinha capacidade antioxidante nos exames de eliminação de DPPH e poder de redução férrica, mas o ensaio de poder quelante não demonstrou capacidade antioxidante. 36H também foi medido para a atividade inibitória da tirosinase aplicando várias plataformas de espécies, incluindo cogumelo in vitro, melanoma de camundongo B16F10 e células de melanócitos humanos. Em termos de supressão de tirosinase de cogumelo in vitro, 36H restringiu os processos de melanogênese. Supõe-se que o 36H bloqueou o sítio ativo da tirosinase como um inibidor competitivo para a tirosinase de cogumelo, não diminuindo a viabilidade celular normal dos melanócitos humanos. Uma reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) e western blot descobriram que o 36H regulou negativamente o RNA e as proteínas relacionadas à melanogênese, incluindo a produção de pigmentos (MITF, tirosinase, TRP-1 e TRP-2) , maturação do melanossoma (Rab27a) e transporte do melanossoma (Myo5a, MLPH e Mreg). No geral, o 36H exibiu as funções biológicas de antioxidação e supressão de melanina, portanto, havia a possibilidade de sua aplicação como aditivo alimentar ou agente de clareamento da pele.

De acordo com estudos relevantes,cistancheé uma erva comum que é conhecida como "o milagreervaque prolonga a vida". Seu principal componente écistanósido, que tem vários efeitos, comoantioxidante, anti-inflamatório, epromoção da função imunológica. O mecanismo entre cistanche epelebranqueamentoreside no efeito antioxidante deglicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação detirosinacatalisado portirosinase, e aoxidaçãoA reação requer a participação de oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contémcistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo,inibindo a produção de melanina.

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1. Introdução

A pele humana é o maior órgão do corpo humano; mantém as funções corporais e previne a perda de água, eletrólitos e biomoléculas. A pele é composta pela epiderme, derme e hipoderme. A epiderme é ainda dividida em cinco camadas separadas: o estrato córneo, o estrato lúcido, o estrato granuloso, o estrato espinhoso e o estrato basal [1]. A camada de base da epiderme, que está ligada à derme, é o estrato basal que contém os melanócitos. Os melanócitos possuem dendritos para transferir melanina para os queratinócitos, que determinam a superfície da cor da pele devido ao conteúdo de melanina dentro desses queratinócitos [2].

Os radicais livres são compostos por um átomo ou um grupo de átomos que possuem um ou mais elétrons desemparelhados. Eles estão envolvidos em reações fisiológicas, metabólicas e imunes e funções de transferência de sinal. Embora façam parte dos processos bioquímicos saudáveis ​​normais do corpo, também são responsáveis ​​pelos danos. Espécies reativas de oxigênio (ROS) e vários radicais livres são estimulados pela geração de ânions superóxidos ou peróxidos de hidrogênio. Isso pode causar mensagens confusas, danos às membranas celulares e danos às comunicações das células iônicas devido à peroxidação lipídica. Isso afeta moléculas intracelulares que apresentam grupos SH e proteínas atuantes e DNA [3]. A quantidade de ROS é controlada pelos sistemas de autodefesa que são mediados por antioxidantes em seu estado normal, como os antioxidantes. Estes incluem vitamina C, vitamina E ou glutationa [4], que eliminam os radicais livres para evitar danos celulares. No entanto, eles interrompem o equilíbrio do estado de oxidação celular, o que resulta em excesso de ROS. Estudos anteriores mostraram que muitas doenças degenerativas, como envelhecimento e câncer, são causadas por espécies ativas de oxigênio ou radicais livres. As propriedades antioxidantes sugerem que a peroxidação de lipídios dentro das membranas dos melanócitos aumenta o conteúdo de glutationa intracelular, o que pode ser responsável pela despigmentação [5, 6].

O escurecimento da pele, olhos e cabelos é causado pela síntese de melanina, que é um biopolímero pigmentado que é sintetizado no melanossoma dos melanócitos. A melanina é um mecanismo de proteção contra danos causados ​​pela luz ultravioleta [7]. Os genes congênitos podem afetar a cor da pele, mas a indução da radiação ultravioleta, a inflamação e as alterações hormonais fazem com que os melanócitos sintetizem mais melanina. No entanto, a superprodução de melanina pode induzir distúrbios de pigmentação, como melasma, lentigo senil, sardas e hiperpigmentação [8]. Estes são geralmente tratados com cosméticos ou ingredientes farmacêuticos que contêm componentes de clareamento da pele. Mesmo que esses elementos sejam de fontes naturais, apenas alguns agentes são usados ​​em cosméticos ou medicamentos por questões de segurança ou de eficácia de clareamento. A melanogênese envolve a ligação do hormônio estimulante de melanócitos à melanocortina-1, que aumenta o monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) e ativa os fatores de transcrição associados à microftalmia (MITF) [9]. O MITF regula positivamente a expressão de uma enzima melanogênica, a tirosinase, que desempenha uma função importante na hidroxilação de L-tirosina em diidroxifenilalanina (L-DOPA) e na oxidação de L-DOPA em dopaquinona [10]. Tratamentos médicos e cosméticos estão usando cada vez mais inibidores da atividade da tirosinase. A produção de melanogênese e a transferência de melanossomas dos melanócitos para os queratinócitos são necessárias para a coloração da pele [11]. Os melanossomas estão ligados ao citoesqueleto de actina na periferia dos melanócitos através do complexo tripartido formado pela proteína relacionada a Ras Rab-27 (Rab27a), melanofilina (MLPH) e miosina Va (Myo5a). Rab27a é uma proteína ligada à membrana envolvida no transporte de proteínas e pequena transdução de sinal mediada por GTPase. A melanofilina forma um complexo ternário com Rab27a no sítio ligado ao GTP com Myo5a, que é a proteína motora. A pigmentação visível do mamífero no cabelo e na pele está de acordo com este complexo de três proteínas para amarrar as organelas produtoras de pigmento. Se a proteína complexa estiver deficiente, a conexão entre a F-actina e o melanossoma é quebrada [12].

Dentro dos compostos com potencial terapêutico positivo, N-hidroxicinamoilfenalquilamidas (36H) são relatados como tendo um efeito inibitório na expressão de metaloproteinases de matriz- (MMP-) 9 em THP-1, uma linha celular monocítica de leucemia humana, que é estimulada pelo fator de necrose tumoral- (TNF-) [7]. Um estudo anterior mostrou que a expressão induzida por TNF de MMP-9 para os níveis de proteína e mRNA foi totalmente inibida de maneira dependente da concentração (1–20 μM). Verificou-se que 36H suprimiu acentuadamente o potencializador do gene do polipeptídeo leve do fator nuclear κ na sinalização de células B (NF-κB), conforme detectado pelo ensaio do gene repórter NF-κB, mas não teve efeito sobre a degradação de (fator nuclear do polipeptídeo leve κ intensificador de gene no inibidor de células B (IκB ) ou a translocação de NF-κB. Dados de imunoprecipitação de cromatina ilustraram que a afiliação entre MMP-9 e o gene promotor da subunidade p65 de NF-κB (p65) foi totalmente negada por 36H e a fosforilação de p65 não foi influenciado. Em geral, um relatório anterior demonstrou que 36H suprimiu a secreção de MMP-9 pela regulação negativa direcionada ao núcleo dos mecanismos da via NF-κB em THP-1. 36H é um análogo do ácido da cafeína fenetil éster (CAPE), que é um conhecido supressor da metástase e invasão do câncer [14]. As atividades antioxidantes e a eliminação de radicais livres de alguns análogos do CAPE foram estudadas, e os resultados desses estudos levaram este estudo a determinar se o 36H reduziu atividade da tirosinase e RNA e proteínas relacionados à melanogênese regulados negativamente. Este estudo descobriu que o 36H é um antioxidante potencial e positivo e um agente de clareamento da pele.

2. Materiais e métodos

2.1. Reagentes e Materiais.Dimetil sulfóxido (DMSO) e L-tirosina foram obtidos da Sigma-Aldrich Chemical Inc. (St. Louis, MO, EUA). O meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e o soro fetal bovino (FBS) foram adquiridos da Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, EUA). Todos os reagentes e tampões alternativos foram adquiridos com a mais alta pureza comercial.

2.2. Síntese Química de 36H.36H foi fornecido pelo professor Yueh-Hsiung Kuo, que usou os métodos subsequentes de acoplamento de ligação de amida para obter os compostos. Benzotriazol-1-iloxitris (dimetilamino)-fosfônio hexafluorofosfato (BOP) foi combinado com uma mistura de R2-NH2, R1-COOH e trietilamina (Et3N) em dimetilformamida (DMF). A solução de reação foi misturada por 3{{1{{3{35}}}}}} min a 0 graus C e depois misturada a 25 graus C por 2 horas. Quando o líquido químico foi evaporado, o resíduo foi dividido entre H2O e acetato de etila (AcOEt). O resíduo foi então filtrado e purificado usando cromatografia em coluna com uma solução eluente (AcOEt–CH2Cl2, 1:1, v/v) em sílica gel (70–230 e 230–400 mesh, Merck 7734). Os produtos foram recristalizados de AcOEt para obter a melhor Medicina Oxidativa e Longevidade Celular e os cristais mais ideais. Um espectrômetro de massa Finnigan TSQ-46C foi usado para a espectrometria de massa por impacto de elétrons (EIMS). Os espectros de 1H e 13C NMR foram obtidos usando um espectrômetro Bruker Avance 500. Um espectrofotômetro Nicolet Magna-IR 550 registrou os espectros de infravermelho. 36H foi inicialmente dissolvido em solução de DMSO antes dos estudos seguintes. Para cada ensaio, DMSO com uma concentração final e constante de 0,2 por cento (v/v) foi usado. Este composto não é conhecido como antioxidante ou clareador de pele [7, 13], e a estrutura é mostrada na Figura 1. As amostras foram dissolvidas em DMSO e várias concentrações foram preparadas com uma concentração final de DMSO inferior a 0,5%.

2.3. Ensaio da capacidade de eliminação de radicais DPPH.DPPH é 2,2-difenil-1-picrilhidrazil, que se torna roxo escuro quando tem um radical livre. Quando o antioxidante elimina o radical do DPPH˙, ele reduz o DPPH˙ a um DPPH estável, que tem uma cor amarelo claro [14]. Várias dosagens de 36H (2 μL no volume total) foram combinadas em 98 μL de mistura de DPPH (60 μM), e a placa foi examinada usando um leitor espectroscópico de ensaio imunoenzimático (ELISA) de 517 nm. O ácido L-ascórbico foi usado como controle positivo. As proporções de DPPH residual foram mapeadas ao lado da amostra para determinar a quantidade de antioxidante que diminui a concentração de DPPH anterior. A propriedade de eliminação (por cento) foi determinada como

2.4. Ensaio de Poder Redutor.O ensaio de poder antioxidante de redução de íons férricos (FRAP) é frequentemente aplicado para avaliar a capacidade antioxidante de bebidas, alimentos, frutas e suplementos nutricionais, incluindo flavonoides ou polifenóis. Várias dosagens de 36H foram introduzidas em uma mistura de tampão fosfato 67 mM (0.085 mL, pH 6,8) e 20 por cento de ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6, 2,5 μL). A solução reagiu por 20 min a 50 graus C e então o ácido tricloroacético (10 por cento, 0,16 mL) foi adicionado à solução antes de ser centrifugado a 3000g por 10 min [14]. O sobrenadante da solução (75 μL) foi combinado com 2 por cento de FeCl3 (25 μL) e, em seguida, um leitor espectroscópico ELISA mediu a absorbância resultante a 700 nm, para uma placa de poço 96-. O hidroxianisol butilado (BHA) foi empregado como controle positivo. Quanto maior a qualificação redutiva, mais forte a absorção.

2.5. Ensaio da Atividade Quelante de Metal.O potencial ferroso quelante de íon da clorofila foi medido usando a técnica de Chen et al. [14]. Resumidamente, dosagens específicas das amostras foram dissolvidas em DMSO e introduzidas em uma mistura de FeCl2·4H2O (2,0 mM, 0,05 mL). A adição de ferrozina (5 mM, 0,2 mL) iniciou a reação quando a solução foi agitada vigorosamente e depois deixada por 10 min a 25 graus C. Quando a reação atingiu o equilíbrio, os valores de absorbância para a solução foram determinados a 560 nm usando um veículo em branco. EDTA foi usado como controle positivo. A fórmula de cálculo da atividade quelante foi idêntica a (1).

2.6. Ensaio da atividade da tirosinase de cogumelo.Tanto a supressão da atividade da tirosinase em cogumelos quanto a inibição da tirosinase celular foram determinadas espectrofotometricamente usando o método anterior, com pequenas modificações [2]. O ácido kójico foi usado como controle positivo para o ensaio de atividade da tirosinase. Os materiais foram primeiro dissolvidos em DMSO aquoso e cultivados em L-tirosina (2,5 mg/mL) com tampão fosfato (50 mm, pH 6,8). Todos os modelos usaram DMSO, o que é irrelevante para a atividade da tirosinase quando o DMSO constitui<0.5% of the total volume. Subsequently, 25 U/mL of mushroom tyrosinase with an identical buffer was then added, and the solution was incubated at 37° C for 30 min. An ELISA spectroscopic reader was used to conduct the absorbance measurements for the assays at 475 nm, using 96-well microplates (Molecular Devices, CA, USA).

2.7. Culturas de células de melanócitos humanos (HMC).Os melanócitos epidérmicos humanos primários do prepúcio neonatal foram adquiridos da Cascade Biologics. Isso também foi aplicado por Wang et al. [2]. Foi cultivado em meio 254 (M-254- 500; Cascade Biologics, Portland, OR, EUA) e aprimorado com suplemento de crescimento de melanócitos humanos (HMGS, cat. número S-002-5). O meio 254 é um meio basal com algumas vitaminas não essenciais e essenciais, compostos orgânicos, aminoácidos, sais inorgânicos e minerais. O suplemento de crescimento de melanócitos humanos incluía soro bovino fetal, insulina bovina, extrato de hipófise bovina, transferrina bovina, hidrocortisona, fator básico de crescimento de fibroblastos, forbol 12-miristato 13-acetato e heparina. Todas as células foram incubadas a 37 graus C em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5 por cento de CO2.

2.8. Determinação da viabilidade celular de HMC.A viabilidade celular foi determinada usando um ensaio MTT [3]. Quando um tetrazol amarelo é combinado com a desidrogenase mitocondrial (ubiquinona) em células vivas, os anéis de tetrazólio do MTT se clivam e se reduzem a formazan roxo. As células foram semeadas a uma densidade de 9 × 103 células/poço em placas de 96-poços. Quando as células foram cultivadas por um dia, o meio foi trocado e diferentes concentrações de 36H foram adicionadas em um volume final de meio de 100 μL. Após incubação por 48 horas, o meio foi substituído por meio fresco (100 μL), incluindo MTT (0,5 mg/mL). A placa foi então cultivada em uma incubadora a 37 graus C por 2 horas com 5% de CO2. DMSO (100 μL) foi então adicionado a cada poço para dissolver os cristais roxos de formazan. Para garantir que as placas atingissem a dissolução máxima, as placas foram agitadas suavemente e misturadas no escuro por 10 min e medidas a 595 nm. O crescimento celular foi calculado como

2.9. Medição da atividade da tirosinase do HMC.Para determinar a atividade da tirosinase em células de melanócitos humanos (HMC) (5 × 104 células por poço), elas foram posicionadas em placas de 12-poços em 1000 μL de meio com diferentes dosagens de 36H e cultivadas por 48 horas [2] . O tampão PBS foi usado para lavar as células tratadas com amostra, e estas foram então lisadas com 1 por cento de Triton X-100/PBS. O extrato enzimático foi então coletado do lisado celular resultante e combinado com 50 μL de L-tirosina 2 mM. Os extratos foram então incubados por 3 horas a 37 graus C no escuro. Um espectrofotômetro foi então usado para determinar sua absorbância a 490 nm.

2.10. Determinação do teor de melanina em HMC.Com algumas pequenas modificações, a técnica anterior também foi utilizada para este experimento [2]. Os sedimentos celulares foram dissolvidos em 2,{2}} N NaOH com 10 por cento de DMSO e aquecidos a 90 graus C durante 1 hora. As suspensões foram separadas por centrifugação por 10 min a 10,000g. Usando um espectrofotômetro, o conteúdo de melanina foi determinado através dos dados produzidos em um nível de absorção de 475 nm.

2.11. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real.Para o qRT-PCR, uma reação de 20 μL continha uma mistura de 0,4 mL de duas transcriptases reversas: 10 μL de 2 × QuantiTect SYBR Green Master Mix (QIAGEN, Valencia , CA, EUA) com a Taq polimerase hot start, 0,8 mL de primers e 0,5 mL (10 ng/mL) do modelo. As sequências de primers estão listadas na Tabela 1. O Sistema StepOnePlus™ foi usado para todos os ensaios de PCR em tempo real. A reação foi concluída realizando a reação de RT a 42 graus C por 20 min e, em seguida, ativando a polimerase FastStart Taq DNA a 95 graus C por 5 min. Isso foi então amplificado por 40 ou 50 ciclos a 95 graus C por 5 segundos para desnaturação, recozimento e aquisição a 60 graus C por 5 segundos. Foi finalmente alongado a 72 graus C por 15 segundos. A fluorescência também pode ser medida após a fase de alongamento, mas para este experimento, foi medida após a fase de recozimento. Com uma 96-placa de poços, 9 μL do lisado foram adicionados a 11 μL da mistura de reação, que consistia em 10,6 μL MasterMix do Eurogentec qPCR core kit para SYBR Green I (1,4 μL de 50 mM MgCl2, 2 μL 10x tampão de reação, 0,8 μL de mistura dNTP 5 mM, 0,6 μL SYBR Green I, 5,7 μL de água livre de nuclease e 0,1 μL de polimerase GoldStar Taq quente), 0,1 μL MS2 RNA, 0,1 μL 10x inibidor de RNAse diluído e 0,1 μL do primer REV (100 μM), bem como o MS2 FWD para ensaios SG-PERT no sistema ABI 7300 qPCR. A reação qRTPCR, ativação da enzima GoldStar Taq quente, amplificação do ciclo 40-, recozimento e aquisição, desnaturação a 95 graus C e alongamento a 72 graus C usaram o instrumento ABI 7300. Para preparar o ensaio, todos os reagentes foram mantidos em um bloco de resfriamento ou em gelo. Reações SGPERT duplicadas foram realizadas em cada amostra de lisado. Usando software e instrumentos qPCR, um ABI 7300 com seu limite determinado manualmente e um LightCycler® 480 com seu método de segunda derivada máxima, gerou os valores do ciclo de quantificação (Cq). Usando o mesmo software para ambos os instrumentos, os picos de fusão também foram calculados automaticamente.

2.12. Western Blotting.Um total de 1 × 105 células foram tratadas com grupos de amostra ou o controle de veículo em branco por dois dias. As células foram colhidas e lisadas com tampão de lise (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 137 mM cloreto de sódio, 50 mM fluoreto de sódio L, 10 mM pirofosfato de sódio, 20 mM - glicerofosfato, 1 mM fenilmetilsulfonil L fluoreto , 1 mM de EDTA, 10 por cento de glicerol, 1 por cento de Nonidet P-40, 2 μM de leupeptina, 0,1 mM de ortovanadato de sódio e 2 ug/mL de aprotinina) [14]. Os lisados ​​foram centrifugados a 20,000 × g por 30 min, e as concentrações de proteína dentro da solução sobrenadante foram determinadas com um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EUA). Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e então eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, EUA). A membrana foi bloqueada por 1 hora com 5% de leite desnatado em tampão PBS-T (PBS contendo 0,1% de Tween 20). O filme de transferência foi cuidadosamente removido do tanque de transferência úmido e do slot de transferência semi-seco e colocado em uma caixa que continha 5% de leite desnatado em 1x TBST por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, foi cuidadosamente lavado com 1x TBST para remover vestígios de leite desnatado. A membrana foi então incubada com os respectivos anticorpos primários. Em cada caso, as membranas foram incubadas com anticorpo anticoelho ou camundongo conjugado com peroxidase de rábano silvestre e, em seguida, tratadas com reagentes de detecção ECL (PerkinElmer, ECL1: ECL2=1: 1). Um sistema de imagem quimioluminescente de tamanho pequeno da Life Science foi usado para medição para detectar as bandas [14].

2.13. Análise Estatística.Três de cada concentração para o padrão e as amostras foram usadas. Utilizando o teste t de Student, os resultados foram comparados estatisticamente e expressos pela média dos valores médios ± desvio padrão (DP).

3. Resultados

3.1. Atividade de eliminação de radicais livres de DPPH.As ROS podem gerar peróxidos lipídicos, danos ao DNA, expressão de proteínas, envelhecimento tecidual e gênese do câncer quando o equilíbrio entre os radicais livres e os antioxidantes inerentes é perturbado. As reações em cadeia dos radicais livres são bloqueadas pela neutralização das doações ou aceitações de elétrons e pela quelação de pares livres livres. Reduzir o estresse oxidativo de facetas intrínsecas e extrínsecas é uma forma de aumentar a saúde. Este estudo examinou as propriedades antioxidantes, determinando o poder redutor férrico, a capacidade de eliminação de radicais livres DPPH e o poder quelante de metais. O aumento da geração e acúmulo de ROS produz oxidação lipídica em alimentos e cosméticos e atividade antioxidante natural. Em particular, as propriedades de eliminação de radicais livres são vitais em aditivos nutricionais funcionais e produtos para cuidados com a pele.

O primeiro ensaio inibitório da oxidação foi o teste de eliminação de radicais livres DPPH. Trata-se de uma plataforma experimental simples e econômica, na qual os antioxidantes atuam na prevenção de produtos de oxidação. Os antioxidantes alteram a cor do reagente radical estável DPPH de roxo para o amarelo claro da difenil-picril-hidrazina. Para determinar as propriedades antioxidantes do 36H, uma dose de 100 μM foi aplicada para determinar a capacidade de eliminação. A Tabela 2 mostra que 36H exibiu excelente capacidade de eliminação de radicais livres e elimina 60 por cento do radical livre DPPH e a vitamina C na mesma concentração (100 μM) elimina 85,3 por cento.

3.2. Potência antioxidante redutora férrica.O segundo ensaio inibitório da oxidação é o teste de poder redutor férrico, que é uma maneira comum e confiável de medir a síntese do complexo Fe(III)-ferricianeto. Um agente funcional reduz os complexos Fe3 mais /ferricianeto à forma ferrosa. Esta combinação tinha uma cor azul em 7{{1{14}}}}0 nm porque K4Fe(CN)6 reagiu com Fe3 plus para formar Fe[Fe(CN)6]3. No experimento, a cor da solução mudou de amarelo claro para diferentes tons de azul e verde, dependendo do poder redutor do composto alvo. A Tabela 2 apresenta que o BHA a 100 μM teve um valor de poder redutor de 0,95 e 36H a 100 μM teve um valor de poder redutor de 0,85 em comparação com o BHA. Portanto, o 36H demonstrou ter um bom poder antioxidante redutor de ferro.

3.3. Capacidade de quelação de íons ferrosos.A atividade quelante para os íons ferrosos do 36H é apresentada na Tabela 2. O EDTA (100 μM) foi utilizado como controle positivo. Fe2 plus e ferrozina formam complexos quantitativamente. A formação de complexos de reagentes é frequentemente interrompida, por causa de agentes quelantes, o que resulta na redução da cor vermelha do complexo. O 36H na dosagem de 10 μM não teve efeito significativo sobre a capacidade de eliminação de Fe2 plus, e na concentração de 100 μM apresentou 43,2 por cento de inibição. O controle positivo, EDTA, tinha aproximadamente 80% de capacidade de quelação de íons a 100 μM.

3.4. Efeito de 36H na Atividade da Tirosinase de Cogumelo.A inibição da atividade da tirosinase foi descrita em numerosos relatos, a maioria dos quais usando a tirosinase de cogumelo como modelo. As vantagens são serem bem desenvolvidas pelos cientistas, procedimentos fáceis, baixo custo, rápido processo de pigmentação, características estruturais e funcionais semelhantes às dos mamíferos e comodidade na observação do desenvolvimento da melanina. A inibição da atividade da tirosinase de cogumelo por 36H foi estudada, e a capacidade inibitória teve uma correlação positiva com a concentração de 36H (Figura 2(a)). No décimo quinto minuto, observou-se que o 36H em diferentes concentrações (1, 5 e 10 mM) em relação ao controle reduz os valores de DO. A atividade enzimática diminui em cerca de 10 por cento a 1 mM, 30 por cento a 5 mM e 40 por cento a 10 mM, em comparação com o controle do veículo (Figura 2(b)). A relação entre a atividade da tirosinase e sua concentração em 36H foi estudada. Diferentes concentrações do inibidor fornecem um grupo de linhas que passam todas pela origem. A inibição da atividade da tirosinase por 36H não afetou a quantidade de enzima, o que ilustrou que 36H era um inibidor reversível (Figura 2(c)). O tipo de inibição da tirosinase por 36H foi confirmado usando um gráfico de duplo recíproco de Lineweaver-Burk. Os gráficos de 1/v versus 1/[s] deram uma família de retas passando pela origem, o que mostrou que 36H era um complexo competitivo. A cinética da enzima é apresentada na Figura 2(d).

3.5. O efeito da viabilidade celular, tirosinase celular e conteúdo de melanina em 36H em HMC.Como um potente composto de clareamento da pele, o componente deve ser inofensivo, sem efeitos colaterais citotóxicos indesejáveis. Existem alguns inibidores da síntese de melanina bem conhecidos, incluindo ácido kójico, arbutina, PTU ou hidroquinona, que estão sendo utilizados globalmente como ingredientes cosméticos atualmente. Também descobrimos que esses inibidores melanogênicos podem induzir tumorigenicidade na pele humana em doses de alta concentração ou uso frequente [2]. HMC foi cultivado em 36H por 48 horas em várias concentrações de 1, 5, 10 e 25 μM, e a viabilidade celular foi determinada para mostrar baixas toxicidades celulares na Figura 3(a). Ao considerar o agente para uso terapêutico ou cosmético em seres humanos, verificamos que as consequências citotóxicas sobre as viabilidades celulares dérmicas humanas foram insignificantes. Para entender o efeito inibitório do 36H na melanogênese, avaliamos a atividade da tirosinase intracelular no HMC. Os resultados para a atividade da tirosinase em HMC mostraram que houve uma variação óbvia conforme a concentração aumentou, e a atividade da tirosinase diminuiu para baixa toxicidade celular. Após o tratamento, a atividade da tirosinase foi reduzida para 39 ± 2,2% a 25 μM de maneira dose-dependente (Figura 3(b)). Esses resultados mostraram que o 36H inibiu a atividade da tirosinase intracelular. Os resultados do ensaio de melanina mostraram claramente que 36H reduz o conteúdo de melanina em HMC de maneira dependente da dose (Figura 3(c)). A porcentagem de controle representa o conteúdo de melanina. Após o tratamento, o conteúdo de melanina foi de 77% a 25 μM, 84% a 10 μM, 88% a 5 μM e 90% a 1 μM. Esses resultados mostraram que 36H teve um efeito inibitório significativo na síntese de melanina em HMC a 25 μM.

3.6. O mRNA e as proteínas relacionadas à biossíntese de melanina foram influenciados por 36H em HMC.A biossíntese da melanina ocorre nos melanossomos, e o substrato inicial do aminoácido é a tirosina. A tirosina é primeiro catalisada para L-DOPA via tirosinase e, usando a mesma enzima, tirosinase, a DOPA é catalisada para dopaquinona. A dopaquinona é catalisada pela dopacromo tautomerase (proteína relacionada à tirosinase- 2, TRP-2), TRP-1 e tirosinase para formar a eumelanina. Em HMC, 36H regulou negativamente os RNAs e proteínas relacionados à melanogênese celular, conforme demonstrado na Figura 4.

3.7. Efeito do 36H na Maturação do Melanossoma.O melanossoma é uma organela que depende da síntese de melanina dentro dos melanócitos. Quanto mais melanossomas amadurecem, mais melanina é formada. Portanto, a maturação do melanossoma é importante no mecanismo de clareamento da pele. A proteína pré-melanossoma 17 (Pmel17) é direcionada para os precursores da organela do pigmento, o melanossoma, onde é processada proteoliticamente em vários pequenos fragmentos. Alguns desses fragmentos formam amiloides não patológicos que se agrupam em lâminas e formam o padrão estriado subjacente à ultraestrutura do melanoma. Este estudo demonstrou que o 36H regulou negativamente o RNA Pmel17 e a expressão da proteína no HMC (Figura 5).

3.8. Efeito do 36H no Transporte de Melanossomas.Rab27a, MLPH e Myo5a formam um complexo triproteico para ligar os melanossomas nas periferias dos melanócitos. No processo de transporte do melanossoma, o complexo ternário é a conexão entre o citoesqueleto de actina e o melanossomo. A falta dessas proteínas afeta o transporte, e a melanoregulina (Mreg) conduz a transferência de melanossomas de melanócitos para queratinócitos por meio de um mecanismo de descamação regulado. Este estudo ilustrou que o 36H diminuiu o transporte do melanossoma afetando este RNA e proteínas relacionados (Figura 6).

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