3. Discussão

Embora o ZER exiba uma variedade de funções biológicas, incluindo atividades anti-inflamatórias, anticancerígenas e antimicrobianas, suas propriedades anti-melanogênicas não foram relatadas [12]. No estudo atual, demonstramos pela primeira vez que o extrato de Zingiber officinal (ZO) e seu ingrediente ativo, ZER, têm um forte efeito inibitório na melanogênese induzida pelo hormônio estimulante de -melanócitos (-MSH).

De acordo com estudos relevantes, a cistanche é uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu componente principal écistanósido, que tem vários efeitos, comoantioxidante, anti-inflamatório, epromoção da função imunológica. O mecanismo entre cistanche e clareamento da pele reside no efeito antioxidante dos glicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação da tirosina catalisada portirosinase, e a reação de oxidação requer a participação de oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afetaprodução de melanina.Cistanche contémcistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo,inibindo a produção de melanina.

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A melanogênese anormalmente aumentada causada por irradiação ultravioleta (UV), citocinas inflamatórias e sinalização hormonal está intimamente associada a distúrbios de pigmentação, como cloasma e sardas [4]. Após a exposição aos raios UV, os queratinócitos secretam -MSH, que estimula a biogênese da melanina nos melanócitos epidérmicos [1]. No presente estudo, demonstramos que o extrato metanólico da raiz de Zingiber officinal (ZO) e ZER suprime fortemente o acúmulo de melanina induzido por -MSH. A comparação dos efeitos inibitórios do arbutin, que é um produto químico anti-melanogênico bem conhecido, e do ZER no acúmulo de melanina mostrou que o ZER na concentração de 10 µM exibe um efeito anti-melanogênico aproximadamente 40% mais forte do que o arbutin em células melanogênicas de camundongos B16F10 tratados com -MSH .

Vários estudos bioquímicos mostraram que o óleo essencial de rizomas Zingiber zerumbet contém uma grande quantidade de ZER, representando aproximadamente 13–70 por cento do conteúdo de ZER da planta. No entanto, pequenas quantidades de ZER também estão presentes no Zingiber officinal [20]. Curiosamente, relatórios anteriores mostraram que Zingiber zerumbet cultivado no sul da Índia contém 76,3 a 84,8% de ZER. No entanto, uma fazenda de silvicultura na Índia mostrou que 1,81% de conteúdo de ZER foi encontrado no rizoma, 0,16% na raiz e 0,09% na folha de Zingiber zerumbet [12]. Portanto, esses antecedentes sugerem que as diferenças no conteúdo ZER de Zingiber zerumbet podem não estar correlacionadas com variações geográficas ou ecológicas, mas sim devido a diferenças no quimiotipo ZER [12]. Se sim, por que o ZO tem atividade antimelanogênica? Pode-se sugerir a possibilidade de que outros componentes ativos de ZO, diferentes de ZER, possam suprimir a melanogênese. De fato, um relatório anterior mostrou que o óleo essencial de rizoma de Zingiber officinal contém vários componentes bioativos, como -pineno, valenceno e zingibereno [21]. Além disso, efeitos anti-melanogênicos de -pineno e valenceno também foram observados em células de melanoma de camundongo B16F10 [22,23]. Além disso, observou-se que o efeito inibitório da melanogênese da [6]-escola, a principal escola nos rizomas officinais de Zingiber, ocorre através da aceleração da degradação do MITF mediada por ERK1/2-[24]. Esses relatórios anteriores suportam nosso resultado de que vários tipos de componentes ativos de ZO, bem como de ZER, têm atividade antimelanogênica.

O fator de transcrição associado à microftalmia (MITF) é um fator essencial para a melanogênese, facilitando a transcrição de genes, como tirosinase, proteína relacionada à tirosinase 1 (TYRP1) e proteína relacionada à tirosinase 2 (TYRP2), que são necessários para a biossíntese da melanina e transporte [2,25]. Após a irradiação UV, -MSH derivado de queratinócitos ativa o MITF e regula positivamente a expressão de seus genes-alvo através do eixo de sinalização da proteína quinase A (PKA)-cAMP (CREB) [25]. Além disso, vários fatores de transcrição, como SOX10 e LEF1, ativam a atividade transcricional do MITF [26]. SOX10 (Y-box 10 da região determinante do sexo) pode se ligar ao promotor MITF entre -264 e -266 e aumentar a transcrição do MITF [27]. O LEF1 (fator 1 de ligação ao intensificador linfóide) também coopera transcricionalmente com o MITF como um ativador não ligado ao DNA para promover a expressão do gene MITF na sinalização Wnt (tipo sem asas) [28]. A modificação pós-traducional do MITF, como fosforilação e acetilação, pode regular a estabilidade e a atividade da proteína [26]. Especialmente, a fosforilação de MITF em Ser73, onde a sequência PEST promotora de degradação está presente, leva à degradação de MITF dependente de proteassoma em resposta à irradiação UV [17]. A degradação de MITF dependente de proteassoma também é causada pela fosforilação de MITF em Ser409 [18]. A fosforilação de Ser73 e Ser409 que promove a degradação do MITF é dependente da ativação da via ERK1/2 [17,18]. No presente estudo, descobrimos que ZER suprime a expressão de MITF e seus genes-alvo, como tirosinase, TYRP1 e TYRP2 mediante estimulação de -MSH, independente da via de sinalização PKA-CREB (Figura 6). De fato, nossos resultados mostraram que o ZER, mas não o arbutin e o ácido kójico, é suficiente para reduzir os níveis de mRNA da tirosinase induzida por -MSH e os níveis de expressão da proteína (Figura 2). Esses resultados demonstram que ZER suprime a melanogênese por meio da regulação negativa da transcrição mediada por MITF de genes melanogênicos e sua expressão proteica. A degradação de MITF mediada por ubiquitina é parcialmente regulada pela ativação sustentada de quinases reguladas por sinal extracelular (ERK1/2) [6,7]. Nossos resultados mostraram que o extrato officinal de Zingiber (ZO) e ZER aumentam a fosforilação de ERK1/2 e diminuem o acúmulo de melanina em células B16F10. Além disso, o inibidor seletivo da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), U0126, restaurou efetivamente o conteúdo de melanina, diminuído por ZER, sugerindo que a sinalização ERK1/2 está associada ao efeito antimelanogênico do extrato de Zingiber officinal (ZO) e zerumbone.

A diminuição da fosforilação de ERK1/2 por ZER em carcinoma hepatocelular e células de macrófagos U937 foi observada anteriormente [29]. Além disso, o extrato de etanol de rizomas de Zingiber zerumbet demonstrou suprimir a fosforilação de ERK1/2 em retinas diabéticas [30]. Em contraste, neste estudo, descobrimos que ZER aumenta a fosforilação de ERK1/2, mas não de MEK, de maneira dose-dependente (Figura 3A). Consistente com nosso resultado, um relatório anterior mostrou que 6-gingerol e 6-school, que são os principais componentes ativos do gengibre, atenuam a fosforilação de ERK1/2 induzida pelo fator de crescimento nervoso (NGF) no hipocampo de camundongos [31]. Além disso, outras evidências experimentais mostraram que ZER e 6-shogaol aceleram a fosforilação de ERK1/2 em monócitos THP-1 e células de melanoma B16F10 de camundongo, respectivamente [24,32]. Além disso, em células de melanoma B16BL6 de camundongos que foram tratadas com isosakuranetin, um flavonóide 40 -O-metilado, uma diminuição da fosforilação do MITF e aumento da estabilidade do MITF foram observados através da supressão de ERK1/2 que subsequentemente estimula a melanogênese [33 ]. Assim, sugerimos fortemente que a ativação de ERK1/2 induzida por extratos de ZER e ZO pode ser a razão para o aumento da fosforilação do MITF e sua desestabilização, o que leva à supressão da melanogênese. No entanto, uma extensa investigação é necessária para abordar essas controvérsias sobre os extratos de Zingiber e seus componentes fosforilam ERK1/2 de forma diferente em vários tipos de células ou tecidos. Como a MEK é a principal quinase upstream [34] que fosforila ERK1/2 após a sinalização de crescimento oncogênico, considerou-se que ZER também altera a atividade da quinase upstream ERK1/2. No entanto, nossos resultados mostram que ZER não afeta a fosforilação de MEK. Assim, existem duas hipóteses para explicar o mecanismo molecular de ação do ZER. (1) ZER interage diretamente e inibe a atividade quinase de MEK através de um mecanismo inibitório competitivo ou alostérico, e (2) Existem moléculas sinalizadoras desconhecidas que direta ou indiretamente são afetadas por ZER e atuam como ativadores de ERK1/2. Curiosamente, relatórios anteriores mostraram que ZER causa estresse oxidativo através da depleção de glutationa intracelular (GSH) e indução de espécies reativas de oxigênio intracelular (ROS) em células de câncer colorretal e pancreático, respectivamente [35,36]. Além disso, também foi relatado que o aumento de ERO intracelular modula a fosforilação de ERK1/2 por meio da supressão da fosfatase 3 específica dupla (DUSP3) pela oxidação de Cys-124 [37]. Uma hipótese possível seria que o aumento do estresse oxidativo e a supressão de DUSP3 por ZER possam estar envolvidos na fosforilação de ERK1/2. Além disso, Chen et al. propuseram que o ZER atenua o acúmulo intracelular de óxido nítrico (NO) suprimindo as vias de sinalização de NF-κB e iNOS, o que evita que a córnea de camundongos sofra fotoceratite induzida por UVB [38]. O óxido nítrico (NO) é um fator estimulador da melanogênese que é liberado de melanócitos e queratinócitos após irradiação UV e citocinas pró-inflamatórias [39,40]. Essa literatura sugere a possibilidade de ZER atenuar a melanogênese induzida por -MSH pela manutenção do NO intracelular. Portanto, um estudo estendido para demonstrar o mecanismo molecular através do qual o ZER ativa a via de sinalização ERK1/2 pode fornecer embasamento científico para o desenvolvimento de cosméticos para clareamento da pele.

O ZER tem múltiplas funções biológicas, como anti-inflamatório [41], antimicrobiano [42], antioxidante [43] e antialérgico [44]. A exposição prolongada à irradiação ultravioleta A (UVA) causa distúrbios dermatológicos relacionados ao fotoenvelhecimento, como rugas e câncer de pele, pelo acúmulo excessivo de espécies reativas de oxigênio (ROS) [2]. Um relatório anterior mostrou que ZER exerce citoproteção contra danos celulares induzidos por radiação UVA em queratinócitos da pele, aumentando a expressão gênica de antioxidantes mediada por fator nuclear (derivado de eritróide 2) semelhante a 2 (Nrf2) [1]. Nossos dados sugerem que o ZER, como constituinte ativo do extrato ZO, pode ser usado para tratar distúrbios dermatológicos, como câncer de pele, rugas e hiperpigmentação, causados ​​pela irradiação UV. Embora aqui tenhamos mostrado o efeito antimelanogênico do extrato de ZER e ZO em células de melanoma de camundongos B16F10 e G361 humanas, suas atividades antimelanogênicas devem ser avaliadas em melanócitos primários humanos antes de serem consideradas em cosméticos para clareamento da pele.

4. Materiais e Métodos

4.1. Reagentes e Anticorpos

Anticorpos contra MITF (#12590), p-AKTS473 (#4060), p-CREB (#9398), p-ERK1/2 (#4370), ERK1/2 (#9102), p-MEK (#9154), MEK (#9122) e o inibidor de ERK1/2 U0126 foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Anti-Tirosinase (sc-7833) e -tubulina (sc-9104) foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA). Anti-TYRP2 (DCT, ab74073) foi adquirido da Abcam (Cambridge, Reino Unido). Zerumbone (Z3902), arbutina (A4256), ácido kójico (K3125), -MSH (M4135) e L-DOPA (333786) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Uma solução estoque de hormônio estimulante de melanócitos foi preparada em solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes do tratamento. O SCF humano recombinante foi obtido da R&D systems (Minneapolis, MN, EUA) e sua solução estoque (10 µM) foi preparada em PBS. Soluções estoque de zerumbone (20 mM), arbutina (1 M) e ácido kójico (0,2 M) foram preparadas em dimetil sulfóxido (DMSO). O extrato officinal liofilizado de Zingiber (035-061), isolado por 99 por cento de metanol, foi obtido do Korea Plant Extract Bank (KPEB) (Daejeon, Korea) e do Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) (Daejeon, Korea). Uma solução estoque de extrato officinal de Zingiber foi preparada em DMSO antes do tratamento.

4.2. Cultura Celular e Ensaio de Viabilidade Celular

4.3. Immunoblotting e Imunoprecipitação

A imunoprecipitação foi realizada para detectar se o MITF endógeno é fosforilado em Ser73. 1 mg de lisados ​​​​celulares foram incubados com 1 µg de anticorpo anti-fosfo-MITF (pSer73; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) por 16 h a 4 ◦C, seguido de incubação com 20 µL de proteína A/ Contas de G-agarose (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) por 3 h a 4 ◦C. As proteínas precipitadas foram eluídas em tampão de amostra SDS e, em seguida, a proteína MITF fosforilada (Ser73) foi medida por imunotransferência usando um anticorpo anti-p-MITF (pSer73). Immunoblotting foi realizado, conforme descrito anteriormente [4]. Resumidamente, amostras de proteínas totais foram preparadas usando tampão de lise, contendo 1% de NP-40 (Nonidet P-40), 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de NaF e um coquetel inibidor de protease. A eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) foi usada para separar as proteínas em cada amostra com base em seu peso molecular. As proteínas separadas foram então transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Burlington, MA, EUA). As membranas com proteínas transferidas foram então incubadas com anticorpos primários (1:1000) e anticorpos secundários (1:10.000) a 4 ◦C ou temperatura ambiente. Um kit Chemiluminescent ECL Prime (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EUA) foi usado para visualizar as expressões de proteínas.

4.4. Medição do conteúdo de melanina intracelular e extracelular 

O conteúdo de melanina intracelular e extracelular foi medido e analisado, conforme descrito anteriormente [3]. Células B16F10 melanogênicas de camundongo foram cultivadas com DMEM sem vermelho de fenol. As células foram então pré-tratadas com -MSH (0,1 mM) por 1 h para promover a estimulação melanogênica e incubadas com zerumbone por três dias. Após a incubação, o meio de cultura foi transferido para tubos novos e as células cultivadas foram colhidas e dissolvidas em NaOH 1 N contendo 10 por cento de DMSO a 80 ◦C por 1 h. O conteúdo de melanina do meio de cultura e extratos celulares foi medido a 475 nm (OD475) usando um leitor de absorbância. O conteúdo de melanina foi então normalizado para a concentração de proteína celular.

4.5. RT-PCR Quantitativo

A PCR quantitativa em tempo real foi realizada conforme descrito anteriormente [4]. Resumidamente, um kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA) e RNA total (2 µg) foram usados ​​para a síntese de cDNA. SYBR Green PCR Master MIX (Dynebio, Seongnam, Coréia) foi usado para PCR quantitativo. A sequência dos primers de PCR 50 e 30 foi a seguinte: TCAAGTTTCCAGAGACGGGT e CATCATCAGCCTGGAATCAA para MITF; ATAGGTGCATTGGCTTTCTGG e TCTTCACCATGCTTTTGTGG para tirosinase; CTCATCAAAGATGGCGTCTG e CTTCCTGAATGGGACCAATG para TYRP1.

4.6. Ensaio de atividade de tirosinase celular

Células B16F10 melanogênicas de camundongo foram incubadas com 0,1 mM de -MSH na ausência ou presença de zerumbona, arbutina, ácido kójico e extrato de Zingiber officinal (ZO), conforme indicado. As células cultivadas foram então lavadas e lisadas usando PBS frio contendo 1% de Triton X-100, e a atividade enzimática da tirosinase foi medida usando a metodologia descrita anteriormente [4].

4.7. Análise estatística

5. Conclusões

As principais descobertas deste estudo são que o extrato de Zingiber officinal (ZO) e seu ingrediente ativo, zerumbone (ZER), (i) atenua o acúmulo de melanina após a estimulação de -MSH; e, (ii) diminuir a expressão do fator de transcrição associado à melanogênese, MITF, e seus genes-alvo ativando ERK1/2 independente da via de sinalização PKA-CREB (Figura 6). Esses resultados, portanto, sugerem que o extrato de Zingiber officinal (ZO) continha ZER, como ingrediente ativo, o que seria útil no desenvolvimento de cosméticos dermatológicos e produtos para clareamento da pele.

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