Sistema mediador de lacase usando um mediador natural como agente clareador para a descoloração da melanina parte 1

Abstrato: Neste estudo, um sistema mediador de lacase (LMS) usando um mediador natural foi desenvolvido como agente clareador para descoloração da melanina. Sete mediadores naturais foram usados ​​para substituir os mediadores sintéticos e superar com sucesso o baixo potencial redox da lacase e o acesso limitado da melanina ao sítio ativo da lacase. A atividade de descoloração da melanina de lacases de Trametes versicolor (lacT) e Myceliophthora thermophila (lacM) foi significativamente aumentada usando mediadores naturais, incluindo acetosiringona, siringaldeído e acetovanilona, ​​que mostraram baixa citotoxicidade. Os grupos metoxi e cetona de mediadores naturais desempenham um papel importante na descoloração da melanina. As constantes de especificidade de lacT e lacM para a descoloração da melanina foram aumentadas em 247 e 334, respectivamente, quando a acetosiringona foi usada como mediador. O LMS usando renda e acetosiringona também pode descolorir a melanina presente no filme de hidrogel de celulose, que imita a condição da pele. Além disso, o LMS pode descolorir não apenas os análogos sintéticos da eumelanina preparados pela oxidação da tirosina, mas também a melanina natural produzida pelas células do melanoma.

De acordo com estudos relevantes,cistancheé uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu componente principal écistanósido, que tem vários efeitos, comoantioxidante, anti-inflamatório, epromoção da função imunológica. O mecanismo entre cistanche eClareamento da pelereside no efeito antioxidante do cistancheglicosídeos. Melaninana pele humana é produzido pela oxidação da tirosina catalisada portirosinase, e a reação de oxidação requer a participação de oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contémcistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo,inibindo a produção de melanina.

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1. Introdução

Lacases (EC 1.10.3.2, benzenediol: dioxygen oxidorredutases) são proteínas multicobre que catalisam a oxidação de vários compostos fenólicos e não fenólicos através de um mecanismo de reação catalisada por radicais pela redução do oxigênio molecular [1,2]. As lacases têm sido usadas como biocatalisadores para processos de biodegradação, como a biorremediação de corantes [3,4], produtos farmacêuticos [5,6], herbicidas [7] e deslignificação [8-10]. As lacases também têm sido usadas para catalisar a polimerização de precursores de corantes e compostos orgânicos [11]. Em particular, suas propriedades atraentes, como baixa especificidade de substrato, uso de oxigênio como aceptor final de elétrons, geração de água como subproduto e nenhuma demanda (ou nenhuma produção) de peróxidos, os tornam interessantes em biotecnologia e campos ambientais [1,11,12].

Quatro íons de cobre no sítio ativo estão envolvidos na atividade catalítica da lacase. O cobre "azul" (local T1) oxida o substrato, e o aglomerado de cobre trinuclear (T2/T3) recebe os elétrons do local T1 para reduzir o oxigênio molecular [1,12,13]. Em particular, o potencial redox do sítio T1 Cu é considerado um fator importante na determinação da capacidade catalítica das lacases [14]. Lacases possuem um potencial redox relativamente baixo (0.4–0.8 V) em comparação com peroxidases ligninolíticas (mais de 1 V), como manganês peroxidase e lignina peroxidase. As lacases não podem oxidar diretamente substratos não fenólicos com um potencial redox acima de 1,3 V [13,14]. Portanto, para superar as limitações da lacase, sistemas mediadores de lacase (LMS) usando compostos moleculares pequenos, como 2,20 -azinobis(3- etilbenztiazolina-6-sulfonato) (ABTS), { {24}}hidroxi benzotriazol (HOBt), ácido violúrico (VLA), N-hidroxi ftalimida (HPI), N-hidroxi acetanilida (NHA) e TEMPO, que atuam como mediadores redox, foram sugeridos [15-17].

Esses mediadores permitem a oxidação de compostos volumosos através de diferentes rotas de oxidação. O sistema lacase-ABTS oxida substratos gerando um radical ABTS catiônico por meio de um mecanismo de transferência de elétrons (ET). LMSs com HOBt, VLA, HPI ou NHA produzem radicais nitroxil através do mecanismo de transferência de átomo de hidrogênio (HAT) [1,12,17]. Além disso, mediadores como o TEMPO e seus análogos reagem por vias iônicas para gerar íons oxoamônio [1,12,18]. O uso desses mediadores pode oxidar uma ampla gama de compostos em várias aplicações, como degradação de corantes [3,4], degradação de drogas [5,6] e degradação de lignina [8-10]. No entanto, as aplicações de mediadores sintéticos em campos industriais têm sido limitadas devido à sua potencial toxicidade, alto custo e efeito de inativação de enzimas. Recentemente, moléculas fenólicas derivadas de lignina como mediadores naturais (por exemplo, siringaldeído, acetosiringona, vanilina, acetovanilona, ​​metil baunilhado, ácido ferúlico, ácido sinápico, ácido p-cumárico, etc.) foram estudadas para substituir mediadores sintéticos [1,12] . As vantagens dos mediadores naturais são o baixo custo e a baixa toxicidade por serem obtidos de fontes naturais e renováveis ​​[19].

A melanina é um grupo de pigmentos naturais produzidos pela melanogênese através da polimerização oxidativa da tirosina pelos melanócitos. A melanina natural pode ser classificada em cinco categorias de eumelanina, feomelanina, melanina total, feomelanina e neuromelanina. Recentemente, várias aplicações médicas e eletroquímicas usando melanina ou precursores de melanina foram estudadas [20,21]. A cor da pele humana é determinada principalmente pela presença de melanina. Na indústria cosmética, a despigmentação direta da melanina por meio de enzimas tem sido proposta para o desenvolvimento de agentes clareadores da pele. Várias peroxidases têm sido estudadas para descolorir a melanina. Woo e outros. mostraram que a melanina sintética pode ser diretamente descolorida pela lignina peroxidase de P. chrysosporium [22]. Os grupos Keneko e Mohorˇciˇc também relataram a descoloração enzimática da melanina pela manganês peroxidase isolada de fungos (Sporotrichum pruinose e Phlebia radiata) [23,24]. Kim e outros. relataram que misturas enzimáticas brutas contendo peroxidase de manganês, peroxidase de lignina e lacase mostraram atividade de despigmentação da melanina [25]. Quando as peroxidases descolorem a melanina, elas requerem peróxido de hidrogênio (H2O2) como cofator que pode irritar a pele. Assim, para reduzir o uso de H2O2, glicose oxidase ou lacase foi introduzida no sistema de combinação de enzimas [26,27]. Lacases podem descolorir a melanina sem o uso de peróxido de hidrogênio. Khammuang e Sarnthima relataram que a lacase de Lentinus polycarpous Lév mostrou atividade de descoloração da melanina usando ABTS, vanilina e ácido vanílico como mediadores [28].

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais

2.2. Descoloração de melanina por LMS

A solução saturada de melanina (1,4 mg/mL) foi preparada pela dissolução de 3 mg de melanina sintética em 1,3 mL de NaOH 10 mM. A solução foi centrifugada a 8500 rpm por 5 min para remover a melanina não dissolvida, e o sobrenadante foi diluído com 0.1 M tampão fosfato de ácido cítrico (pH 3, 4, 5, 5.5, 6 ou 7) e usado como uma solução de substrato para LMS. A concentração de melanina na solução de substrato foi de 63 µg/mL e confirmada espectrofotometricamente em 475 nm. A solução de 0,8 mL de substrato de melanina foi misturada com 0,1 mL de solução de mediador (0–1 mM) em um tubo Eppendorf de 1,5 mL. A reação de descoloração da melanina foi iniciada adicionando 0,1 mL de solução de lacase (15,8 µg (0,6 U) lacT ou 19,2 µg (1,8 U) lacM) a uma mistura de melanina e o mediador a 25 ◦C em banho-maria agitado a 120 rpm . Após a reação, a mistura reacional foi centrifugada e a absorbância do sobrenadante foi medida a 475 nm. O rendimento de descoloração (por cento) foi calculado usando a seguinte equação:

Descoloração ( por cento ) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Estudo cinético da descoloração da melanina por LMS

2.4. Citotoxicidade de Mediadores Naturais

A linha celular de melanoma B16F10 (Korea Cell Line Bank, Seul, Coréia) foi usada para determinar a citotoxicidade de mediadores naturais para LMS. Um ensaio de vermelho neutro (NR) foi realizado para medir a citotoxicidade dos mediadores [29]. NR mede a viabilidade de lisossomos de células vivas. Células de melanoma com uma concentração de 3 × 104 células foram dispensadas em cada poço de uma placa de poço 96-. Após 24 h de cultivo, as células foram tratadas com mediadores naturais (1, 2, 5, 10, 22 e 46 mM). Após cultivo adicional por 2 dias, as células foram tratadas com 50 µg/mL de solução de NR dissolvida em DMEM e incubadas por 3 h. Após a remoção do sobrenadante por sucção, uma solução de dessorção de NR (1 por cento de ácido acético glacial, 49 por cento de etanol e 50 por cento de água destilada) foi usada para extração de cor. Após o processo de extração, a mudança na absorbância foi medida em 540 nm.

2.5. Preparação e descoloração do filme de hidrogel de melanina/celulose

Para medir a atividade de descoloração do LMS para o filme de melanina/celulose, o filme de hidrogel preparado foi cortado em uma folha de 1 × 2 cm. O filme de hidrogel foi imerso em 4 mL de 0,1 M de tampão fosfato de ácido cítrico (pH 5,5); subsequentemente, 0,5 mL de acetosiringona 1 mM e 0,5 mL de solução de renda (2,5 U) foram adicionados ao tampão. A reação de descoloração foi realizada em banho-maria com agitação a 120 pm e 25 ◦C por 3 h. Após a reação, o filme foi lavado com água destilada e anexado ao lado interno da cubeta para medir a mudança no espectro na faixa de 400-800 nm usando um espectrofotômetro UV/Vis. As reações de controle sem lacM ou mediadores também foram conduzidas nas mesmas condições. A liberação da melanina do filme ou mudança de cor do filme de melanina/celulose não foi detectada nas condições de reação. Além disso, a mudança nos parâmetros de cor (valores L*, a* e b*) do filme de melanina/celulose após a reação de descoloração por LMS também foi registrada usando um colorímetro (KONICA MI NOLTA, Tóquio, Japão). Os valores ∆L (diferença métrica de luminosidade), ∆E (diferença total de cor), YI (índice de amarelo) e WI (índice de brancura) foram obtidos usando as seguintes equações [30-32]:

2.6. Preparação de Melanina Natural

A melanina natural foi obtida a partir de células de melanoma B16F10. As células foram tratadas com hormônio estimulante de alfa-melanócitos para produzir melanina. Após 4 dias de incubação, as células foram capturadas com tripsina-EDTA e sonicadas por 10 min. O sobrenadante foi obtido por centrifugação a 8.000 rpm por 10 min e, em seguida, ajustado para pH 1,5 usando HCl 6 M. A solução foi fervida a 100 ◦C por 4 h para hidrolisar as frações protéicas residuais. A solução contendo melanina natural foi lavada com acetona, seguida de clorofórmio e etanol, e então lavada com água deionizada para eliminar resíduos, como células, componentes do meio e frações protéicas [33,34]. Todos os processos de lavagem foram realizados mais de duas vezes. Por fim, a melanina natural foi obtida por liofilização e utilizada como substrato para LMS.

3 Resultados e discussão

3.1. O efeito dos mediadores na descoloração da melanina por LMS

O efeito de vários mediadores na reação de descoloração da melanina por LMS foi investigado usando duas lacases de T. versicolor (lacT) e M. thermophila (lacM) (Figura 1).Quando lacT foi usado sem um mediador para a descoloração da melanina, o rendimento da descoloração foi de apenas 1 por cento após 5 h de reação. Quando HOBt foi usado como mediador para lacT, o rendimento da descoloração aumentou ligeiramente para 2% após 5 h de reação. O uso de vários mediadores sintéticos, como HOBt, ABTS, VLA e TEMPO, na oxidação catalisada por lacase de compostos fenólicos ou não fenólicos aumentou significativamente as taxas de reação [10,15]. Quando o acesso de compostos alvo no sítio ativo da lacase é limitado por seu impedimento estérico, os radicais mediadores formados pela lacase podem oxidar eficientemente os compostos alvo pela transferência de elétrons ou mecanismo de transferência de átomo de hidrogênio [12]. O HOBt é um dos mediadores sintéticos mais comumente usados ​​em LMS devido ao seu alto potencial redox (1,1 V) [6]. No entanto, HOBt não é um bom ingrediente cosmético por causa de sua potencial toxicidade celular e capacidade de inativar a lacase. Assim, selecionamos sete mediadores naturais, acetosiringona, siringaldeído, ácido p-cumárico, vanilina, ácido vanílico, álcool vanílico e acetovanilona, ​​para a reação de descoloração da melanina por LMS. Curiosamente, todos os mediadores naturais atuam como mediadores mais eficientes do que o HOBt para a descoloração da melanina por falta. Quando acetosiringona, siringaldeído e ácido p-cumárico foram usados, os rendimentos de descoloração foram de 28 por cento, 22 por cento e 18 por cento, respectivamente, após 5 h de reação. Esses resultados demonstram a utilidade de mediadores naturais para a reação de descoloração da melanina por LMS. Os mediadores no LMS são oxidados a radicais mediadores pela lacase, e os radicais mediadores induzem a oxidação e descoloração da melanina. Quando a falta foi usada sem um mediador para a descoloração da melanina durante um tempo de reação suficiente, que poderia atingir o estado de equilíbrio, o rendimento da descoloração foi de 7 por cento após 24 h de reação. Os mediadores naturais, exceto o ácido vanílico, atuam como mediadores mais eficientes que o HOBt para a descoloração da melanina pelo lacT após 24 h de reação. O rendimento da descoloração após 24 h de reação usando ácido vanílico como mediador foi menor do que após 5 h de reação. Isso pode ser causado pela baixa estabilidade da forma radical oxidada do ácido vanílico. Quando acetosiringona, siringaldeído e acetovanilona foram usados, os rendimentos de descoloração foram de 34%, 30% e 31%, respectivamente, após 24 horas de reação. O ácido p-cumárico foi mais eficiente em aumentar a taxa de reação inicial do que a acetovanilona, ​​enquanto a acetovanilona induziu um maior rendimento de descoloração no estado de equilíbrio do que o ácido p-cumárico.

O efeito do mediador na reação de descoloração por LMS usando lacM também foi muito semelhante ao obtido por LMS usando lacT. Quando o laço foi usado sem um mediador para a descoloração da melanina, o rendimento da descoloração foi de apenas 2% após 5 h de reação. HOBt como mediador para lacM não aumentou o rendimento de descoloração durante a reação de 5 h. Todos os mediadores naturais, exceto ácido p-cumárico e vanilina, atuaram como mediadores eficientes da descoloração da melanina por lacM. Quando acetosiringona e siringaldeído foram usados, os rendimentos de descoloração foram de 25 por cento e 22 por cento, respectivamente, após 5 h de reação. O ácido p-cumárico e a vanilina foram usados ​​como mediadores eficientes para cada um, mas não conseguiram aumentar eficientemente a taxa de descoloração em LMS usando renda. Isso pode ser causado pela menor especificidade do substrato de lacM para ácido p-cumárico e vanilina. Os rendimentos de descoloração após 24 h de reação de lacM com ácido p-cumárico e vanilina foram semelhantes aos obtidos por lacT. Isso indica que as formas oxidadas de ácido p-cumárico e vanilina podem descolorir eficientemente a melanina, embora sua taxa de oxidação por lacM tenha sido muito menor do que por lacT. Quando lacM sem um mediador foi usado para descoloração da melanina durante um tempo de reação suficiente, o rendimento da descoloração foi de 5 por cento após 24 horas de reação. Os mediadores naturais, exceto o ácido vanílico, também atuam como mediadores mais eficientes que o HOBt para a descoloração da melanina por lacM após 24 h de reação. Quando acetosiringona, siringaldeído e acetovanilona foram usados ​​como mediadores para lacM, os rendimentos de descoloração foram de 34 por cento, 28 por cento e 31 por cento, respectivamente, após 24 h de reação. Quando o ácido vanílico foi usado como mediador para lacT e lacM, ele apresentou o menor rendimento de descoloração. Isso pode ser causado pela baixa estabilidade da forma radical oxidada do ácido vanílico. Khammuang e Sarnthima relataram que a vanilina e o ácido vanílico podem ser usados ​​como mediadores para a descoloração da melanina usando lacase de Lentinus polycarpous [28]. No entanto, eles mostraram atividade de descoloração muito menor para a melanina do que a acetosiringona quando foram usados ​​como mediadores para lacT e lace.

Esses resultados indicam que os mediadores naturais são mais eficientes para a descoloração da melanina pelo LMS do que o HOBt. O HOBt tem sido considerado um mediador sintético eficiente para a lacase devido ao seu alto potencial redox e ao papel catalítico do grupo N OH do HOBt [5]. A eficiência dos mediadores para oxidar os substratos alvo é altamente dependente da capacidade de formar radicais estáveis, bem como do impedimento estérico causado por substituintes alquil volumosos, em vez do potencial redox dos mediadores [19,35]. A baixa estabilidade do intermediário oxidado do HOBt foi determinada por voltametria cíclica [6]. Portanto, o baixo rendimento de descoloração por LMS usando HOBt pode ser causado pela baixa estabilidade do HOBt nas condições de reação da lacase. Embora o potencial redox do siringaldeído fosse menor que o do HOBt, o siringaldeído mostrou estabilidade relativamente maior do que o HOBt [6].

Conforme mostrado na Figura 2, os mediadores naturais usados ​​neste trabalho têm vários substituintes (por exemplo, hidroxila, metoxi, carboxila, cetona ou aldeído) em diferentes posições no anel benzênico [12,19]. Mediadores com dois grupos metoxi (acetosiringona e siringaldeído) apresentaram maiores taxas de descoloração do que aqueles com um grupo metoxi. A taxa de descoloração obtida pelo ácido p-cumárico sem grupo metoxi foi dependente do tipo de lacase. O ácido p-cumárico com lacT apresentou maior taxa de descoloração do que aqueles com um grupo metoxi, enquanto o ácido p-cumárico com lacM apresentou a menor taxa de descoloração nas 5 h de reação. Fillat et al. também mostraram resultados semelhantes para a descoloração de tintas flexográficas por lacases fúngicas com mediadores naturais [36]. Os mediadores fenólicos naturais (acetosiringona, metil seringa e siringaldeído) com dois substituintes metoxi no anel foram oxidados pela lacase mais rapidamente do que o ácido p-cumárico sem grupo metoxi. Isso indica que os grupos metoxi desempenham um papel mais importante como doadores de elétrons do que a dupla ligação da cadeia lateral do ácido p-cumárico. Quando os mediadores com um grupo metoxi foram comparados, o rendimento de descoloração aumentou na seguinte ordem: acetovanilona > vanilina > álcool vanílico > ácido vanílico. A acetovanilona, ​​que possui um grupo cetona, apresentou maior taxa de descoloração e rendimento do que os mediadores com grupos aldeído, hidroxila e carboxila. A acetosiringona com um grupo cetona também mostrou uma maior taxa de descoloração e rendimento do que o siringaldeído com um grupo aldeído.

Nos experimentos seguintes, acetosiringona, siringaldeído e acetovanilona, ​​que mostraram alta capacidade de descoloração da melanina, foram selecionados como mediadores para o LMS descolorir a melanina. O efeito do mediador na reação de descoloração por LMS foi investigado ao longo do tempo (Figura S1). A reação de descoloração usando lacT com acetosiringona, siringaldeído e acetovanilona resultou em rendimentos de descoloração de 21 por cento, 18 por cento e 1 por cento após 1 h de reação, respectivamente. A reação de descoloração usando lacM com acetosiringona e siringaldeído resultou em rendimentos de descoloração de 19 por cento e 18 por cento após 1 h de reação, respectivamente. Ambas as lacases mostraram perfis de reação semelhantes quando o mesmo mediador foi usado. A acetosiringona e o siringaldeído aumentaram significativamente a taxa de descoloração durante a reação inicial. Estes resultados mostram que acetosiringona e siringaldeído contendo grupos dimetoxi foram mais eficientes em aumentar a taxa inicial de descoloração por LMS do que acetovanilona contendo um grupo metoxi. Fillat et al. também relataram que os grupos metoxi nas estruturas de anel dos mediadores atuam como aceleradores para a oxidação de substratos [36]. Por outro lado, o rendimento da descoloração após 24 h de reação pela acetovanilona foi semelhante ao do siringaldeído, embora a acetovanilona tenha aumentado moderadamente a taxa de reação.

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