Resumo:UsandoCistanche DeserticolaParasitando duas plantas hospedeiras (ammodendro de haloxilon e atriplex essocens) como materiais de teste, este estudo determinou o teor de polissacarídeo em C. deserticola de diferentes hospedeiros usando o método de ácido fenol-sulfúrico. Sequenciamento de transcriptoma e análise de haloxylon-cistanche eAssociações Atriplex-Cistancheforam realizados usando a plataforma de sequenciamento Illumina Novaseq 6000. A pesquisa concentrou-se em investigar diferenças de transcriptoma em C. deserticola de diferentes hospedeiros, rastrear os principais genes enzimáticos envolvidos no metabolismo do polissacarídeo e validando os genes selecionados através da verificação de qRT-PCR. Este estudo tem como objetivo fornecer uma base teórica para explorar novas plantas hospedeiras e melhora genética de C. deserticola. O resultado mostrou que o teor de polissacarídeo encontrado no quadriptera-c.desertticola atriplex era superior ao presente em haloxilon ammodendro-C. Deserticola. Através da análise comparativa do transcriptoma, 14089 genes diferencialmente expressos (DEGs) foram rastreados a partir das hastes carnudas do quadriptera-C. Deserticola e Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola. Os resultados da análise de enriquecimento de KEGG revelaram que esses DEGs foram enriquecidos de maneira mais proeminente em vias relacionadas ao metabolismo de carboidratos, metabolismo da galactose, metabolismo de aminoácidos e metabolismo dos ácidos graxos. Além disso, um total de 26 DEGs foi obtido de quatro vias relacionadas ao metabolismo do polissacarídeo, entre as quais os níveis de expressão do gene do gene da frutosidase e - -galactosidase no haloxilon ammodendro -C. Os deserticola foram significativamente maiores do que os do quadriptera-C de Atriplex. Deserticola. Os níveis de expressão do gene da desidrogenase udp-glicose e manose -1- fosfato gene transferase de guanilato no quadriptera-c quadriptera. Deserticola foram significativamente maiores do que aqueles no haloxilon ammodendro-C. Deserticola, que pode ser os principais genes enzimáticos para regular a diferença do metabolismo do polissacarídeo em C. deserticola.

Palavras -chave Cistanche Deserticola; Sequenciamento de transcriptoma; hosts; Diferença do metabolismo do polissacarídeo

Cistanche Deserticola

 

Cistanche Deserticola YC Ma, distribuído principalmente emGansu, Xinjiang, Ningxia e Mongólia Interior, é uma erva medicinal tradicional chinesa recentemente incluída no"Homólogo medicinal e alimentar"catálogo. Tem vários benefícios à saúde, comotonificando o rim yang, essência nutritiva e sangue e promoção de movimentos intestinais, tornando -o amplamente aplicado emmedicina, saúde e indústria de alimentos[1]. Devido ao seunatureza heterotrófica, Cistanche Deserticolaparasitiza diferentes plantas hospedeiras, comAmmodendro de Haloxylone o recém -introduzidoArbusto semi-verdeAtriplex canescens(Pursh) Nutt.sendo seus principais anfitriões.

Os polissacarídeos são as principais substâncias ativas na avaliaçãoCistanche Deserticolaqualidade. Sob diferentes condições do hospedeiro, oacumulação e composição metabólicadeCistânquiaOs polissacarídeos variam significativamente [2]. Pesquisa médica demonstrou queCistânquiaOs polissacarídeos possuemAntioxidante, neuroprotetor, imune-regulação e aprimoramento da memóriaefeitos farmacológicos, aliviando efetivamenteDoença de Alzheimer, doença de Parkinson e deficiência de baço induzida por depressão hepática[3]. Com avanços no modernoTécnicas de extração e tecnologias de análise de vários espectros, oconteúdo, composição e características estruturaisdeCistânquiaOs polissacarídeos estão sendo gradualmente elucidados, expandindo suas aplicações.

Em termos dePesquisa de Biologia MolecularsobreCistânquiaespécies, estudos de sequenciamento de transcriptoma se concentraram principalmente emCistanche TubulosaeHaloxilon-Cistanchesistemas complexos.Por exemplo,Hou et al.[4] realizadosequenciamento de transcriptoma completo e perfil de expressão de genesdeCistanche TubulosausandoPacbio e Bgiseq -500 RNA-Seq Technologies, identificando237.772 transcrições únicase triagem de genes enzimáticos de chave envolvidos emBiossíntese de glicosídeo feniletanóide. De forma similar,Feng et al.[5] conduzidoanálises transcriptômicas e metabolômicasda Haustoria e tecidos adjacentes deRaízes de haloxylon eCistânquiahastes carnudas, revelando o papel do host no acúmulo deCistânquiametabólitos. O estudo deles enfatizou que oa planta hospedeira não apenas afeta o rendimento deCistânquiamas também sua qualidade. No entanto, pesquisas sobreCistânquiaA parasitando diferentes plantas hospedeiras permanece limitada.

Atriplex canescens, a planta profundamente enraizada e altamente resistente ao estresse, difere do tradicionalHospedeiro haloxylone se origina doPlatôs semi-áridos dos Estados Unidos centrais. Nos últimos anos, foi introduzido e promovido como umnovo host paraCistanche DeserticolacultivoemNoroeste da China. An Qing et al.[6] analisou e comparou oacumulação de polissacarídeo deCistânquiaparasitando haloxylon e atriplex canescensNa mesma área de produção, encontrandodiferenças significativas no conteúdo de polissacarídeoentre as duas condições do hospedeiro.

Assim, este estudo pretendesequência as hastes carnudas deCistanche Deserticolaparasitando haloxylon e atriplex canescens, analisando oExpressão diferencial dos genes enzimáticos -chave envolvidos na biossíntese de polissacarídeos. As descobertas fornecerão umbase teórica para mais pesquisas sobreCistânquiaMecanismos de biossíntese de polissacarídeos, Estudos transcriptômicos enriquecidos em atrriplex-Cistânquiasistemas e promover a inovação em alta qualidadeCistânquiaRecursos de germoplasma.

 

Materiais e métodos

1.1 Materiais experimentais

Cistanche Deserticolaamostras parasitandoAmmodendro de HaloxyloneAtriplex canescensforam coletados doCistânquiabase de cultivo emCidade de Xiquan, condado de Jingtai, província de Gansu(latitude36 grau 5 'n, longitude103 grau 42 'e). AmbosHaloxiloneAtriplex canescensforam cultivados no mesmo ambiente. As amostras foram categorizadas comoHaloxilon-Cistânquia(Amostra a)eAtriplex-Cistânquia(Amostra H),com três réplicas para cada categoria (cinco plantas por replicação). A amostragem foi realizada emAbril de 2024, e as amostras foram identificadas comoCistanche Deserticolalâmpadas carnudas porProfessor Guo YehongdoFaculdade de Agricultura, Universidade Agrícola de Gansu.

Seguindo oDiretrizes de amostragem da Shanghai OE Biotech Co., Ltd., oCistânquiaOs caules carnudos foram lavados com água ultrapura e o excesso de umidade foi removido usando papel de filtro. Fatias finas foram retiradas dotopo, meio e inferiorde cada caule, misturado bem e colocado em frascos criogênicos. As amostras eramcongelado rapidamente em nitrogênio líquidopara2 horasantes de ser transferido para um-80 freezerpara armazenamento [7].

1.2 Métodos experimentais

1.2.1 Estabelecimento da curva padrão e determinação do conteúdo de polissacarídeo

A 10 mgamostra dePadrão d-glicosefoi pesado com precisão e dissolvido em umBalão volumétrico de 100 mlcom água destilada para preparar umSolução de 100 · ml⁻uo. Soluções de calibração de{{0}}. 2, 0. 4, 0.da solução estoque foi transferida para10 mL de tubos de teste rolhados, diluído com água para1. 0 mle depois misturado com1. 0 ml de solução de fenol a 6%e5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Após o vórtice, as soluções foram aquecidas em um banho de água fervente para20 minutos, depois esfriou em um banho de água gelada para10 minutos. A controle em brancofoi preparado usando1. 0 ml de água destiladaem vez da solução de glicose. A absorvância foi medida em482 nmusando aEspectrofotômetro UV-Vis, e acurva padrãofoi gerado comconcentração (x) como o eixo horizontaleabsorvância (y) como o eixo vertical.

Seguindo uma abordagem modificada deLi Jie et al. [8], 0. 2 g de secoCistânquiapófoi pesado com precisão e colocado em um20 ml de tubo de ensaio rolha. 10 ml de 80% de etanolfoi adicionado e a mistura foi submetida aExtração ultrassônica a 80 graus (100 W, 40 kHz) por 30 minutos. O extrato foi filtrado enquanto quente e o procedimento foi repetido uma vez. Depois de secar o resíduo,10 ml de água destiladafoi adicionado e a extração ultrassônica foi repetida duas vezes. Os filtrados foram combinados e diluídos para20 mlcom água destilada.1. 0 ml desta soluçãofoi ainda mais diluído para10 mlcom água destilada.

A 1. 0 alíquota mldo preparadoCistânquiaA solução de amostra foi analisada usando o mesmo procedimento que o padrão de glicose. A absorvância em482 nmfoi medido e o teor de polissacarídeo deCistânquiade diferentes plantas hospedeiras foram calculadas.

1.2.2 Extração de RNA, construção da biblioteca de cDNA e sequenciamento

O RNA total foi extraído deCistanche Deserticolaamostras parasitandoAmmodendro de HaloxyloneAtriplex canescensusando oKit de RNA Tiangen DP441 (China), seguindo oProtocolo de reagente TRIZOL. A pureza do RNA foi avaliada com umEspectrofotômetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, EUA), enquanto a concentração e a integridade do RNA foram avaliadas usando umAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, EUA).

As bibliotecas de transcriptoma foram construídas usando oVahts Universal V6 RNA-Seq Library Prep Kit. Depois do controle de qualidade com oBioanalisador Agilent 2100, as bibliotecas foram sequenciadas noPlataforma Illumina Novaseq 6000, gerando150 bp leituras de extremidade pareada.

1.3 Análise de dados

1.3.1 montagem do transcriptoma e anotação funcional

Raw Leia emFormato FastQforam processados ​​usandoTrimmomaticpara removerLeituras de Ploy-N e leituras de baixa qualidade, resultando emleituras limpas. Sequências adaptadoras e regiões de baixa qualidade foram removidas e as leituras limpas foram montadas emcontigs(tags de sequência expressas) usandoSoftware Trinity. A transcrição mais longa de cada cluster foi selecionada como umUnigenePara análises adicionais.

A anotação funcional dos unigenos foi realizada comparando -os com oO banco de dados de proteínas NCBI não redundante (NR), a genealogia evolutiva de genealogia e evolutiva: Banco de dados de grupos ortólogos não supervisionados (GEGNOG)usandoSoftware de diamante (valor eletrônico <1e -5). Anotação de Grupos Ortólogos Eucarióticos (KOG)foi realizado para identificar genes homólogos. Além disso, os unigenos foram mapeados paraEnciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas (KEGG)Para anotação metabólica da via.Classificação de ontologia genética (GO) e anotação funcionalforam realizados usando mapeamentos do banco de dados Swiss-Prot.

1.3.2 Análise de expressão gênica e identificação de Unigenes diferencialmente expressos (DEGs)

Os níveis de expressão gênica foram quantificados usandoGravata borboleta2Alinhar leituras limpas aos Unigenes. Os valores de expressão foram calculados comoFragmentos por kilobase de transcrição por milhão de leituras mapeadas (FPKM)usandosoftware expresso. A análise de expressão diferencial foi realizada usandoSoftware DESEQ2, comTestes de distribuição binomial negativa (NB)usado para testes de significância. Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram definidos como aqueles comq-value <0. 05eAlteração da dobra (FC)> 2.

1.3.3 Validação de qRT-PCR de genes diferencialmente expressos

Genes enzimáticos -chave envolvidos emBiossíntese de polissacarídeoscomexpressão diferencial significativaforam selecionados paraValidação quantitativa de PCR em tempo real (qrt-PCR). As amostras de RNA foram verificadas pela qualidade e os valores de OD foram medidos antes da transcrição reversa. A síntese de cDNA foi realizada usando oTransScript All-in-One First-Strand Syntheis Supermix para o kit qPCR. O cDNA sintetizado foi diluído10- dobrae o qrt-PCR foi realizado usando umSistema qPCR fluorescentesob diferentes condições de ciclismo.Actb (beta-actina) foi usado como um gene de referência internae os níveis relativos de expressão gênica foram calculados usando oMétodo 2⁻ΔCT.

 

Tabela 1 sequências iniciantes

ID do gene	Nome do gene	Primer para a frente (5 '-3')	Primer reverso (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2	GMPP	Gatagtggctacaacatccactt	CCTCCTCTTCGTCGTAGGATTC
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2	Pfp	Tatatgggaccatggaaccaa	Gaccataggccgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1	UGDH	Aaagatcttccagttcgtaagc	Accaattcgttgatgctacc
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1	lacz	Gtctccttgttattcgtgaggat	Gtcgatggtggtgaagcagat
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1	Saca	TTACGAGGATAGTGAGGTGCTA	AATGGAAGATGAGGAGGTTGA
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2	lacz	GGCACAGTCAAGGAGTACGATG	Cactggcatcgacgaggaaag
-	Actb	CAATGGATGATGATATCGCCGCGT	Cactggcatcgacgaggaaag

 

 

1.4 Análise de dados

Análise hierárquica de agrupamento degenes diferencialmente expressos (DEGs)foi realizado usandoR (v3.2.0)Visualizar padrões de expressão gênica entre grupos e amostras. Análise de enriquecimento GO (Gene Ontology) eKEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Análise de enriquecimento de viaforam realizados usandoR, com base noDistribuição hipergeométrica. Os termos funcionais significativamente enriquecidos foram exibidos usandoGráficos de barras, gráficos de bolhas e parcelas de círculo de enriquecimento.

2 resultados e análise

2.1 Resultados do conteúdo de polissacarídeo

A equação de regressão linear obtida a partir das medições de absorvância foi:

y {{0}}. 0 154x - 0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. (R^2=0. 9963) y =0. 0154x - 0.1636 (r 2=0. 9963)

com uma faixa linear de20–90 ug · ml⁻¹. A precisão, repetibilidade, estabilidade e taxa de recuperação de amostras foram{{0}}. 38%, 0. 86%, 0,53%e 99,67%, respectivamente.

O medidoConteúdo de polissacarídeoemCistanche DeserticolaAmostras de diferentes plantas host foram:

Haloxilon-Cistânquia: 6.51%

Atriplex-Cistânquia: 11.83%

2.2 Sequenciamento de transcriptoma e montagem de dados

Sequenciamento de transcriptoma deseis amostrasgerou um total de41,77 g de dados limpos. Os dados válidos por amostra variaram de6,89 G a 7,04 g, comQ30 porcentagens base entre 95,38% e 95,91%, e umConteúdo GC médio de 45,13%.

Um total de61.423 Unigenesforam montados, com um comprimento total de65.962.858 BPe umcomprimento médio de 1.073,91 pb.

2.3 Anotação funcional do gene

Um total de61.423 Unigenesforam obtidos do sequenciamento deCistanche Deserticolaamostras parasitando duas plantas hospedeiras diferentes. Os resultados da anotação são os seguintes:

30.689 Unigenes (49,96%)foram anotados noBanco de dados de proteínas NR (não redundante).

18.698 Unigenes (30,44%)foram anotados noBanco de dados suíço-prot.

3.998 Unigenes (6,51%)foram anotados noBanco de dados KEGG.

17.188 Unigenes (27,98%)foram anotados noBanco de dados KOG (Grupos Ortólogos Eucarióticos).

25.280 Unigenes (41,16%)foram anotados nogemada (genealogia evolutiva de genes: banco de dados ortólogo não supervisionado).

16.210 Unigenes (26,39%)foram anotados noBanco de dados GO (Gene Ontology).

16.153 Unigenes (26,30%)foram anotados noBanco de dados de PFAM (famílias de proteínas).

Entre estes,21.650 Unigenesforam mais longos que1 kb.

Análise de homologia com base noBanco de dados nrrevelaram que as três principais espécies mais intimamente relacionadas foram:

Paulownia fortunei (30,23%)

Phtheirospermum japonicum (14,15%)

Chenopodium quinoa (7,1%)

 

 

Tabela 2 Informações de anotação deCistanche DeserticolaFunção do gene

Banco de dados	Número do gene da anotação	Proporção (%)
Nr	30,689	49.96
Swiss-Prot	18,698	30.44
KEGG	3,998	6.51
Kog	17,188	27.98
gemada	25,280	41.16
IR	16,210	26.39

 

 

2.4 GO e KEGG Anotação e classificação funcional

OBanco de dados GO (Gene Ontology)foi usado para anotar ainda mais os unigenes identificados noBanco de dados nr, resultando em um total de16.210 Unigenes. Esses unigenos foram categorizados emtrês grupos funcionais principais:

Processo Biológico (BP)

Função Molecular (MF)

Componente celular (CC)

NoCategoria Processo Biológico (BP), os aglomerados Unigene mais abundantes foram:

"Processo celular" (11.023 Unigenes)

"Processo metabólico" (9.117 Unigenes)

Para oCategoria de componente celular (CC), 17 subcategoriasforam identificados, com cada subcategoria contendo pelo menos30 Unigenes. Os maiores aglomerados foram:

"Célula" (13.947 Unigenes)

"Parte da célula" (13.918 Unigenes)

NoCategoria de função molecular (MF), os grupos funcionais mais enriquecidos foram:

"Vinculativo" (10.039 Unigenes)

"Atividade catalítica" (8.490 Unigenes)

Fig.2 GO Anotação funcional e classificação de Unigenes

 

Anotação funcional e classificação KEGG

DuranteSequenciamento de transcriptoma, um total de3.998 Unigenesforam anotados noKEGG (banco de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Esses unigenos foram classificados emSeis categorias primárias, com suas respectivas contagens e proporções de unigene da seguinte forma:

Processos celulares: 326 Unigenes (8.15%)

Processamento de informações ambientais: 299 Unigenes (7.47%)

Processamento de informações genéticas: 1.771 Unigenes (44.30%)

Doenças humanas: 14 Unigenes (0.35%)

Metabolismo: 1.465 Unigenes (36.64%)

Sistemas organismos: 123 Unigenes (3.07%)

Essas seis categorias principais foram divididas em20 níveis de classificação secundários. Entre eles,Processamento de informações genéticasteve a maior proporção, seguida porMetabolismo. Dentro doMetabolismoCategoria, os caminhos mais abundantes foram:

Metabolismo de carboidratos

Metabolismo de ácidos graxos

Metabolismo flavonóide

Fig.3 Anotação da via metabólica de Kegg de Unigenes

 

2.5 Expressão gênica diferencial e análise de enriquecimento deCistanche Deserticolade diferentes hosts

Os dados de sequenciamento do transcriptoma foram filtrados usando ocritérios de seleção de expressão diferencial padrão, resultando na identificação de14.089 genes expressos diferencialmente (DEGs):

6.576 genes foram regulados positivamente

7.513 genes foram regulados negativamente

A Lote de vulcõesfoi gerado para visualizar a distribuição geral de DEGs.

NoAs 30 principais classificações funcionais de enriquecimento de GOde Degs, observou -se que:

Comparado comProcesso Biológico (BP)eComponente celular (CC)categorias,Função Molecular (MF)exibiu um enriquecimento mais significativo de granos.

Os DEGs mais notavelmente enriquecidos foram associados aMetabolismo do ácido nucleico, metabolismo das proteínas e enzimas -chave no metabolismo da galactose.

Além disso, degs foram significativamente enriquecidos emVá termos relacionados ao metabolismo do polissacarídeo, incluindo:

Processo metabólico de amido

Processo de biossintética de glicogênio

Processo catabólico de sacarose

Atividade de glucosidase

Atividade UDP-L-Rhamnose sintase

Atividade da polissacarídeo hidrolase

Fig.4 Mapa vulcânico de genes diferencialmente expressos

 

Análise de enriquecimento de via KEGG de DEGs emCistanche Deserticolade diferentes hosts

Para investigar mais aprofundar ogenes diferencialmente expressos (DEGs)emCistanche Deserticolade diferentes plantas hospedeiras,Análise de enriquecimento de via KEGGfoi realizado. A análise revelou que:

Degs foram mapeados para 117 vias metabólicas.

O20 principais caminhosmostrouEnriquecimento significativo de granos, com os caminhos mais enriquecidos, incluindo:

Metabolismo de ácidos graxos

Metabolismo do ácido -linolênico

Metabolismo da galactose

Degradação da lisina

Uma análise de enriquecimento adicional do20 principais categorias metabólicas com os menores valores Qindicou que os DEGs foram significativamente enriquecidos em:

Sistemas organismos

Metabolismo

Processamento de informações genéticas

Entre essas categorias,"Metabolismo"teve o maior número de DEGs enriquecidos e mostrou o enriquecimento mais significativo. Além disso, nas vias metabólicas enriquecidas, oA proporção de unigenos regulados e desregulados aumentados era quase igual.

Essas descobertas sugerem queCaminhos metabólicos desempenham um papel crucialna expressão gênica diferencial deCistanche Deserticolade diferentes plantas hospedeiras, particularmente emMetabolismo de lipídios, carboidratos e aminoácidos.