O leitor RNA M6 A YTHDF2 controla a imunidade antitumoral e antiviral de células NK, parte 1

Introdução

As células natural killer (NK) são as células linfóides inatas predominantes que medeiam a imunidade antiviral e antitumoral (Spits et al., 2016). Eles reconhecem células cancerosas e infectadas por vírus através de seus múltiplos receptores ativadores e inibitórios expressos em superfícies e os matam por meio de um efeito citotóxico (Sun e Lanier, 2011).

O assassino natural está intimamente relacionado à imunidade porque as células assassinas naturais são uma parte importante do sistema imunológico. As células assassinas naturais são um tipo de células imunológicas que podem identificar e matar rapidamente células cancerígenas e patógenos. Eles podem identificar e atacar células anormais sem causar danos às células normais.

A imunidade é a capacidade do corpo de resistir a doenças e infecções, e é a defesa contra patógenos invasores estranhos através de vários mecanismos do sistema imunológico. As células assassinas naturais são uma das armas mais importantes. Eles podem combater diretamente patógenos e células tumorais e até mesmo trabalhar em conjunto com outras células do sistema imunológico para melhorar o efeito de combate a doenças.

Manter uma boa imunidade é importante para prevenir e tratar muitas doenças. Alguns fatores relacionados à atividade e imunidade das células assassinas naturais incluem:

1. Nutrição: Bons hábitos alimentares e a ingestão de nutrientes adequados podem promover a atividade das células natural killer. Por exemplo, nutrientes como vitaminas C, E e ácido fólico desempenham um papel importante no aumento da atividade das células assassinas naturais.

2. Exercício: O exercício moderado pode melhorar a função imunológica e o número de células assassinas naturais, promovendo uma melhor resposta imunológica.

3. Estilo de vida saudável: parar de fumar, limitar o consumo de álcool, dormir o suficiente, reduzir o estresse e eliminar emoções negativas pode melhorar a imunidade e aumentar a atividade das células assassinas naturais.

Resumindo, as células assassinas naturais são uma das armas mais importantes do sistema imunológico. Uma boa imunidade pode proteger o corpo contra doenças. Ao adotar um estilo de vida saudável, manter uma boa nutrição e praticar exercícios moderados, você pode aumentar o número e a atividade das células assassinas naturais, melhorar a imunidade e, assim, melhorar continuamente a saúde do seu corpo. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque a Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês que tem muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da Cistanche deserticola vem dos múltiplos ingredientes ativos que contém, incluindo ácido tânico, polissacarídeos, glicosídeos flavonóides, etc.

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Eles também podem produzir um conjunto distinto de citocinas, como IFN-, TNF- e IL-10, ou quimiocinas, como MIP-1 e - e RANTES, que podem provocar ainda mais respostas imunes adaptativas (Spits e outros, 2016). Juntas, as atividades multifuncionais das células NK ajudam a eliminar alvos suscetíveis e a amplificar as respostas inflamatórias contra vírus e câncer.

Como a modificação pós-transcricional mais prevalente no mRNA de mamíferos, a modificação N6-metiladenosina (m6A) está emergindo como um mecanismo regulatório difundido que controla a expressão genética em diversos processos fisiológicos (Yue et al., 2015).

No entanto, como a metilação do m6A regula a imunidade inata e adaptativa mediada por células ainda não foi totalmente compreendida e, até este relatório, permaneceu desconhecida nas células NK.

Recentemente, foi demonstrado que os receptores de antígenos quiméricos (CARs) redirecionam as células NK para células tumorais que expressam um antígeno correspondente, criando oportunidades para lutar contra o câncer (Chenet al., 2016; Chu et al., 2014; Han et al., 2015; Liu et al., 2015; Liu et al., 2015; Liu et al., 2015; Liu et al., 2015; Liu et al., 2015; Liu et al., 2015; Liu et al., 2015; al., 2020; Tang et al., 2018; Yilmaz et al., 2020).

Portanto, definir claramente o papel da modificação de m6A nas células NK não apenas melhorará muito nossa compreensão das modificações de RNA como uma nova e crítica camada de regulação gênica pós-transcricional que controla as funções das células imunes inatas, mas também poderá nos fornecer uma nova oportunidade para melhorar a função efetora das células NK e a sobrevivência ao câncer. Imunoterapia.

As metiltransferases m6A ("escritores", por exemplo, METTL3 e METTL14) e desmetilases ("borrachas", por exemplo, massa gorda e proteína associada à obesidade [FTO] e ALKBH5) controlam dinamicamente o cenário de metilação de m6A (Shi et al., 2019).

As proteínas leitoras 6A (proteínas da família contendo o domínio YTH [YTHDF] YTHDF1, YTHDF2 e YTHDF3 e proteínas de ligação ao mRNA do fator de crescimento semelhante à insulina 2 [IGF2BP] IGF2BP1, IGF2BP2 e IGF2BP3) ligam-se preferencialmente ao RNA metilado e medeiam funções específicas, incluindo promovendo a tradução ou afetando a estabilidade de mRNAs modificados com m6A (Huang et al., 2018; Shi et al., 2019; Wang et al., 2014; Wang et al., 2015).

Estudos recentes mostraram que a metilação do m6A está envolvida na imunidade adaptativa e mediada por células imunes inatas (Shulman e Stern-Ginossar, 2020). A deleção da proteína m6Awriter METTL3 em células T de camundongos perturba a homeostase e a diferenciação celular, visando o caminho IL-7/SOCS/STAT5 (Li et al., 2017). METTL3 mantém funções supressivas de células T reg através da sinalização IL-2/STAT5 (Tong et al.,2018).

A metilação do RNA m6A desempenha um papel essencial no desenvolvimento inicial das células B (Zheng et al., 2020). Um relatório recente mostrou que a metilação do mRNA m6A mediada por METTL3- promove a ativação de células dendríticas (DC) (Wang et al., 2019a).

Os mRNAs modificados com m6A que codificam catepsinas lisossômicas podem ser reconhecidos por YTHDF1 em DCs, suprimindo assim a capacidade de priming cruzado de DCs e inibindo as respostas imunes antitumorais (Han et al., 2019).

As modificações do m6A também controlam a resposta imune inata à infecção viral (Liu et al., 2019; Rubio et al., 2018; Winkler et al., 2019). No entanto, não foi relatado se e como as modificações de m6A afetam a resposta imune mediada por células NK a células tumorais e vírus. YTHDF2 é um leitor m6A bem reconhecido que atua reconhecendo e ligando-se especificamente a RNAs contendo m6A e promovendo a degradação de transcritos alvo (Wang e outros, 2014).

De acordo com o banco de dados do BioGPS (Wu et al., 2013) e nossos dados preliminares, as células NK murinas expressam YTHDF2 em alto nível, enquanto seu papel na regulação das células NK é desconhecido. Isso nos motivou a estudar o YTHDF2 em células NK usando uma abordagem de nocaute condicional.

Mostramos que a depleção de Ythdf2 em células NK de camundongo prejudicou significativamente a imunidade antitumoral e antiviral das células NK. Além disso, o YTHDF2 controlou a homeostase, a maturação e a sobrevivência das células NK em um estado estacionário. Assim, as modificações YTHDF2 ou m6A em geral desempenham papéis multifacetados na regulação das células NK.

Resultados

YTHDF2 é regulado positivamente em células NK murinas por IL-15, infecção por CMV murino e progressão tumoral

Para estudar o papel das modificações de m6A nas células NK, primeiro examinamos os níveis de expressão de escritores, apagadores e leitores de m6A em células NK murinas usando o banco de dados BioGPS (Disponível em: http://biogps.org).

Consequentemente, a expressão de mRNA de Ythdf2 foi a mais alta entre as outras enzimas e leitores m6A (Fig. 1 A). Curiosamente, descobrimos que as células NK também possuem mRNA constitutivo e expressão proteica de Ythdf2 em níveis elevados em comparação com a maioria das outras células do sistema imunológico, incluindo células B. , macrófagos e DCs (Fig. 1 B e Fig. S1 A).

As células NK podem ser ativadas por IL-15, que é um regulador chave da homeostase e sobrevivência das células NK (Becknell e Caligiuri, 2005). Aproveitando o banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO), descobrimos que as células NK ativadas por IL-15 têm níveis mais elevados de mRNA de Ythdf2 em comparação com outras enzimas e leitores m6A que testamos (Fig. 1 C; analisado do GEO sob o número de acesso. GSE106138).

Consistente com nossa análise dos dados GEO, nossa PCR quantitativa em tempo real (qPCR) e imunotransferência mostraram que a ativação de IL-15 de células NK regulou significativamente Ythdf2 tanto no nível de mRNA quanto no nível de proteína e que Ythdf2 teve um nível de expressão muito alto em IL{ Células NK ativadas por {4}} em comparação com outras enzimas m6A e leitores que testamos (Fig. 1, D – F; e Fig. S1 B).

Os níveis de proteína de YTHDF2 também foram significativamente regulados positivamente em células NK de camundongos transgênicos IL -15 (Tg) que geramos anteriormente em comparação com controles WT (Fig. S1 C; Fehniger et al., 2001). mediadores da imunidade do hospedeiro contra infecções virais e malignidades (Spits et al., 2016). Portanto, avaliamos o padrão de expressão de YTHDF2 em células NK durante a infecção por CMV murino (MCMV).

Utilizando o banco de dados GEO, descobrimos que o Ythdf2 foi regulado positivamente no dia 1,5 após a infecção em dois bancos de dados independentes (Fig. 1 G e Fig. S1 D). Um ensaio de imunotransferência confirmou que os níveis de proteína de YTHDF2 também foram regulados positivamente no dia 1,5 após a infecção com MCMV (Fig.S1 E), indicando que o YTHDF2 pode desempenhar um papel crítico na imunidade antiviral mediada por células NK.

Além de controlar a infecção viral, as células NK contribuem para a imunovigilância antitumoral. Em seguida, examinamos os níveis de Ythdf2 durante o desenvolvimento do tumor. Usando o modelo de metástase de melanoma B16F10, encontramos uma redução de células NK no pulmão na fase tardia do desenvolvimento do tumor (Fig. S1 F), o que é consistente com um relatório anterior (Cong et al., 2018).

Descobrimos que os níveis de mRNA e proteína de Ythdf2 foram significativamente regulados positivamente nas células NK no estágio inicial do desenvolvimento do tumor (Fig. 1 H e Fig. S1 G). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o YTHDF2 é altamente expresso em células NK e é regulado positivamente durante a infecção viral e a tumorigênese, levando-nos a supor que o YTHDF2 desempenha um papel na regulação da defesa das células NK contra a tumorigênese e a infecção viral.

A deficiência de YTHDF2 prejudica a imunidade antitumoral das células NK

Para definir o papel do YTHDF2 na imunidade antitumoral mediada por células NK, primeiro geramos camundongos floxed Ythdf2 (Fig. S1, H e I). Em seguida, geramos camundongos knockout condicionais específicos para células NK (doravante denominados camundongos Ythdf2ΔNK) cruzando camundongos Ythdf2fl/fl com camundongos Ncr1-iCre (Narni-Mancinelli et al., 2011). A deleção de Ythdf2 em células NK foi verificada por qPCR e imunotransferência (Fig. S1, J e K).

Estabelecemos então um modelo de melanoma metastático por injeção intravenosa de células B16F10 em camundongos Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK. Como mostrado na Figura 2 A, os camundongos Ythdf2ΔNK exibiram uma carga muito maior de nódulos metastáticos do que os camundongos Ythdf2WT.

Encontramos uma redução significativa na porcentagem e no número absoluto de células NK infiltrantes nos tecidos tumorais de camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com aquelas observadas em camundongos Ythdf2WT (Fig. 2, B e C). Enquanto isso, a infiltração de células NK de camundongos Ythdf2ΔNK mostrou uma diminuição significativa na expressão de IFN-, granzima B e perforina em comparação com aquelas de camundongos Ythdf2WT (Fig. 2, D-F).

No entanto, as porcentagens de células T CD4+ e células T CD8+ e sua expressão de IFN- foram comparáveis ​​entre camundongos Ythdf2WT e camundongos Ythdf2ΔNK (Fig. S1, L – O), sugerindo que YTHDF2 em células NK é essencial para controlar metástases tumorais.

Para confirmar a exigência intrínseca à célula de YTHDF2 para imunidade antitumoral mediada por células NK, transferimos adotivamente um número igual de células NK de camundongos Ythdf2ΔNK ou camundongos Ythdf2WT para camundongos Rag2-/-Il2rg-/-, que não possuem células T, B e NK , 1 dia antes de uma injeção de células tumorais B16F10 (Fig. 2 G). Encontramos um aumento significativo na incidência de metástases tumorais em camundongos transferidos com células NK Ythdf2ΔNK em comparação com camundongos injetados com células NK Ythdf2WT (Fig. 2 G).

Da mesma forma, neste modelo, também encontramos uma redução significativa na porcentagem e no número absoluto de células NK Ythdf2ΔNK infiltrantes (Fig. 2, H e I), bem como uma diminuição na expressão de IFN-, granzima B e perforina em camundongos que receberam adotivamente transferiram células NK Ythdf2ΔNK em comparação com aquelas que receberam células NK Ythdf2WT (Fig. 2, J – L). Esses dados indicam um papel intrínseco às células do YTHDF2 na regulação da imunidade antitumoral das células NK.

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