O efeito inibitório do derivado de curcumina J147 na melanogênese e no transporte do melanossoma, facilitando a degradação do MITF mediada por ERK, parte 1

O uso terapêutico da curcumina e da curcumina quimicamente modificada (CMC) para suprimir a melanogênese e a atividade da tirosinase foi reconhecido. J147 é uma versão modificada da curcumina com biodisponibilidade e estabilidade superiores. No entanto, não há relato sobre os efeitos do J147 na pigmentação in vitro e in vivo. Em nossos estudos, investigamos os efeitos hipopigmentários do tratamento com J147 nos melanócitos e exploramos o mecanismo subjacente. Os presentes estudos sugeriram que J147 suprimiu a melanogênese basal e induzida por -MSH, bem como diminuiu a extensão dos dendritos de melanócitos e o transporte de melanossomas. J147 desempenhou esses papéis principalmente ativando a via da proteína quinase regulada por sinal extracelular (ERK). Uma vez ativado, resultou na degradação do MITF e sub-regulou ainda mais a expressão da tirosinase, TRP-1, TRP-2, miosina Va, Rab27a e Cdc42, inibindo a síntese de melanina e o transporte do melanossoma. Além disso, os efeitos hipopigmentários de J147 foram demonstrados in vivo em um modelo de peixe-zebra e modelo de hiperpigmentação induzida por UVB em cobaias marrons. Nossos achados também sugeriram que J147 não exibiu citotoxicidade in vitro e in vivo. Juntos, esses dados confirmaram que o J147 pode ser bastante útil como um agente de clareamento natural da pele mais seguro.

Cistanchetambém tem a função depromoção da produção de colágeno, que pode aumentar a elasticidade e o brilho da pele e ajudar a reparar as células danificadas da pele. CistancheFeniletanol Glicosídeostem um efeito de regulação negativa significativo sobretirosinaseatividade, e o efeito sobre a tirosinase mostrou ser uma inibição competitiva e reversível, o que pode fornecer uma base científica para o desenvolvimento e utilização doingredientes de clareamentoem Cistanche. Por isso, o cistanche tem papel fundamental no clareamento da pele. Podeinibe a produção de melaninapara reduzir a descoloração e o embotamento; e promover a produção de colágeno paramelhorar a elasticidade da pelee radiância. Devido ao amplo reconhecimento desses efeitos da cistanche, muitosClareamento da peleos produtos começaram a infundir ingredientes à base de plantas, como o Cistanche, para atender à demanda do consumidor, aumentando assim o valor comercial do Cistanche em produtos para clareamento da pele. Em resumo, o papel do cistanche no clareamento da pele é crucial. Seu efeito antioxidante e o efeito de produção de colágeno podem reduzir a descoloração e o embotamento, melhorar a elasticidade e o brilho da pele e, assim, obter um efeito de clareamento. Além disso, a ampla aplicação de Cistanche em produtos de clareamento da pele demonstra que seu papel no valor comercial não pode ser subestimado.

Palavras-chave: J147, efeitos hipopigmentários, transporte de melanossomas, via ERK, degradação de MITF

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INTRODUÇÃO

A pigmentação da pele depende tanto da síntese quanto da distribuição da melanina na camada da epiderme. A melanina é produzida principalmente ao redor do núcleo dos melanócitos e armazenada nos melanossomas (Tian et al., 2021). Após o amadurecimento, os melanossomos migraram ao longo dos microtúbulos e filamentos de actina até as pontas dos dendritos das células e finalmente para os queratinócitos vizinhos para finalizar o processo de distribuição (Beaumont et al., 2011; Ohbayashi e Fukuda, 2012). Sob estado fisiológico normal, a melanina protege a pele humana dos danos ultravioleta (UV), produtos químicos tóxicos e outros fatores ambientais (Slominski et al., 2004; Yousaf et al., 2020). No entanto, a produção e o acúmulo excessivos induzem a hiperpigmentação e estão associados a distúrbios da pele, como melanoderma pós-inflamatório, melasma e lentigos solares, levando a uma carga psicossocial notável (Pillaiyar et al., 2017). Portanto, é necessário desenvolver agentes clareadores de pele eficazes e seguros.

Nos últimos anos, a biologia celular da melanina tornou-se um campo de pesquisa mais amplo e várias proteínas importantes que contribuem para a melanogênese e transporte de melanossomas foram elucidadas, abrindo caminho para a identificação de inibidores da síntese de melanina. A tirosinase é exclusivamente necessária para a melanogênese e a inibição da ação catalítica da tirosinase é o método mais comum para reduzir a produção de melanina (D'Mello et al., 2016). Vários inibidores de tirosinase conhecidos, incluindo arbutina e ácido kójico, já foram desenvolvidos como aditivos cosméticos (Ding et al., 2020). KIF5b e o complexo Rab27A-Melanofilina-Miosina Va contribuem para o transporte externo do melanossoma (Ohbayashi e Fukuda, 2012; Noguchi et al., 2014). O Cdc42 regula o alongamento dos dendritos, que é essencial para a transferência do melanossoma (Luo, 2000). A inibição dessas proteínas acima pode suprimir significativamente o transporte de melanossomas, que é um mecanismo importante para o desenvolvimento de agentes de clareamento da pele. O fator de transcrição associado à microftalmia (MITF) é um fator de transcrição mestre na melanogênese. Além disso, o MITF também regula o transporte de melanossomas induzindo a expressão de Rab27a e Cdc42 (Noguchi et al., 2016). Múltiplas vias de sinalização participam da pigmentação regulando o nível de expressão do MITF. A ativação da proteína quinase A de cAMP (PKA) estimula a pigmentação através da regulação positiva dependente da proteína de ligação do elemento de resposta de cAMP (CREB) da expressão de MITF (Rodríguez e Setaluri, 2014). Por outro lado, a ativação da proteína quinase regulada por sinal extracelular (ERK) inibe a melanogênese acelerando a degradação do MITF (Lv et al., 2020a). Numerosos agentes anti-melanogênicos foram desenvolvidos que têm como alvo a atividade da tirosinase, transferência de melanossomas ou vias de sinalização relacionadas com melanogênicos. No entanto, poucos inibidores passaram por estudos in vivo e apresentaram bons resultados (Pillaiyar et al., 2017).

A curcumina é um composto diarilheptanoide isolado do rizoma de Curcuma longa (Zingiberaceae) e usado como sabor ou pigmento amarelo em alimentos (Zheng J. et al., 2018). Estudos indicaram suas várias funções fisiológicas, incluindo atividades antiinflamatórias, antioxidantes, antiamilóides e antitumorais (Liu et al., 2016; Zheng Y. et al., 2018). Além disso, a curcumina inibe a atividade da tirosinase e suprime a melanogênese nos melanócitos (Lee et al., 2010; Tu et al., 2012). Porém, a baixa biodisponibilidade da curcumina limita sua aplicação (Karthikeyan et al., 2020). Para resolver esse problema, o J147 é desenvolvido como um potente composto derivado da curcumina com maior estabilidade e biodisponibilidade (Li et al., 2020). J147 tem um efeito neuroprotetor e está atualmente em fase I de ensaios clínicos para a doença de Alzheimer. No entanto, ainda não há relato sobre os efeitos do J147 na pigmentação in vitro e in vivo.

MATERIAIS E MÉTODOS

Reagentes

J147 (J302241), -MSH (M118985) e tirosinase de cogumelo (T128536) foram obtidos de Aladdin (Shanghai, China). Obtivemos anticorpos contra Miosina Va (sc-365986), KIF5b (sc-133184), GP100 (sc-393094), Cdc42 (sc-8401), Rab27a (sc{{ 13}}), p-JNK (sc-6254), JNK (sc-7345), p-p38 MAPK (sc-166182) e p38 MAPK (sc-398546) de Santa Cruz (CA, EUA). Os anticorpos contra MITF (97800), p-MEK (2338), MEK (4694), p-ERK (4370) e ERK (4695) foram obtidos da Cell Signaling Technology (MA, EUA). Os anticorpos contra tirosinase (ab180753), TRP-1 (ab235447), TRP-2 (ab221144), citoqueratina (ab7753) e S100 (ab133519) foram obtidos da Abcam (Cambridge, Reino Unido). O inibidor de p38 SB203580 (S1863), o inibidor de ERK PD98059 (S1805), o kit de ensaio de proteína BCA (P0012), o tampão de lise celular (P0013) e a -actina (AF5001) foram obtidos da Beyotime (Shanghai, China). Os kits RT-qPCR (RR036A) foram adquiridos da Takara Biomedical Technology (Pequim, China).

Cultura de células

Ensaio MTT

A viabilidade celular foi examinada pelo ensaio MTT (Yun et al., 2020). Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96-poços e tratadas com J147 (1–8 μM) por 48 h. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e substituídas por solução de MTT (20 μL). Após incubação por mais 4 h, a solução sobrenadante foi removida e DMSO (200 μL) foi adicionado a cada poço. Finalmente, a absorbância óptica em 570 nm foi determinada.

Medição do conteúdo de melanina

Células com uma densidade de 2 × 105 células/mL foram semeadas em 6-placas de cultura de poços. Após 24 h de incubação, as células foram cultivadas com diferentes doses de J147 (1, 2, 4 μM) e com ou sem estimulação -MSH (60 nM). Após 48 h de tratamento, as células foram colhidas e a melanina total no sedimento celular foi dissolvida em 100 μL de solução de trabalho de NaOH (1 mol/L, 10 por cento de DMSO) a 80 graus C por 1 h, e a absorbância foi medida a 405 nm (Lv et al., 2015; Lv et al., 2019).

Ensaio de atividade de tirosinase

A atividade da tirosinase celular foi examinada como descrito anteriormente (Liao et al., 2017; Lv et al., 2020a). Em resumo, as células foram lisadas por tampão de lise celular após lavagem três vezes e, em seguida, o sobrenadante para o ensaio de atividade de tirosinase foi obtido por centrifugação dos lisados. 100 μL de PBS (0,1 M, pH 6,5) contendo 10 ug de proteínas misturadas com 100 μL de 0,1% de L-DOPA. A placa foi incubada a 37 graus por 1 h e, em seguida, a absorbância óptica a 475 nm foi monitorada.

O efeito direto de J147 na atividade da tirosinase foi testado por um sistema livre de células conforme descrito anteriormente (Lv et al., 2020a). Em resumo, a reação para a determinação da atividade da tirosinase de cogumelo foi conduzida em uma placa de 96-poços e a mistura de reação continha tirosinase de cogumelo (10 unidades), L-tirosina (0,03 por cento, 50 μL) e 100 μL de PBS (0,1 M, pH 6,5) adicionando com diferentes concentrações de J147. Após a incubação a 37 graus por 10 min, a absorbância a 475 nm foi medida usando um espectrofotômetro de microplaca.

Coloração Masson-Fontana Prata Amoniacal

Para detectar o pigmento melanina, pedaços de pele e melanócitos foram fixados em formalina e corados seguindo o protocolo padrão (Gu et al., 2018; Lv et al., 2020b). Resumidamente, as lâminas foram lavadas 3 vezes com água deionizada e depois incubadas em solução de prata amoniacal à temperatura ambiente por 12 horas. Após enxaguar bem em água deionizada, as lâminas foram incubadas em hiposolução por 5 min. Em seguida, as lâminas foram lavadas novamente e contracoradas com corante vermelho neutro por mais 5 minutos. Finalmente, após enxágue completo, as lâminas foram observadas em um microscópio Nikon-Eclipse-Ti.

Imunofluorescência para Transferência de Melanossoma

O sistema de cocultura de células B16F10 e HaCaT foi estabelecido na placa confocal, conforme descrito anteriormente (Lee et al., 2015; Lv et al., 2020c). Após o tratamento com J147, as células foram imunomarcadas com anti-GP100 e anti-Cytokeratin de acordo com o protocolo padrão. As imagens foram tiradas do microscópio Nikon-Eclipse-Ti.

Imuno-histoquímica para S-100

A imunohistoquímica para S-100 foi realizada conforme descrito anteriormente (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Uma breve descrição foi a seguinte: as lâminas foram bloqueadas com 5% de BSA a 25 graus C por 1 h e depois incubadas com anticorpo primário anti-S-100 a 4 graus C durante a noite. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas 3 vezes com solução de TBST e incubadas com o anticorpo secundário. Em seguida, as lâminas foram tratadas com aminoetilcarbazol para revelação dos cortes e observadas ao microscópio.

Transcrição Reversa – PCR

O RNA celular total foi extraído pelo reagente TRIzol e quantificado espectrofotometricamente. Em seguida, o SuperScript II Reverse Transcriptase foi usado para sintetizar single-strandedcDNA seguindo as instruções de fabricação.Os primers oligonucleotídicos foram adquiridos da GenScript(Nanjing, China). As sequências deMITFprimers de gene são 5′- AGAGCAGGGCAGAGAGTGAGTG -3′, 5′-AACTTGATTCCAGGCTGATGATGTC -3′. As sequências deGAPDHgeneprimers são 5′- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, 5′- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3′. produtos de PCR foramseparados por eletroforese em géis de agarose a 1 por cento e detectadossob luz ultravioleta (Lee e outros, 2013).

Western Blotting

Proteínas (40 ug) foram separadas por géis SDS-PAGE e transferidas para membranas de filtro de nitrocelulose (NC) por um sistema de transferência eletroforética (Bio-Rad). As membranas NC foram bloqueadas com 3% de BSA em solução de TBST à temperatura ambiente por 1,5 h. Em seguida, as membranas foram incubadas com anticorpos primários a 4 graus durante a noite. No dia seguinte, os blots foram lavados 3 vezes com solução de TBST e depois incubados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase a 25 graus por 1 h e visualizados usando quimioluminescência aprimorada (Lv et al., 2020d).

Determinação do teor de melanina no modelo de peixe-zebra

Resumidamente, os embriões sincronizados foram coletados e dispostos por pipeta (três a quatro embriões por poço com 200 μL de meio de embrião em 96-placas de poços). Em seguida, J147 e PTU foram dissolvidos em 0,1 por cento de DMSO e adicionados ao meio embrionário de 35 a 60 h (25 h de exposição). A influência de J147 na melanogênese do zebrafish foi observada sob estereomicroscópio (Zheng J. et al., 2018).

Avaliação baseada em fenótipo e modelo de cobaia de hiperpigmentação induzida por UVB

8 cobaias marrons (6 semanas, aproximadamente 250–300 g) foram adquiridas do Institute of Laboratory Animal Science (Pequim, China). Essas cobaias foram mantidas sozinhas em uma sala de temperatura e umidade constante sob um ciclo de 12-h claro/escuro. As áreas separadas (círculo de 1 cm de diâmetro) do dorso de cada animal foram expostas a 500 mJ/cm2 UVB (Sigma SH-4, Xangai, China) uma vez ao dia durante 1 semana para estabelecer o modelo de hiperpigmentação. Em seguida, o veículo (PEG400/EtOH=7:3) e J147 (1 por cento) foram administrados nas áreas hiperpigmentadas (solução de 20 μL por círculo) duas vezes ao dia durante 3 semanas. O grau de pigmentação foi avaliado calculando o valor ΔL de acordo com o valor L medido pelo espectrofotômetro (YS3010, 3nh, Shenzhen, China), como segue: ΔL=L (a cada dia medido)-L (no dia 0) (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Todos os procedimentos com animais neste estudo foram aprovados pelo comitê de cuidados e uso de animais da Universidade de Changzhou.

Análise estatística

RESULTADOS

J147 Diminuição da Melanogênese e do Número de Dendritos Dentro das Células B16F10

A estrutura do J147 é mostrada na Figura 1A. Primeiramente, um experimento de viabilidade celular foi realizado para investigar se J147 era citotóxico para células B16F10. Conforme mostrado na Figura 1B, nenhum efeito citotóxico de J147 foi observado em uma faixa de dosagem de 1–8 μM após 48 h. Em seguida, examinamos a influência de J147 na síntese de melanina. Como mostrado na Figura 1C, J147 inibiu a síntese de melanina basal. -MSH promove significativamente a melanogênese nos melanócitos. O aumento da melanogênese induzida por -MSH foi revertido após o tratamento com J147. Consistentemente, a coloração de prata amoniacal Masson-Fontana mostrou que J147 reduziu notavelmente o conteúdo de melanina em células B16F10 com ou sem -MSH (Figura 1D). Além disso, o número e o comprimento dos dendritos e a concentração de melanina nos dendritos também diminuíram quando comparados com células não tratadas (Figura 1D). Os resultados sugeriram que J147 diminuiu a melanogênese e a formação de dendritos sem efeitos citotóxicos.

J147 inibiu a atividade da tirosinase celular e a expressão da tirosinase, TRP-1, TRP-2

A família de proteínas tirosinase (tirosinase, TRP-1 e TRP-2) participou da melanogênese. Dentre elas, as tirosinases são enzimas chave na regulação da via biossintética da melanina (D'Mello et al., 2016). Para determinar se o J147 influencia a atividade da tirosinase, primeiro usamos o método de oxidação da L-DOPA para determinar os efeitos do J147 na atividade da tirosinase celular. J147 (1–4 μM) demonstrou exercer profundos efeitos inibitórios na atividade da tirosinase celular de maneira dependente da dose em células B16F10 (Figura 2A). Em seguida, um ensaio de atividade de tirosinase de cogumelo foi realizado para determinar os efeitos diretos de J147 na atividade de tirosinase. Conforme mostrado na Figura 2B, nenhum efeito inibitório foi observado, indicando que J147 não influenciou as atividades enzimáticas da tirosinase de cogumelo (Figura 2B). Como sabemos, a melanogênese é controlada pela atividade e quantidade dessas tirosinases. Para investigar se os efeitos anti-melanogênicos de J147 estão correlacionados com a expressão da tirosinase, foi realizada análise de western blot. Conforme mostrado na Figura 2C, os níveis de expressão de tirosinase foram significativamente reduzidos após o tratamento com J147 com ou sem -MSH, e os mesmos resultados foram observados na expressão de TRP-1 e TRP-2. Essas observações indicaram que J147 inibiu a atividade da tirosinase celular e a melanogênese reduzindo os níveis de expressão de tirosinase, TRP-1 e TRP-2.

J147 inibiu o transporte de melanossomas regulando a expressão de miosina Va, Rab27a e Cdc42

A pigmentação da pele humana é determinada pela síntese de melanina, bem como pela distribuição de melanina. Nos melanócitos de mamíferos, a melanina é produzida principalmente no corpo celular emigra ao longo dos filamentos de actinae microtúbulos para dendritos, e finalmenteaos queratinócitos vizinhos para terminara distribuiçãoprocesso (Ohbayashi e Fukuda, 2012). Como é mostrado emFigura 1D, J147 diminuiu acentuadamente a formação de dendritos.Além disso, a concentração de melanina nos dendritos também foireduzido à medida que o pigmento melanina foi agregado no perinuclearregiões. Em seguida, co-cultivamos células B16F10 e HaCaT parainvestigar se J147 influenciatransferência de melanossoma paraqueratinócitos por microscopia confocal. A distribuição demelanina foi observada nas células HaCaT na co-culturamodelo (Figura 3A). Em contraste, enquanto o modelo de co-cultura foitratados com J147 por 48 h, sinais granulares de melanossoma emAs células HaCaT foram significativamentereduzido (Figura 3A).

Para esclarecer ainda mais o mecanismo subjacente dos efeitos de inibição da transferência de melanossomas por J147, examinamos vários fatores cruciais envolvidos no transporte de melanossomas. O KIF5b medeia o transporte externo do melanossoma ao longo dos microtúbulos, e o complexo Rab27a Melanofilina-Miosina Va contribui para o transporte do melanossoma ao longo dos filamentos de actina nos melanócitos (Reiner et al., 2020). Além disso, o Cdc42 estimula a formação de dendritos nos melanócitos, que também desempenha um papel essencial no transporte de melanossomas. Conforme mostrado na Figura 3B, a expressão de Cdc42, Miosina Va e Rab27a, mas não KIF5b, diminuiu significativamente após o tratamento com J147 na condição de com ou sem -MSH. Nossos achados indicaram que J147 inibiu o transporte de melanossomas diminuindo a expressão de Miosina Va, Rab27a e Cdc42.

Degradação MITF acelerada J147

O MITF é um dos principais reguladores da melanogênese e controla a transcrição gênica da tirosinase, TRP-1, TRP-2, Cdc42 e Rab27a (Noguchi et al., 2016; Kim et al., 2019 ). Primeiro examinamos a influência do J147 nas transcrições do MITF. Conforme mostrado na Figura 4A, -MSH aumentou notavelmente a transcrição de MITF, no entanto, nenhuma alteração foi observada após o tratamento com J147, indicando que J147 não regula negativamente a expressão de MITF. Em seguida, examinamos se o J147 influencia a tradução do MITF. Conforme mostrado na Figura 4B, após o tratamento com -MSH, os níveis de proteína MITF aumentaram, atingiram o pico em 4 h e começaram a diminuir em 8 h (Figura 4B). Diferentemente, os níveis de proteína de MITF não diminuíram 4 h após o tratamento com J147, mas em 8 h os níveis de proteína MITF diminuíram rapidamente para níveis indetectáveis, indicando que J147 não influencia a tradução de MITF, mas notavelmente acelera a degradação da proteína MITF.

J147 Suprimiu a Melanogênese Através da Via de Sinalização MEK/ERK

A via de sinalização da proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK), incluindo proteína quinase regulada por sinal extracelular (ERK), p38 e c-jun N-terminal quinase (JNK), desempenham papéis cruciais na pigmentação (Lee et al., 2013). A fosforilação de ERK é conhecida por facilitar a degradação do MITF e eventualmente dissipar os estímulos melanogênicos, o que representa um importante mecanismo de feedback negativo (Kwon et al., 2017). No entanto, a função do p38 e da via JNK permanece controversa. Assim, examinamos o efeito de J147 nas vias de sinalização MAPK. Como mostrado na Figura 5A, J147 ativou MEK/ERK e p38, enquanto nenhuma influência foi encontrada na fosforilação da via de sinalização JNK.

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