O Sistema Glioxalase em Doenças Relacionadas à Idade: Intervenção Nutricional como Estratégia Antienvelhecimento Parte 1

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Abstrato:O sistema de glioxalase é fundamental para a desintoxicação de produtos finais de glicação avançada (AGEs). AGEs são compostos tóxicos resultantes da modificação não enzimática de biomoléculas por açúcares ou seus metabólitos através de um processo chamado glicação. Os AGEs têm efeitos adversos em muitos tecidos, desempenhando um papel patogênico na progressão do envelhecimento molecular e celular. Devido ao declínio relacionado à idade em diferentes mecanismos anti-AGE, incluindo mecanismos desintoxicantes e capacidades proteolíticas, biomoléculas glicadas são acumuladas durante o envelhecimento normal em nosso corpo de maneira dependente do tecido. Vistos dessa forma, sistemas desintoxicantes anti-AGE são propostos como alvos terapêuticos para combater a disfunção patológica associada ao acúmulo e citotoxicidade de AGE. Aqui resumimos o estado atual do conhecimento relacionado aos mecanismos de proteção contra o estresse de glicação, com ênfase especial no sistema glioxalase como o principal mecanismo de desintoxicação dos intermediários reativos da glicação. Esta revisão se concentra na glioxalase 1 (GLO1), a primeira enzima do sistema glioxalase e a enzima limitante da velocidade desse processo catalítico. Embora o GLO1 seja expresso de forma ubíqua, os níveis e as atividades das proteínas são regulados de maneira dependente do tecido. Nós fornecemos uma análise comparativa da proteína GLO1 em diferentes tecidos. Nossos achados indicam um papel para o sistema de glioxalase na homeostase na retina do olho, um tecido altamente oxigenado com rápida renovação de proteínas. Também descrevemos a modulação do sistema glioxalase como alvo terapêutico para retardar o desenvolvimento de doenças relacionadas à idade e resumimos a literatura que descreve o conhecimento atual sobre compostos nutricionais com propriedades para modular o sistema glioxalase.

Palavras-chave:estresse de glicação; sistema de glioxalase; envelhecimento; proteotoxicidade

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1. Introdução: Estresse Glicativo e Envelhecimento Insalubre

Um crescente corpo de literatura indica que o acúmulo de proteínas danificadas é uma característica específica do envelhecimento e de muitas doenças relacionadas à idade, incluindo diabetes tipo 2, câncer, doenças neurodegenerativas, cardiovasculares e relacionadas aos olhos [1-7]. As proteínas aberrantes prejudicam a homeostase celular formando agregados não funcionais e tóxicos e isso leva à inativação não apenas da proteína aberrante, mas também pode prejudicar a função de outras proteínas essenciais devido ao estresse ou insuficiência da maquinaria de controle de qualidade da proteína na célula. Um mecanismo proeminente que leva a moléculas aberrantes é uma modificação por produtos finais de glicação avançada (AGEs).

Os compostos dicarbonílicos são gerados

de diferentes vias metabólicas (Figura 1) que envolvem o metabolismo de açúcar e carboidratos na dieta para formar AGEs. Esses compostos dicarbonílicos interagem com biomoléculas, como proteínas, lipídios e ácidos nucleicos em uma modificação pós-traducional não enzimática chamada glicação. Os principais agentes dicarbonílicos glicantes são metilglioxal (MG), glioxal ou 3-desoxiglucosona [8]. Esses dicarbonils são mantidos em níveis baixos em condições homeostáticas, mas o processo de envelhecimento aumenta esses reagentes de glicação a níveis patológicos, aumentando a formação de AGEs tóxicos e, em última análise, comprometendo a aptidão dos tecidos. Dado que a formação de AGEs é dependente da concentração de glicose, o consumo de dietas com alto índice glicêmico ou condições diabéticas leva a um acúmulo sistêmico dramático de AGEs. Isso se correlaciona diretamente com o metabolismo alterado, o aumento da inflamação e a progressão de condições médicas graves. Por outro lado, a ingestão de dietas de baixo índice glicêmico limita o acúmulo de AGEs e está associada à progressão mais lenta de algumas dessas doenças [9-13]. Nesse contexto, a hiperglicemia impõe estresse adicional na produção de proteínas glicadas associada à idade e exacerba as consequências prejudiciais dos depósitos de AGEs na função do órgão.

Figura 1. Diagrama esquemático das vias de formação e desintoxicação de -dicarbonilas contra danos derivados de AGEs no envelhecimento. A formação de -dicarbonils altamente reativos, como o metilglioxal(MG), ocorre através da degradação não enzimática dos intermediários glicolíticos, incluindo diidroxiacetona fosfato e gliceraldeído 3-fosfato e outras fontes, incluindo metabolismo de aminoácidos e lipídios. Para evitar danos aos AGEs, o sistema glioxalase é um mecanismo primário que limita a síntese de AGEs, convertendo biomoléculas altamente reativas, como MG, em biomoléculas menos reativas (D-lactato). Este processo envolve a atividade sequencial de duas enzimas GLO1 e GLO2 e a forma reduzida de glutationa (GSH). Outros mecanismos de desintoxicação implicam a atividade de DJ-1, aldeído desidrogenases (ALDHs), Aldo-ceto redutases (AKRs) e enzimas de degradação de acetoacetato. Uma vez formados, os AGEs podem ser eliminados por duas vias proteolíticas: o sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) e a autofagia. Esses mecanismos de proteção (destacados em verde) diminuem com o envelhecimento e contribuem para o aparecimento de doenças relacionadas à idade, como neurodegeneração, doenças relacionadas aos olhos (DMRI, catarata, RD), nefropatias, síndrome metabólica e câncer. GLO1:glioxalase 1; GLO2:glioxalase 2; GSH: glutationa.

Cistanche pode anti-envelhecimento

O estresse de glicação excessivo promove a insolubilidade das proteínas, desregulando as vias de sinalização e controle de qualidade das proteínas. Alterações derivadas de AGEs nas vias de sinalização de perturbação do proteoma na fisiologia do tecido (vias MAP/ERK, JAK-STAT e PI3K-AKT) que levam à translocação nuclear de fatores de transcrição envolvidos em múltiplas funções celulares, incluindo inflamação, apoptose, estresse de ER , autofagia, estresse oxidativo, função mitocondrial, etc. (revisado em [2,14]). As proteínas glicadas também podem sobrecarregar ou limitar a funcionalidade das capacidades proteolíticas. Essas mudanças acabam por contribuir para o aparecimento de vários distúrbios relacionados à idade.

Vários estudos demonstraram que a formação de MG e AGEs derivados de MG é um fator importante na patogênese do diabetes e suas complicações, como retinopatia, nefropatia e neuropatia [15-19]. O estresse por dicarbonil também é um mediador que contribui para a obesidade e doenças cardiovasculares [20,21]. A MG pode contribuir para a aterosclerose através de vários mecanismos, incluindo o acúmulo de AGEs derivados de MG em placas ateroscleróticas [22] e glicação de lipoproteína de baixa densidade induzida por MG [23]. A associação entre MG e hipertensão também foi observada em vários estudos, mostrando níveis aumentados de MG na aorta e nos tecidos renais [24,25]. Vários estudos também confirmaram que o acúmulo de AGEs está correlacionado com muitos distúrbios neurodegenerativos, afetando assim a função cerebral, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e esquizofrenia [26-28]. Um dos melhores exemplos da relação entre o acúmulo de AGE e as consequências relacionadas ao envelhecimento ocorre nos tecidos oculares, resultando em distúrbios do tecido ocular induzidos pela glicação, como catarata, degeneração macular relacionada à idade (DMRI) e retinopatia diabética (RD)[{ {15}}]. Em relação à catarata, a principal causa de cegueira em todo o mundo, as cristalinas do cristalino tornam-se progressivamente pigmentadas de amarelo-marrom com a idade, como resultado do acúmulo de subprodutos de AGEs [31]. Assim como o cristalino, os AGEs da retina aumentam com a idade e o diabetes, especialmente na retina externa. A AMD é a principal causa de cegueira em indivíduos mais velhos em países desenvolvidos. Níveis mais altos de AGE são encontrados em pacientes com AMD em comparação com indivíduos de controle, bem como em modelos de camundongos com AMD [32-36]. A RD é caracterizada pelo acúmulo de AGEs na retina, induzindo danos microvasculares [37].fração de flavonóides purificada micronizada 1000 mg usaEssas alterações patológicas resultam em danos irreversíveis à barreira hematorretiniana e edema macular, resultando em perda de visão. Em resumo, os AGEs se acumulam por todo o corpo com o envelhecimento, particularmente em pacientes diabéticos. Isso compromete a homeostase do organismo e contribui para o aparecimento e progresso de uma infinidade de doenças relacionadas à idade.

Existem vários sistemas para desintoxicar AGEs. Entre eles, o sistema glioxalase, o mecanismo mais bem caracterizado para inibir a formação de AGEs, e uma das vias capazes de desintoxicar intermediários da glicação. No entanto, as capacidades anti-AGEs diminuem com a idade, levando ao acúmulo acelerado de AGEs em tecidos normais mais velhos. Embora existam diferentes mecanismos de defesa para limitar o acúmulo de AGEs nos tecidos, desenvolvê-los para prevenir o acúmulo de AGEs e patologias associadas ainda não estão sendo explorados [38]. o sistema glioxalase para reduzir o acúmulo desses subprodutos tóxicos nas células e tecidos. Por fim, discutimos a utilidade das intervenções nutricionais para impulsionar o sistema glioxalase como estratégia antienvelhecimento.

2. Mecanismos de desintoxicação contra o estresse glicativo: papel principal do sistema de glioxalase

Múltiplos mecanismos de desintoxicação contra o acúmulo de AGEs foram relatados. A Figura 1 é uma visão geral esquemática da formação de -dicarbonil e as diferentes rotas de desintoxicação contra danos derivados de AGEs no envelhecimento. As principais vias de síntese de AGEs envolvem a reação de dicarbonils reativos derivados principalmente do metabolismo da glicose com aminas primárias (N-terminal ou cadeia lateral de lisina) ou o grupo guanidina da cadeia lateral de arginina [39]. A formação de -dicarbonils altamente reativos, como o MG, ocorre através do metabolismo de intermediários glicolíticos, como diidroxiacetona fosfato e gliceraldeído 3-fosfato, e outras fontes, incluindo metabolismo de aminoácidos e lipídios.

Os AGEs são irreversíveis e, uma vez formados, só podem ser eliminados por vias proteolíticas [5,9,40,41]. Duas grandes capacidades proteolíticas são sugeridas para contribuir para a depuração de AGEs: o sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) e o sistema proteolítico lisossomal autofágico (ALPS)[5,9,40,41](Figura 1). O UPS opera principalmente em proteínas solúveis mal dobradas. No UPS, os substratos são reconhecidos e marcados com ubiquitina e direcionados ao proteassoma para degradação. O ALPS consiste no direcionamento da carga para o compartimento lisossomal para degradação. A carga autofágica pode ser diversa, incluindo proteínas insolúveis, agregados proteicos e até organelas inteiras. Ambas as vias proteolíticas são funcionalmente cooperativas e a literatura crescente suporta a conversa cruzada entre as duas vias com interações diretas e indiretas recíprocas[42-46]. Este crosstalk garante um mecanismo de backup e, no caso da deficiência de uma das vias, a outra via proteolítica tende a compensar para manter um proteoma adequado e funcional [47].

Mudanças relacionadas à idade nas taxas de degradação de proteínas foram documentadas para muitos tecidos há mais de 3 décadas, mesmo antes da caracterização molecular das vias proteolíticas ser definida [48]. Atualmente, o declínio molecular e celular das duas principais vias proteolíticas com a idade é mais bem compreendido e existem diferenças nos graus de diminuição entre o UPS e os sistemas lisossômicos. Muitos relatórios mostraram um declínio dependente do tecido no UPS, enquanto o declínio autofágico parece ser universal (revisado em [49-51). Em relação à autofagia, tanto os compartimentos lisossômicos quanto os autofagossômicos sofrem modificações marcantes. As alterações que contribuem para o mau funcionamento da autofagia incluem uma diminuição da estabilidade lisossomal, atividade da hidrolase, acúmulo de material indigerível (lipofuscina) no lúmen lisossomal, pH lisossomal disfuncional, diminuição do nível transcricional de proteínas relacionadas à autofagia, diminuição da estabilidade das proteínas mediadas por chaperonas. receptor de autofagia LAMP2A na membrana lisossomal e diminuição da associação de proteínas motoras nos compartimentos autofágicos ([49,51,52]). Em contraste com a autofagia, agora é aceito que as mudanças nas habilidades proteolíticas do proteassoma com a idade parecem ser mais qualitativas do que quantitativas.oteflavonóideMudanças na composição das atividades catalíticas do núcleo do proteassoma e subunidades moduladoras, diminuição da expressão do proteassoma, bem como mudanças no estado de oxidação das subunidades do proteassoma e substratos do proteassoma, contribuem para a inibição relacionada à idade da capacidade do UPS (revisado em [53] ,54). Em alguns casos, pode haver apenas a capacidade insuficiente dos sistemas proteolíticos para lidar com a carga. Infelizmente, a eficácia desses dois mecanismos diminui com a idade, resultando na capacidade insuficiente de reconhecer e remover proteínas danificadas e, portanto, no acúmulo intracelular de agregados proteicos e organelas disfuncionais [55,56]. Os níveis líquidos de AGEs são determinados pelo equilíbrio da taxa de síntese ou formação e taxa de remoção. A consequência imediata do declínio da capacidade proteolítica é o acúmulo de proteínas de vida longa em organismos envelhecidos, muitas das quais acumulam danos derivados da glicação em suas sequências de aminoácidos. O acúmulo de AGEs ocorre de maneira dependente e relacionada à idade ([4,9]) e uma análise proteômica recente na pesquisa do envelhecimento revelou que a biologia dos AGEs contém uma via metabólica enriquecida associada a proteomas associados à idade [57].

Embora UPS e ALPS diminuam com a idade, existem diferentes vias de proteção com capacidade de reduzir a síntese de AGEs. Nesta revisão, focamos nesses mecanismos protetores que limitam a biogênese dos AGEs, com ênfase especial no sistema da glioxalase, a principal via para desintoxicação de dicarbonils reativos [58]. Nesta seção, descreveremos o sistema de glioxalase em detalhes. Também descrevemos brevemente outros mecanismos na desintoxicação de AGEs: proteína DJ associada a Parkinson-1, aldeído desidrogenases (ALDHs), aldo-ceto redutases (AKRs) e degradação de acetoacetato.

2.1.Sistema Glioxalase: A principal rota de desintoxicação para dicarbonilas de reação

Uma vasta literatura apoia o sistema de glioxalase como a principal via de desintoxicação para dicarbonils reativos no citosol de todas as células de mamíferos [58]. O sistema da glioxalase é a via mais bem caracterizada para o metabolismo do MG. Os genes para glioxalases são conservados evolutivamente e amplamente distribuídos em vários sistemas vivos, como humanos, plantas, leveduras, bactérias, fungos e protistas. A presença em diversos táxons aponta a alta importância das enzimas glioxalase na função fisiológica da vida biológica. As atividades combinadas das glioxalases 1 e 2 (GLO1, GLO2) catalisam a conversão de -oxoaldeídos acíclicos reativos nos -hidroxiácidos correspondentes [58]. Essas reações também requerem GSH catalítico. Na etapa inicial, GLO1 converte seu substrato, hemitioacetal, formado por uma reação espontânea do aldeído do dicarbonil MG e GSH, em trono de SD-lactoilglu. Em seguida, GLO2 hidrolisa SD-lactoilglu tationa em D-lactato e reforma GSH (Figura 1).puritanos vitamina cA atividade de GLO1 é diretamente proporcional à concentração de GSH. A atividade de GLO1 diminui quando o GSH é removido, como no estresse oxidativo quando o GSH é convertido em GSSG [59].

A MG é formada durante a glicólise e a gliconeogênese pela degradação de diidroxiacetona fosfato e gliceraldeído 3-fosfato, bem como pelo catabolismo da treonina, oxidação de corpos cetônicos e degradação de proteínas glicadas. Outros substratos, incluindo glioxal, fenilglioxal e hidroxipiru aldeído, também são metabolizados por essa via. GLO1, a enzima limitante da taxa no sistema de glioxalase, catalisa a etapa primária de desintoxicação [61], assim a alteração da proteína GLO1 está envolvida em muitos processos patológicos no envelhecimento, como diabetes, doenças neurodegenerativas, câncer e doenças oculares. doenças [20.

A regulação da expressão e atividade de GLO1 é complexa e ainda não bem compreendida (Figura 2). A sequência do promotor GLO1 contém um elemento de resposta ao metal (MRE), um elemento de resposta à insulina (IRE), uma isoforma do 2-fator de gene precoce (E2F) e uma proteína 2 de ligação ao intensificador de ativação (AP{{10 }} ), e um elemento de resposta antioxidante (ARE). A função do IRE e MRE foi confirmada em ensaios repórter onde o tratamento com insulina e cloreto de zinco produziu um aumento da resposta transcricional 62]. Atividades funcionais semelhantes foram observadas para E2F e AP-2 [63,64]. O ARE localizado no exon 1 de Glo1 serve para unir Glo1 ao sistema transcricional responsivo ao estresse do fator nuclear eritróide 2-relacionado ao fator 2(NRF2) [65]. Vários genes relacionados ao metabolismo do MG e à proteção contra o estresse oxidativo estão sob o controle da via NRF2-ARE [66]. NRF2 é complexado com KEAP1, uma proteína adaptadora de substrato para o complexo E2 ubiquitina ligase dependente de culina, direcionando NRF2 para degradação pelo proteassoma 26S em condições fisiológicas. O estresse oxidativo leva à desestabilização desse complexo, causando a translocação de NRF2 para o núcleo e desencadeando a regulação positiva de genes antioxidantes [67,68]. A ligação de NRF2 ao Glo{37}}ARE aumenta a expressão basal e induzível de GLO1.[65]. NRF2 e respostas antioxidantes também são reguladas positivamente quando MG causa a dimerização de KEAP liberando Nrf2 [69].

Vários estudos mostram que o NRF2 aumenta a atividade do GLO1 e alivia o estresse intracelular do MG; assim, a modulação de GLO1 por agonistas de NRF2 resultou em uma diminuição em MG e adutos de proteínas derivadas de MG em células e tecidos [70-73]. Além disso, o mRNA e a proteína de Glol hepático, cerebral, cardíaco, renal e pulmonar foram reduzidos em camundongos knockout para NRF2 [65]. Ao todo, esses relatórios sugerem que GLO1 é um alvo a jusante pelo qual a via NRF2/KEAP1 desempenha suas funções protetoras, diminuindo o estresse de MG e dicarbonil. No entanto, a ativação inflamatória do NF-kB (fator nuclear kB) com NRF2 diminui a expressão de Glol [74]. A expressão do brilho também é regulada negativamente pelo HIFl (fator l induzível pela hipóxia) sob condições hipóxicas, um importante condutor fisiológico do estresse dicarbonílico [75].

Junto com a regulação transcricional, há também regulação pós-traducional da proteína GLO1 (Figura 2). GLO1 é acetilado pela sirtuína citosólica-2[76,77], e sua expressão pode ser diminuída pela ativação de RAGE (receptor para produtos finais de glicação avançada); no entanto, esses mecanismos não são claramente compreendidos [78].sistanchUm estudo recente mostrou que a proteína GLO1 pode ser modificada pela fosforilação da treonina 107 (T107) e pela nitrosilação da cisteína 139 [79]. Neste estudo, a fosforilação de T107 pela quinase II delta dependente de calmodulina na proteína GLO1 foi relatada como um mecanismo preciso de regulação do sistema glioxalase. Especificamente, a fosforilação de GLO1 em T107 afeta a eficiência cinética de desintoxicação de MG e taxa de degradação proteassômica. Assim, seu estado alterado está associado ao desenvolvimento de doenças relacionadas à idade [79].

Figura 2. Mecanismos de regulação da glioxalase 1(GLO1). A atividade de GLO1 pode ser regulada por meio de vários mecanismos, incluindo regulação transcricional e modificações pós-traducionais. O promotor Glo1 contém vários elementos reguladores, como resposta antioxidante (ARE), elementos de resposta ao metal (MRE) e resposta à insulina (IRE) e sítios de ligação para AP-2 e E2F. Em condições normais, o O fator nuclear eritróide 2-relacionado com o fator 2 (NRF2) é complexado com KEAP1, uma proteína adaptadora de substrato para o complexo ubiquitina ligase E2 dependente de culina, direcionando NRF2 para degradação pelo sistema ubiquitina-proteassoma (UPS). O estresse oxidativo leva à desestabilização do complexo NRF2-KEAP1, causando o desprendimento de NRF2 que é translocado para o núcleo o que desencadeia a regulação positiva de diferentes genes antioxidantes. A ligação de NRF2 ao Glo1-ARE aumenta a expressão de GLO1. Sob condições de hipóxia, a expressão de Glow é inversamente regulada pelo fator 1 induzível por hipóxia (HIFlx). Diferentes modificações pós-traducionais no citosol podem afetar a estabilidade do GLO1.

2.2. Mecanismos alternativos de desintoxicação como sistemas de backup putativos para compensar a falta de atividade da glioxalase

Embora seja o principal mecanismo de desintoxicação de dicarbonils reativos no sistema de glioxalase, existem rotas alternativas com capacidade de desintoxicar dicarbonils formados durante o metabolismo do açúcar. Estes incluem ALDHs, AKRs, a proteína DJ associada a Parkinson-1 e a eliminação por acetoacetato para formar 3-hidroxi hexano-2,5-diona (3-HHD )[80]. A relevância fisiológica desses sistemas permanece incerta e tem sido questionado se essas enzimas são ou não cruciais para a desintoxicação de AGEs nos tecidos devido à alta atividade do sistema glioxalase. Eles parecem ser componentes de sistemas de backup que operam na ausência de atividade de glioxalase, embora um papel dessas vias dependente do tecido não possa ser descartado.

DJ-1, também conhecida como proteína 7 da doença de Parkinson (PARK7), desempenha um papel essencial na doença de Parkinson (DP). A falta de proteína DJ-1 funcional demonstrou causar DP autossômica recessiva [81,82]. DJ-1 foi relatado como tendo duas atividades diferentes: (1) atividade de glioxalase in vitro, convertendo MG em lactato e prevenindo dano tecidual induzido por MG em Caenorhabditis elegans [83], e (2) atividade de deglicase in vitro, reduzindo subprodutos de MG em estágio inicial [84]. Recentemente, outros estudos também mostraram que DJ-1 desempenha um papel relevante na DNA deglicase [85-87].o que é cistacheA capacidade desintoxicante de DJ-1 na ausência de glutationa (GSH) torna esta uma rota alternativa para o sistema de glioxalase, que requer a presença de GSH. No entanto, Pfaff et al.usando knockdowns DJ-1 em células de Drosophila e knockout DJ-1 em todo o organismo não observaram diferenças no acúmulo de adutos de proteína MG [88].

AKRs são uma superfamília de proteínas capazes de reduzir aldeídos e cetonas em álcoois primários e secundários. AKRs metabolizam MG em hidroxiacetona ou lactaldeído. Alguns estudos mostraram que a expressão transgênica de Aldo-ceto redutases humanas e de camundongo em células de fibroblastos de roedores protege contra danos induzidos por MG, sugerindo que AKRs podem participar da desintoxicação de MG e uma redução nos níveis de AGEs [89-91]. Alta atividade de AKR1B3 foi detectada em células de Schwann de camundongos nocaute Glo1, bem como um aumento da expressão durante a exposição a MG, sugerindo que poderia ser um mecanismo compensatório induzido pela falta do sistema de glioxalase ou estresse de glicação excessivo [92]. Curiosamente, a falta de AKR1B3 resultou em níveis mais altos de MG e AGEs no coração de camundongos diabéticos [91].

Os LEDs são outro grupo de enzimas metabolizadoras de -dicarbonil que oxidam MG a piruvato. A expressão de ALDH foi aumentada em células de Schwann de tipo selvagem de camundongo após tratamento com MG [92]. Em um modelo de peixe-zebra, peixes knockout glo1 mostraram que a atividade de ALDH induzida compensa a falta de GLO1 [93]. No entanto, pelo menos em camundongos, os mecanismos compensatórios são dependentes do tecido, pois o aumento da expressão de AKRs e ALDHs foi observado no tecido hepático, mas apenas AKRs foram relatados nos rins em camundongos knockout para Glo1 [94]. Em estudos em humanos, o metabólito 3-DG produzido pela atividade da aldeído desidrogenase 1A1(ALDH1A1) foi aumentado no plasma e eritrócitos de pacientes diabéticos [92]. Recentemente, também foi demonstrado que o acetoacetato de corpos cetônicos reduziu a concentração de MG por uma reação não enzimática durante a cetose diabética e dietética [95,96]. Eles descobriram que essa rota metabólica envolve uma reação aldol não enzimática entre o MG e o acetoacetato do corpo cetônico, levando a 3-hidroxi-hexano-2,5-diona, que está presente no sangue de pacientes famintos por insulina. Vias alternativas que podem compensar a deficiência do sistema de glioxalase podem gerar moléculas tóxicas, como y-dicetonas, que estão associadas à degeneração axonal periférica e lesão testicular [97,98].

Embora não haja uma análise sistemática do envelhecimento de proteínas envolvidas em vias alternativas independentes de GLO1-, foram relatadas alterações relacionadas à idade nesses atores moleculares. Por exemplo, há uma correlação entre os níveis de expressão de D]-1 e estresse oxidativo, e diferentes relatos mostraram um aumento de DJ-1 com a idade. Os níveis de mRNA e proteína DJ-1 aumentaram de 8 a 20 semanas de idade em camundongos [99] e os níveis de DJ-1 aumentaram significativamente em função da idade no líquido cefalorraquidiano humano [100]. Nos tecidos oculares, foi demonstrado que o DJ{10}} é expresso no epitélio pigmentar da retina e fotorreceptores e a expressão aumenta em olhos velhos [101]. Pode refletir um mecanismo compensatório devido ao declínio na atividade do sistema glioxalase.

2.3. Atividade Dependente de Tecido do Sistema Glioxalase

Embora a GLO1 seja uma proteína ubíqua, os níveis desta enzima são regulados de forma dependente do tecido. A fim de avaliar o papel do sistema glioxalase em diferentes tecidos, examinamos a expressão e atividade de GLO1 em tecidos não oculares (fígado, cérebro, coração e rim) e oculares (retina, EPR/coróide e cristalino) de camundongos C57BL/6 de tipo selvagem. Usando anticorpos que reconhecem especificamente GLO1, Western blotting e imuno-histoquímica foram realizados para quantificar os níveis de proteína. A atividade de GLO1 em extratos citosólicos foi determinada espectrofotometricamente como a taxa inicial de formação de SD-lactoilglutationa, conforme relatado anteriormente [30,102]. Esses resultados estão resumidos na Figura 3.

Figura 3. Uma análise comparativa da proteína GLO1 e atividade em tecidos oculares e não oculares. (A) A atividade de GLO1 foi testada em tecidos não oculares e tecidos da retina de camundongos WT como descrito anteriormente [29] e a atividade foi expressa como uma porcentagem (por cento) em comparação com o fígado. (B) Análise de Western blot representativa de fígado e (C) retina de camundongos transgênicos de superexpressão WT e Glow (Glo1 Tg plus / plus) usando um anticorpo monoclonal (não comercial) e anticorpo policlonal para Glol (comercial, GeneTex) [36,103,104]. (D)Análise de Western blot representativa de extratos de tecido não ocular (50ug) de camundongos WT usando um anticorpo monoclonal para Glo1 (não comercial) e (E) quantificação de proteína de GLO1 normalizada para controle de carga (coloração de Ponceau). (F) A atividade de GLO1 foi realizada em tecidos oculares (Retina, RPE/Coróide e Lente) de camundongos WT como descrito anteriormente [29] e a atividade foi expressa em miliunidades por miligrama de proteína. Os valores são média ± SEM. O tamanho da amostra é n=4da proteína GLO1 e ensaios de atividade.

Dados publicados anteriormente indicaram que a retina e o fígado exibem a maior atividade de GLO1 ([30]; Figura 3A). Observe que a atividade da retina foi o valor mais alto, enquanto o fígado, rim, cérebro e coração representaram apenas 46%, 27%, 22% e 11% da capacidade desintoxicante da retina, respectivamente. Avaliamos se a atividade de GLO1 se correlacionava com o nível da enzima pela avaliação dos níveis de proteína GLO1 por Western blotting. O anticorpo contra GLO1 foi previamente validado em relatórios anteriores e usado para a análise de GLO1 em amostras de retina [36,103,104]. Como controle positivo, uma análise comparativa também foi realizada em tecidos de retina e fígado de camundongos transgênicos que superexpressam GLO1 em fundo C57BL/6J (B6) [105]. Para examinar os níveis de GLO1, usamos dois anticorpos diferentes: um anticorpo policlonal de coelho (anticorpo comercial da GeneTex) e um anticorpo monoclonal de camundongo (anticorpo não comercial) relatado em diferentes modelos animais para o estudo da biologia de GLO1 [103,106]. Fomos capazes de detectar a proteína GLO1 em tecidos de tipo selvagem de fígado e retina por Western blotting, e encontramos a expressão mais alta em camundongos transgênicos em ambos os tecidos (Figura 3B, C e Figura Suplementar S1). Duas bandas foram reconhecidas para ambos os anticorpos. Os perfis eletroforéticos diferenciais desses GLO1-positivos sugerem que as mudanças pós-transcricionais podem ser vitais no papel da proteína. Assim, um estudo recente indicou que o GLO1 fosforilado é mais eficiente e mais estável, apoiando essas alterações pós-transcricionais como um mecanismo preciso que regula a atividade do GLO1 [79]. No entanto, há poucas informações sobre como as modificações pós-transcricionais modulam a atividade da glioxalase 1.

As expected, we found GLO1 protein in all non-ocular tissues analyzed, with the liver showing the highest expression. The relative order of GLO1 expression was liver>kidney>brain>coração (Figura 3D, E). Isso corrobora os resultados de um estudo anterior[30]. Há informações limitadas sobre o papel do GLO1 nos tecidos oculares. Como relatamos anteriormente, o ensaio enzimático revelou que a atividade de GLO1 é ~ 10 vezes maior na retina em comparação com a lente ou EPR/coróide (Figura 3F, [30]). A superexpressão de glioxalase I melhora a sobrevivência do pericito da retina humana sob condições hiperglicêmicas [107] e um bloqueador do receptor de angiotensina que restaura GLO1 em ratos diabéticos mostrou reduzir os capilares acelulares da retina [18]. Além disso, a falta de GLO1 no peixe-zebra afeta a arquitetura dos vasos da retina adulta, embora o aumento da formação de brotos angiogênicos seja observado apenas em peixes-zebra glo{11}}/superalimentados, mas não em alimentação normal [93].

A retina é um tecido altamente complexo e muito dinâmico com diversos tipos de células (Figura 4A). O fluxo sanguíneo e a consequente exposição a xenobióticos e outros estressores estão entre os mais altos do corpo. Todas as manhãs, 10% das pontas externas dos fotorreceptores da retina são eliminadas e devem ser removidas pelas células epiteliais pigmentadas da retina adjacentes. Realizamos análise imuno-histoquímica para caracterizar pela primeira vez as diferenças espaciais de GLO1 na retina. A proteína GLO1 estava presente em todos os tipos de células dentro da retina, com altos níveis dentro dos corpos celulares da camada nuclear interna e da camada de células ganglionares. Corpos celulares fotorreceptores na camada nuclear externa tinham níveis mais baixos. Nos fotorreceptores, a maioria das proteínas GLO1 foi encontrada nos segmentos interno e externo. O RPE também apresentou altos níveis de proteína GLO1, enquanto a coróide e a esclera apresentaram menor quantidade de proteína GLO1 (Figura 4B, C).

Figura 4. Imuno-histoquímica de GLO1 em tecidos retinianos de camundongos. (A) Esquema celular em corte transversal da retina ilustrando suas três camadas primárias compostas pela camada de células ganglionares (GCL), contendo células ganglionares da retina (RGC), camada nuclear interna (INL), hospedando interneurônios de amácrino, bipolar e horizontal células gliais de Müller e a camada nuclear externa (ONL), abrigando fotorreceptores de bastonetes e cones. O tecido sensorial, ou neurorretina, está conectado ao epitélio pigmentado da retina (EPR). As setas vermelhas indicavam a camada RPE. (B) Imagem representativa de imunocoloração GLO1 em amostras de retina de camundongos WT. (C) Fluorescência de intensidade média de GLO1 normalizada para o valor no RPE. Os dados apresentados são média ± erro padrão das médias (SEM). Nossos resultados na retina são relevantes porque a retina é um tecido pós-mitótico altamente diferenciado, onde o dano derivado da glicação não pode ser reduzido pela divisão celular [5,9]. Além disso, alterações no GLO1 foram associadas a danos na retina [108]. Cenário semelhante pode ocorrer em outros tecidos compostos por células com baixa capacidade de regeneração, como o sistema nervoso central, onde a grande maioria dos neurônios é pós-mitótica. A avaliação dos níveis de GLO1 juntamente com marcadores celulares específicos pode nos permitir avaliar a variação célula a célula dentro de um determinado tecido. Nossos resultados sugerem que o alto nível de proteína e atividade GLO1 da retina pode desempenhar um importante papel protetor contra danos derivados de AGE com a idade.

Este artigo foi extraído de Cells 2021, 10, 1852. https://doi.org/10.3390/cells10081852 https://www.mdpi.com/journal/cells